活體共聚焦顯微鏡在不同類(lèi)型干眼檢查中的應(yīng)用進(jìn)展

【關(guān)鍵詞】干眼；活體共聚焦顯微鏡；眼表；組織細(xì)胞

干眼為多因素引起的慢性眼表疾病，是由淚液的質(zhì)、量及動(dòng)力學(xué)異常導(dǎo)致的淚膜不穩(wěn)定或眼表微環(huán)境失調(diào)，可伴有眼表炎癥反應(yīng)、組織損傷及神經(jīng)異常，造成眼部多種不適癥狀和（或）視功能異常。干眼是現(xiàn)代社會(huì)常見(jiàn)的健康問(wèn)題，全球患病率在5%～50%，我國(guó)患病率達(dá)21%～30%，明顯影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前常用的干眼檢查如角結(jié)膜染色、淚液分泌實(shí)驗(yàn)等能反映角結(jié)膜損傷狀態(tài)，但無(wú)法細(xì)化細(xì)胞組織學(xué)病變；眼表面干涉儀分析瞼板腺（meibomian gland，MG），可檢測(cè)到腺體缺失及腺管萎縮，但無(wú)法反映腺泡和局部炎癥狀態(tài)；CT及MRI可用于淚腺檢查，對(duì)其結(jié)構(gòu)以及體積測(cè)量和分析具有良好的效果，但無(wú)法反映腺泡及腺管細(xì)胞形態(tài)，且CT電離輻射強(qiáng)，MRI操作時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)影響圖像質(zhì)量，且價(jià)格較貴?；铙w共聚焦顯微鏡（in vivo confocal microscopy，IVCM）的出現(xiàn)為干眼的臨床診療提供新的思路，其作為一種非侵入輔助診斷工具，可在細(xì)胞水平上對(duì)許多眼部疾病的組織病理學(xué)進(jìn)行活體評(píng)估。在干眼領(lǐng)域，IVCM 已被廣泛應(yīng)用于角膜、結(jié)膜、瞼板腺和淚腺的檢查[2]，獲得客觀的圖像和數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)眼表變化。本文基于IVCM在干眼中的應(yīng)用研究，總結(jié)多種常見(jiàn)干眼亞型在IVCM下的病理改變，為臨床診治提供參考。

1水液缺乏型干眼

水液缺乏型干眼由水液性淚液生成不足或質(zhì)量異常而引起，其中干燥綜合征（sjgren's syndrome，SS）相關(guān)性干眼是經(jīng)典類(lèi)型。SS干眼是自身免疫介導(dǎo)淚腺破壞，導(dǎo)致眼表淚液嚴(yán)重缺失從而引發(fā)的眼表?yè)p傷[3]，IVCM用于研究SS干眼的眼表顯微形態(tài)，可以幫助臨床醫(yī)生評(píng)估病情及制定治療方案[4]。

有研究表明眼表嚴(yán)重缺水會(huì)引起角膜淺表細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量下降[5]，通過(guò)IVCM直接觀察SS患者，發(fā)現(xiàn)角膜淺表上皮細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則并伴有斑片狀改變、細(xì)胞間隙增寬、部分患者局限性上皮剝脫、微小囊腫、糜爛，細(xì)胞數(shù)量明顯減少等[6]；角膜基質(zhì)減少導(dǎo)致中央角膜厚度降低，淺基質(zhì)層細(xì)胞密度明顯高于非SS干眼患者，而深基質(zhì)細(xì)胞無(wú)明顯差別，在淺基質(zhì)層可見(jiàn)高反射細(xì)胞[7]，角膜樹(shù)突狀細(xì)胞（dendriticcell，DC）密度明顯增加，并且較非SS干眼明顯增高[8-9]。Matsumoto Y 和Ibrahim OMA[10]利用IVCM 觀察發(fā)現(xiàn)SS 干眼患者的內(nèi)皮細(xì)胞密度相比于健康對(duì)照者沒(méi)有明顯差異，而Kheirkhah A等[11]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞密度明顯降低。相較于非SS干眼及健康對(duì)照者，IVCM下SS干眼患者的神經(jīng)纖維稀疏且分支減少，神經(jīng)纖維的數(shù)量和密度下降，神經(jīng)彎曲和膨大增高，而神經(jīng)反射率沒(méi)有顯示出明顯差異[12-17]，研究者認(rèn)為神經(jīng)膨大可能是含有代謝活性遞質(zhì)的神經(jīng)纖維，有助于角膜營(yíng)養(yǎng)異常情況的改善[17]，但也有研究表明，SS患者的角膜神經(jīng)膨大數(shù)量是減少的[18]，反映了神經(jīng)損傷。Yang T 等[19]使用IVCM觀察淚腺發(fā)現(xiàn)，相較于健康對(duì)照者，腺泡單位密度、腺泡單位直徑低，而腺體炎癥細(xì)胞密度明顯增高。

