基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)揭示血府逐瘀口服液抗血栓的活性成分和作用機制

摘要：為揭示血府逐瘀口服液治療血栓類疾病的機理，挖掘血府逐瘀口服液中抗血栓有效成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索血府逐瘀口服液中的化學(xué)成分或成分靶點；利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)得到核心靶點；通過Cytoscape構(gòu)建“成分－靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，并進行拓撲分析和對核心靶點進行GO和KEGG富集分析，預(yù)測血府逐瘀口服液抗血栓的作用機制；根據(jù)Degree值排名將關(guān)鍵的成分和作用靶點進行分子對接。通過網(wǎng)絡(luò)拓撲分析篩選得到81個核心靶點，如TNF、ALB、AKT1等；GO富集分析中生物過程（BP）共304條，分子功能（MF）共72條，細胞組成（CC）共41條，通路富集得到凝血級聯(lián)反應(yīng)、TNF等80條信號通路；分子對接結(jié)果顯示，Sainfuran、Xambioona和7-Methoxy-2-methyl isoflavone與靶點蛋白ESR1、F2、IL-2、KDR、MET、MMP3均有較好的親和力。該研究為血府逐瘀口服液在抗血栓應(yīng)用方面提供參考。

關(guān)鍵詞：血府逐瘀口服液；抗血栓藥物；血栓；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；作用機制

中圖分類號：R285"" 文獻標志碼：A"" 文章編號：1002-4026（2024）04-0026-08

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標志碼（OSID）：

Study of the active components and mechanism of action of antithrombotic

Xuefuzhuyu oral liquid based on network pharmacology and

molecular docking technology

LIN Shenghua1a，XUE Chang2，MA honglin1a，F(xiàn)AN Wei1a，SHEN Chuanlin1a，CHEN Jiayu1a，SUN Botong1b，

DU Xingshuo1a， ZHAN Wen1a，LI Xiaobing1a， ZHANG Shanshan1a， JIN Meng1a， HE Qiuxia1a，1b

（1.a.Engineering Research Center of Zebrafish Model for Human Diseases and Drug Screening of Shandong Province， Biology Institute;

b.Science and Technology Service Platform， Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250014， China;

2.Department of Biological Sciences， Xi’an Jiaotong-Liverpool University， Suzhou 215028， China）

Abstract∶The aim of this study is to reveal the mechanism of Xuefuzhuyu oral liquid in treating thrombotic diseases and to explore its effective antithrombotic active ingredients . The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology database was used to search for the active ingredients or related components of Xuefuzhuyu oral liquid. A protein-protein interaction network was constructed using the STRING database to obtain the core targets. A “component-target”network diagram was constructured using Cytoscape， which was used to perform topological，GO and KEGG enrichment analyses on core components to predict the antithrombotic mechanism action. Molecular docking was conducted on the key components and action targets according to the degree ranking. 81 core components， such as tumor necrosis factor （TNF）， ALB， and AKT1 were obtained via network topology analysis screening.A total of 304 biological processes （BPs）， 72 molecular functions， and 41 cell components were analyzed using GO enrichment analysis， and pathway enrichment yielded 80 signaling pathways， such as the coagulation cascade responseand TNF pathway.Molecular docking results showed that Sainfuran， Xambioona， and 7-methoxy-2-methyl isoflavone have good affinity with target proteins ESR1， F2， IL-2， KDR， MET， and MMP3. This study provides a reference for the application of Xuefuzhuyu oral liquid in antithrombotic therapies.

Key words∶Xuefuzhuyu oral liquid; antithromboticagent; thrombus; network pharmacology; molecular docking; mechanism of action

血栓及其導(dǎo)致的各類心腦血管疾病嚴重危害人體健康，其中靜脈血栓栓塞是導(dǎo)致死亡的重要因素［1］。血栓（thrombostic）是在靜脈或動脈血管中形成血凝塊從而限制了血液流動的一種病理過程。血管中血液的正常流動依賴血漿蛋白、凝血因子、炎癥因子、細胞因子及血管內(nèi)皮等因素之間的動態(tài)平衡，若該穩(wěn)態(tài)失衡，形成血栓的機率將顯著增加［2］。在醫(yī)學(xué)上，西醫(yī)血栓治療方法可以分為藥物治療和手術(shù)治療兩大類。維生素K拮抗劑華法林、肝素等應(yīng)用于抗凝；尿激酶、替奈普酶（TNK-IPA）等用于溶栓；此外還有手術(shù)、機械清除術(shù)或置入靜脈濾器等方法清除血栓［3］。但是這些抗血栓療法受到較多禁忌癥的限制并存在并發(fā)癥的風(fēng)險。中草藥作用溫和、副作用較少，因此對抗血栓相關(guān)中草藥與方劑的研究具有重要意義［4］。

血府逐瘀口服液采用清代王清任所創(chuàng)的經(jīng)典活血化瘀方，由桃仁、紅花、柴胡、牛膝、赤芍、甘草、當歸、枳殼、桔梗、川芎、地黃十一味中藥材組成，具有活血化瘀、行氣止痛的功效，在臨床治療中對腦梗死、冠心病、心肌梗死等血栓類疾病具有顯著療效［5］。其中桃仁活血化淤的功效最強，為方中君藥，當歸、牛膝、赤芍、川芎、紅花五藥相合，共同加強桃仁活血化瘀的功效，為方中的臣藥。紅花具有抑制血栓素A2合成，促進前列環(huán)素合成，降低血漿纖溶酶原激活物抑制因子活性的作用［6］；赤芍能有效延長血栓的形成時間，減輕血栓重量，抑制血液凝結(jié)［7］；川芎具有活血化瘀的作用，其中川芎嗪可以抑制血小板凝集，降低血液黏稠［8］；牛膝總苷可降低血小板黏附率，改變血瘀模型大鼠的血液流變特性，具有顯著的抗血栓作用［9］。

血府逐瘀口服液體現(xiàn)了中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、協(xié)同作用的特點［10］。中藥復(fù)方盡管在治療復(fù)雜疾病方面具有顯著療效，但是其具體作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)生物學(xué)理論出發(fā)，選取特定節(jié)點進行多靶點分析，強調(diào)對信號通路的多途徑調(diào)節(jié)［11］，可以從整體的角度探究藥物與疾病治療之間的關(guān)聯(lián)，構(gòu)建疾病-表型-基因-藥物多層次網(wǎng)絡(luò)［10］。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從分子水平預(yù)測血府逐瘀口服液抗血栓的有效活性成分和靶點，并結(jié)合分子對接，分析其中的有效活性成分和靶點之間的最佳結(jié)合位點，為揭示血府逐瘀口服液治療血栓類疾病的機理提供有益探索。

1 方法

1.1 血府逐瘀口服液有效化學(xué)成分及作用靶點的獲取

利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）檢索血府逐瘀口服液中各藥材（桃仁、紅花、柴胡、牛膝、赤芍、甘草、當歸、枳殼、桔梗、川芎、地黃）的化學(xué)成分，再以口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%和類藥性（drug-likeness， DL）≥0.18為標準篩選有效成分及其作用靶點，并通過Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索出活性成分對應(yīng)的Canonical SMILES和化學(xué)結(jié)構(gòu)式；分別導(dǎo)入Swiss target prediction和PharmMapper數(shù)據(jù)庫，獲取對應(yīng)成分的作用靶點；利用Uniport數(shù)據(jù)庫將靶點轉(zhuǎn)化成人源物種標準基因名稱（Gene symbol），去重得到血府逐瘀口服液活性成分的作用靶點。

1.2 血栓作用靶點的收集

以“thrombosis”為關(guān)鍵詞分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、大寫數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中進行檢索，將結(jié)果集合去重獲得451個疾病相關(guān)靶點。