既往研究認(rèn)為SS干眼患者角膜熒光素鈉著染即為角膜上皮缺損處，利用IVCM觀察發(fā)現(xiàn)該體征是由于角膜上皮緊密連接完整性受損、上皮通透性增加等原因?qū)е缕鋽z取熒光素增加所造成[20]。因此可推測(cè)，干眼患者角膜上皮細(xì)胞密度降低，上皮形態(tài)及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致角膜上皮抵御病原體和其他有害物質(zhì)的屏障功能受損，眼表穩(wěn)定被破壞，繼而引發(fā)更嚴(yán)重的損害。SS干眼患者角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度的變化存在爭(zhēng)議，且形態(tài)學(xué)上的改變尚無(wú)報(bào)道，值得進(jìn)一步研究。DC細(xì)胞在角膜免疫學(xué)中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞數(shù)量急劇增加被認(rèn)為是干眼致病的重要環(huán)節(jié)，研究表明角膜DC密度與干眼嚴(yán)重程度之間呈正相關(guān)關(guān)系[21]，因此利用IVCM觀察的DC密度及分布有望成為臨床干眼患者眼表免疫炎癥狀態(tài)的指標(biāo)之一。除觀察結(jié)膜細(xì)胞密度及形態(tài)外，IVCM還可分析結(jié)膜細(xì)胞核漿比，有研究證實(shí)SS干眼患者球結(jié)膜上皮細(xì)胞核漿比健康對(duì)照者明顯增大[22]，但現(xiàn)階段結(jié)膜上皮細(xì)胞核漿比的研究較少，利用核漿比評(píng)價(jià)結(jié)膜干燥程度的實(shí)用性還需大樣本研究支持。

2蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼

脂質(zhì)異常型干眼是脂質(zhì)層質(zhì)或量異常引起淚液蒸發(fā)過(guò)快所致，其中瞼板腺功能障礙（meibomian gland dysfunction，MGD）最為常見(jiàn)[23]。MGD是MG的一種慢性、彌漫性病變，腺體分泌的變化為特征。

利用IVCM觀察MGD患者發(fā)現(xiàn)MGD干眼患者角膜神經(jīng)密度和神經(jīng)膨大與健康對(duì)照者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但神經(jīng)彎曲度等級(jí)更高，其中輕中重度MGD患者神經(jīng)密度和反射率存差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[24]；MGD患者角膜中央DC數(shù)量較健康對(duì)照組明顯升高[25]，但也有其他研究發(fā)現(xiàn)MGD和健康對(duì)照的角膜DC密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[26]；IVCM下MGD患者的瞼緣開(kāi)口閉塞，腺泡密度明顯低于健康對(duì)照，腺孔直徑和瞼板反射率有所增加，腺周間質(zhì)不均勻性增加，腺泡壁及腺泡管增大伴有廣泛的腺周炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，重度MGD患者的MG萎縮伴廣泛的腺周纖維化[27-28]。