1.3 血府逐瘀口服液潛在基因作用靶點的篩選

將血府逐瘀口服液活性成分作用靶點和血栓作用靶點繪制維恩圖，交集即為血府逐瘀口服液和血栓的共同靶點，即藥物抗血栓的潛在基因作用靶點。

1.4 構(gòu)建蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

在STRING數(shù)據(jù)庫中輸入獲取的交集靶點基因，物種設(shè)定為“人類”，最小相互作用閾值調(diào)整為0.4，構(gòu)建蛋白－蛋白相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中，對蛋白靶點網(wǎng)絡(luò)進行拓撲參數(shù)分析，計算節(jié)點度值（Degree），篩選出核心靶點。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

在DAVID數(shù)據(jù)庫中輸入核心靶點，物種設(shè)置為“人類”，對其分別進行生物過程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）和細胞成分（cellular component， CC）的GO富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）生物通路富集分析。

1.6 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

將核心靶點、核心靶點映射出的活性成分、KEGG通路分析的前20條信號通路信息導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中，構(gòu)建成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)圖并進拓撲分析。

1.7 分子對接

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析中Degree值排名前6的靶點與排名前3的活性成分進行分子對接驗證。分別在Pubchem數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫中獲取配體和受體的3D結(jié)構(gòu)，利用PyMOL軟件將受體蛋白進行去水、去配體處理，將受體蛋白利用AutoDuck Tools軟件進行加氫、計算電荷、添加蛋白質(zhì)類型等操作，最后分別利用Autogrid程序和Autodock程序先后進行兩次運算。分析結(jié)合能，將結(jié)合能≤-5 kJ/mol視為對接成功。

本文采用的所有數(shù)據(jù)庫和軟件及其網(wǎng)址和版本見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1。

2 結(jié)果

2.1 血府逐瘀口服液活性成分及靶點獲取結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18作為標準篩選出活性成分共154個（見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表2），其中桃仁22個、紅花21個、當歸2個、川芎5個、地黃1個、赤芍14個、牛膝20個、柴胡17個、枳殼5個、桔梗4個、甘草70個。在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫和PharmMapper數(shù)據(jù)庫中獲得活性成分的靶點，剔除無作用靶點后共740個。

2.2 血府逐瘀口服液抗血栓核心靶點

以“thrombosis”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、CTD數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中進行檢索，將4種數(shù)據(jù)庫查詢到的相關(guān)疾病靶點結(jié)合，去重，最終獲得451個靶點。將血府逐瘀口服液活性成分和血栓的靶點收集并作維恩圖后獲得交集靶點84個。

在STRING數(shù)據(jù)庫中把獲取的共有靶點導(dǎo)入構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，之后將靶點文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件后，對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析。Degree數(shù)值代表某一節(jié)點與其他節(jié)點相互作用的個數(shù)，其數(shù)值越大，代表該節(jié)點在生物學(xué)進程的作用越重要。得到核心靶點共81個（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表3），核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖（見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1）。其中Degree值排名前10的核心靶點為ALB、TNF、AKT1、MMP9、PLG、PTGS2、SERPINE1、STAT3、ICAM1、MMP2。

2.3 GO功能富集和KEGG通路富集結(jié)果分析

將核心靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中，物種設(shè)置為人類，進行GO功能富集和KEGG通路富集分析。其中GO分析得到生物過程（biological process， BP）共304條，分子功能（molecular function， MF）共72條，細胞組成（cell component， CC）共41條；將結(jié)果根據(jù)P值的升序排列，分別將前20條目進行可視化分析，如圖1。其中涉及到的生物學(xué)進程有血液凝固（blood coagulation）、蛋白水解（proteolysis）、磷脂酰肌醇3-激酶信號傳導(dǎo)的正調(diào)控（positive regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling）、脂多糖反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、基因表達的負調(diào)控（negative regulation of gene expression）等過程；細胞組成主要涉及細胞外間隙（extracellular space）、胞外區(qū)域（extracellular region）、細胞表面（cell surface）、絲氨酸型內(nèi)肽酶復(fù)合物（serine-type endopeptidase complex）、質(zhì)膜（plasma membrane）等；分子功能主要包括絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（serinetype endopeptidase activity）、血紅素結(jié)合（heme binding）、內(nèi)肽酶活性（endopeptidase activity）、酶結(jié)合（enzyme binding）、同一蛋白結(jié)合（identical protein binding）等。這充分說明了血府逐瘀口服液通過參與多種生物學(xué)進程來發(fā)揮細胞和分子功能，從而發(fā)揮抗血栓的活性。

KEGG通路分析共獲得80條通路信號，其中可以看出血府逐瘀口服液抗血栓參與相互的信號通路主要有PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、AGE-RAGE信號通路以及血小板活化信號通路等，這充分說明了血府逐瘀口服液是通過參與多條信號通路來發(fā)揮抗血栓作用。將前20條信號通路進行可視化分析見圖2，并且對每一條信號通路中所包含的基因進行了統(tǒng)計（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表4）。

2.4 構(gòu)建成分－靶點網(wǎng)絡(luò)圖及網(wǎng)絡(luò)圖分析

將血府逐瘀口服液中化學(xué)成分、靶點導(dǎo)入到Cytoscape 3.9.1軟件中，構(gòu)建成分－靶點網(wǎng)絡(luò)圖（見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2），共包含274個節(jié)點，5 294條邊。根據(jù)Degree值排名分析得到血府逐瘀口服液在抗血栓方面的核心成分主要有Xambioona、7-Methoxy-2-methyl isoflavone、Sainfuran、Licoagroisoflavone、icos-5-enoic acid等26種（相關(guān)具體信息見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表5）。

2.5 分子對接結(jié)果

根據(jù)Degree值排名前6的靶點和排名前3的活性成分進行分子對接驗證，6種靶點和3種成分兩兩對接所需要的結(jié)合能見表1。根據(jù)表1可以發(fā)現(xiàn)只有Sainfuran與ESR1結(jié)合所需要的結(jié)合能gt;-5 kJ/mol，而其他的結(jié)合能均lt;-5 kJ/mol，說明對接成功。將配體與受體對接示意圖進行展示，見圖3。

3 討論

血府逐瘀口服液是活血化瘀代表方之一，近年臨床和藥理學(xué)研究證明該方及其制劑在治療血瘀癥及相關(guān)血管疾病上具有明顯療效［12］。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析了血府逐瘀口服液可能的作用機制。通過TCMSP、PharmMapper、GeneCards等數(shù)據(jù)庫篩選出血府逐瘀口服液活性成分154個，對應(yīng)靶點740個，與疾病交集靶點84個。通過網(wǎng)絡(luò)拓撲分析可以得到血府逐瘀口服液治療血栓的核心成分有Xambioona、7-Methoxy-2-methyl isoflavone、Sainfuran、Licoagroisoflavone、Icos-5-enoic acid等共26種。