這些發(fā)現(xiàn)表明角膜神經(jīng)彎曲能夠?qū)GD干眼與健康對(duì)照組區(qū)分開(kāi)，但由于相關(guān)研究較少，角膜神經(jīng)彎曲是否能將MGD干眼與其他類(lèi)型干眼區(qū)分尚無(wú)定論。角膜DC細(xì)胞密度存在爭(zhēng)議，可能是MGD患者角膜DC細(xì)胞在角膜中央和周邊區(qū)分布不均，取樣時(shí)未做分區(qū)標(biāo)記，導(dǎo)致計(jì)數(shù)存在差異。瞼脂長(zhǎng)期堆積導(dǎo)致腺泡擴(kuò)張被認(rèn)為是MGD患者眼部癥狀及MG開(kāi)口形態(tài)改變出現(xiàn)的前期表現(xiàn)，早期MGD患者癥狀較輕，體征不明顯，IVCM是唯一能夠檢測(cè)到早期組織學(xué)改變的工具，利用IVCM 對(duì)MG細(xì)胞學(xué)形態(tài)隨訪觀察，能夠早期發(fā)現(xiàn)腺泡擴(kuò)張，進(jìn)行及時(shí)干預(yù)從而避免 MGD 干眼的發(fā)生，但目前隨訪研究較少，未來(lái)應(yīng)當(dāng)擴(kuò)大觀察對(duì)象，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，進(jìn)行更全面的分析。

3黏蛋白異常型干眼

黏蛋白異常型干眼是由于各種因素造成眼表上皮細(xì)胞（尤其杯狀細(xì)胞）受損而引起，臨床多見(jiàn)于眼表藥物的毒性損傷。藥物治療是青光眼治療的一線方法，長(zhǎng)期使用抗青光眼藥物會(huì)導(dǎo)致角結(jié)膜成分發(fā)生多種改變而引起藥源性干眼[29]。

結(jié)膜杯狀細(xì)胞負(fù)責(zé)釋放黏蛋白，有助于維持淚膜穩(wěn)定性、眼表潤(rùn)滑和穩(wěn)態(tài)[30]。目前IVCM被證實(shí)是評(píng)估杯狀細(xì)胞形態(tài)變化可靠的方法[31]。利用IVCM 發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，青光眼患者結(jié)膜杯狀細(xì)胞明顯下降，與單藥治療相比，接受2種藥物治療的患者的結(jié)膜杯狀細(xì)胞丟失明顯更大，無(wú)論降眼壓藥是否含有防腐劑，長(zhǎng)期治療后青光眼患者結(jié)膜杯狀細(xì)胞和黏蛋白標(biāo)志物都會(huì)降低[32]，靠近角膜緣的結(jié)膜中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中使用噻嗎洛爾治療的患者炎癥細(xì)胞數(shù)量更多[33]；IVCM觀察到多種藥治療的患者（≥2種藥）角膜緣上皮明顯不規(guī)則，緣周DC細(xì)胞激活，vogt柵欄纖維化，MG腺體密度和面積降低，腺泡分泌反射率增加，導(dǎo)管口擴(kuò)張[34]。

在青光眼治療過(guò)程中，保持杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性以及對(duì)淚膜的修飾是一個(gè)重要的挑戰(zhàn)，IVCM是一種有價(jià)值的非侵入性技術(shù)，可直接反映青光眼患者結(jié)膜杯狀的細(xì)胞減少、炎癥細(xì)胞的聚集，有助于找到既可有效降眼壓又可避免干眼的平衡點(diǎn)。周緣炎癥浸潤(rùn)導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞數(shù)量減少及功能改變，可能是藥物引起角膜上皮損傷后不易修復(fù)的原因，局部抗炎對(duì)緩解疾病發(fā)展十分重要。目前使用IVCM觀察藥物性干眼的研究集中于結(jié)膜杯狀細(xì)胞的改變，關(guān)于角膜損傷、結(jié)膜免疫激活、結(jié)膜微囊腫形成的報(bào)道極少，也缺乏降眼壓藥單用及聯(lián)合使用后眼表?yè)p傷的對(duì)比分析，增加對(duì)于這些方面的研究是未來(lái)需要努力的方向。

4淚液動(dòng)力學(xué)異常型干眼

淚液動(dòng)力學(xué)異常型干眼因淚液的動(dòng)力學(xué)異常引起，包括瞬目異常、淚液排出異常、等導(dǎo)致的干眼，暴露性眼瞼閉合不全等屬于這一類(lèi)型干眼。臨床上暴露性眼瞼閉合不全多見(jiàn)于甲狀腺相關(guān)性眼?。╰hyroid-associated ophthalmopathy，TAO），這是一種與甲狀腺功能異?；蚩辜谞钕倏贵w異常相關(guān)的自身免疫病。

使用IVCM觀察發(fā)現(xiàn)，較非活動(dòng)期TAO，活動(dòng)期TAO患者結(jié)膜鱗狀化生，朗格漢斯細(xì)胞明顯增加，結(jié)膜上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞密度下降，但神經(jīng)纖維密度、神經(jīng)曲折率在活動(dòng)期和非活動(dòng)期TAO 患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[35-37]；TAO 患者M(jìn)G腺泡擴(kuò)張、形態(tài)不規(guī)則，腺管缺失、排列紊亂，和健康對(duì)照組相比，MG開(kāi)口明顯縮小，其內(nèi)可見(jiàn)中高反光樣分泌物堵塞，開(kāi)口周?chē)梢?jiàn)不同程度的纖維化，腺泡周?chē)罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)。分組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在活動(dòng)性TAO患者中，MG有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和輕微擴(kuò)張的形態(tài)學(xué)改變。在非活動(dòng)性TAO 患者中，通?？梢杂^察到MG 腺體阻塞、擴(kuò)張和纖維化的征象[38]。

據(jù)上述發(fā)現(xiàn)推測(cè)，可以通過(guò)IVCM檢測(cè)的MG特征性改變來(lái)鑒別活動(dòng)性和非活動(dòng)性TAO，決定是否需要全身抗炎治療。杯狀細(xì)胞的減少是因?yàn)榛顒?dòng)期自身免疫引發(fā)的眼部炎癥所致[39]，杯狀細(xì)胞缺失導(dǎo)致黏蛋白分泌減少和淚膜不穩(wěn)定，這可能是活動(dòng)期TAO干眼患病率明顯高于非活動(dòng)期患者的原因。TAO患者M(jìn)G微觀結(jié)構(gòu)變化主要是阻塞和炎癥浸潤(rùn)，出現(xiàn)這些變化的原因可能是TAO患者眼球突出和瞼裂擴(kuò)大導(dǎo)致不完全眨眼增強(qiáng)，MG分泌減少，最終造成MG阻塞、萎縮、缺失，而炎癥細(xì)胞激活，與成纖維細(xì)胞相互作用，最終導(dǎo)致MG纖維化。使用IVCM可幫助進(jìn)一步理解TAO發(fā)生干眼的機(jī)制，定量評(píng)估患者的角結(jié)膜微觀結(jié)構(gòu)變化，有助于制定隨訪計(jì)劃并給予及時(shí)干預(yù)。

5結(jié)語(yǔ)

眼表改變?cè)诟裳叟R床評(píng)估和診斷中十分重要，IVCM對(duì)眼部組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)胞層面上的無(wú)創(chuàng)檢查，可以直接發(fā)現(xiàn)微觀結(jié)構(gòu)異常，越來(lái)越廣泛地應(yīng)用到干眼檢查與治療中。正如本文所述，利用IVCM可以實(shí)時(shí)評(píng)估各類(lèi)干眼角結(jié)膜細(xì)胞密度形態(tài)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、神經(jīng)纖維狀態(tài)以及瞼板腺腺泡改變等，收集客觀圖像和共焦顯微參數(shù)，獲得不同類(lèi)型干眼特征性眼表改變，可以幫助評(píng)估疾病動(dòng)態(tài)變化，協(xié)助隨訪治療?？傊鳛楦裳巯嚓P(guān)的各種眼表疾病臨床診斷的補(bǔ)充技術(shù)，IVCM正日益受到重視，期望未來(lái)可以通過(guò)深入研究和大樣本的數(shù)據(jù)分析來(lái)制定相關(guān)評(píng)估指標(biāo)和規(guī)范。