對藥物疾病共有靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析后篩選出ALB、TNF、AKT1、MMP9、PLG、PTGS2、SERPINE1、STAT3、ICAM1、MMP2等血府逐瘀口服液抗血栓的潛在關(guān)鍵靶點。ALB（albumin）是一種廣泛存在于血漿中的循環(huán)蛋白，由肝細胞合成，在體內(nèi)起到調(diào)節(jié)血漿滲透壓，轉(zhuǎn)運內(nèi)源性和外源性配體的作用［13］。TNF是一種炎癥細胞因子，促進細胞增殖、分化、細胞因子產(chǎn)生及細胞凋亡或壞死，也可以通過與IL1β和IL6協(xié)同作用促進血管生成［14］。TNF-α可以誘導(dǎo)組織因子的表達，抑制血栓調(diào)節(jié)蛋白和內(nèi)皮細胞蛋白C受體（endothelial cell protein C receptor）的表達，導(dǎo)致血液的異常凝集狀態(tài)［15］。AKT1屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT的一個亞型，調(diào)節(jié)代謝、增殖、細胞存活、細胞生長和血管生成等生物過程；在癌細胞中參與細胞的增殖和生長，促進腫瘤發(fā)生，抑制細胞凋亡［16］。MMP9是一種基質(zhì)金屬蛋白，其參與正常生理過程中細胞外基質(zhì)的降解，如血管生成、骨發(fā)育等；也可能參與多種人類惡性腫瘤及主動脈瘤等病理過程［17-21］。PLG是纖溶酶的無活性前體。纖溶酶是血漿中的一種重要酶，可以降解血栓。纖溶酶缺乏會導(dǎo)致血栓無法及時溶解，進而導(dǎo)致血栓形成［22］。PTGS是前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶，PTGS2是PTGS兩種同工酶中的誘導(dǎo)型同工酶，負責(zé)炎癥，細胞有絲分裂等過程中涉及的前列腺素生物合成［23］。SERPINE1屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，是組織纖溶酶原激活劑（tPA）的主要抑制劑，抑制纖維蛋白的溶解。高濃度的該基因產(chǎn)物與血栓形成傾向有關(guān)［24］。STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，在許多細胞過程中起到關(guān)鍵作用［25］。

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)（complement and coagulation cascades）、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signalling pathway in diabetic complications）、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）等信號通路可能參與血府逐瘀口服液抗血栓的過程。凝血級聯(lián)反應(yīng)的組分，如凝血酶、纖溶酶等可以影響補體途徑；而補體直接或間接地激活了凝血級聯(lián)反應(yīng)，還可以通過促進內(nèi)皮的生化形態(tài)變化調(diào)節(jié)血液的凝結(jié)傾向，并調(diào)節(jié)血小板的聚集特性［26］。AGE-RAGE通路被認為與炎癥，氧化應(yīng)激等密切相關(guān)［27］。抑制RAGE可以抑制促炎細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的釋放［28］；而炎癥與凝血具有密切的關(guān)系［29］。流體剪切應(yīng)力是流動血液對血管內(nèi)皮施加的摩擦力；低剪切應(yīng)力會上調(diào)促進動脈血管壁氧化和炎癥狀態(tài)的內(nèi)皮細胞（EC）基因表達，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化［30］。低密度脂蛋白（LDL）水平升高是動脈粥樣硬化的主要導(dǎo)致因素［31］。低密度脂蛋白可以在血管壁內(nèi)積累并進行氧化修飾，成為氧化低密度脂蛋白（oxLDL），從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙［32］。

本研究將Degree值排名前6的靶點和排名前3的有效成分進行分子對接，除Sainfuran與ESR1外結(jié)合能均≤-5 kJ/mol，說明血府逐瘀口服液的有效成分與疾病相關(guān)靶點結(jié)合良好。其中F2基因編碼凝血因子II，在止血和血栓形成中具有重要作用［33］。KDR是內(nèi)皮細胞中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的主要受體，通過對該基因特異性缺失小鼠的實驗表明血栓的消退依賴于KDR［34］。分子對接結(jié)果顯示血府逐瘀口服液中有效成分可以通過和血栓靶點穩(wěn)定結(jié)合起到抗血栓的作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和分子對接的方法探究血府逐瘀口服液抗血栓的有效成分與作用機制。通過對核心作用靶點和生物通路分析，發(fā)現(xiàn)血府逐瘀口服液可能是通過參與凝血、炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化等多靶點，多通路的生物過程起到抗血栓作用，這為血府逐瘀口服液臨床應(yīng)用中的療效提供了理論支持。斑馬魚作為一種發(fā)展迅速且具有吸引力的生物模型，其高通量能力和實驗操作性相結(jié)合的獨特優(yōu)勢，使其在篩選藥物活性成分的研究中發(fā)揮著重要作用。利用FeCl3誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型在中藥活性成分篩選中具有很強的適用性［35］，這對血府逐瘀口服液抗血栓活性成分預(yù)測的進一步驗證提供了思路。

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