稻田增加溝坑對(duì)金背鯉腸道結(jié)構(gòu)、消化酶活性及微生物群落的影響

摘要： 【目的】探究金背鯉Cyprinus carpio var. Jinbei 的稻田適應(yīng)性特征及其腸道與不同稻田生長(zhǎng)環(huán)境的關(guān)系?！痉椒ā恳栽谄桨迨?、“一”字溝以及“十”字溝稻田生長(zhǎng)的金背鯉為研究對(duì)象，采用形態(tài)學(xué)、酶學(xué)及生物信息學(xué)的方法探究稻田增加溝坑對(duì)金背鯉腸道結(jié)構(gòu)、消化酶活性及微生物群落的影響?！窘Y(jié)果】“十”字溝組金背鯉腸道的絨毛最寬（173.59 μm），其次是“一”字溝組（157.72 μm），最窄的是平板式組（139.69 μm）?！笆弊譁辖M、“一”字溝組的胰蛋白酶活性分別為4 662.65、4 676.12 U·mg?1，顯著高于平板式組的3 752.34 U·mg?1（Plt;0.05）。從門水平看，稻田增加溝坑后，變形菌門、厚壁菌門仍然是優(yōu)勢(shì)菌門，但放線菌門取代梭桿菌門成為優(yōu)勢(shì)菌門；從屬水平看，平板式組的優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌屬、鯨桿菌屬、紅桿菌屬，“一”字溝組和“十”字溝組優(yōu)勢(shì)菌屬變化較大，在各組前3 位的優(yōu)勢(shì)菌屬中，“一”字溝組有1 種發(fā)生改變，“十”字溝中有2 種發(fā)生改變。【結(jié)論】稻田中增加溝坑后金背鯉腸道的結(jié)構(gòu)、消化酶活性、微生物群落及優(yōu)勢(shì)菌群會(huì)發(fā)生改變，通過調(diào)節(jié)代謝以適應(yīng)新的稻田水環(huán)境，但金背鯉腸道核心菌群的組成保持相對(duì)穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞： 稻田；溝坑；金背鯉；腸道結(jié)構(gòu)；消化酶；微生物群落

中圖分類號(hào)： S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1001-411X（2024）06-0889-09

中華文明歷史悠久，稻田養(yǎng)魚是我國(guó)勞動(dòng)人民智慧的結(jié)晶，我國(guó)是稻田養(yǎng)魚最早的國(guó)家。貴州稻田養(yǎng)魚源于“稻作農(nóng)耕，飯稻羹魚”的生活傳統(tǒng)，是多民族智慧的結(jié)晶，1975 年在貴州省興義市出土的東漢水田模型陶器，將貴州稻田養(yǎng)魚追溯至1 800 年以前[1]，2011 年從江侗鄉(xiāng)稻魚鴨系統(tǒng)入選全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)（GIAHS） 保護(hù)試點(diǎn)[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，貴州現(xiàn)有82 個(gè)縣（市/區(qū)） 參與稻田養(yǎng)魚，面積為1.92×105 hm2。金背鯉Cyprinus carpio var.Jinbei 俗稱呆鯉、金邊鯉、花背鯉等，因背鰭兩側(cè)有2 條穩(wěn)定遺傳的金色條紋、頭部有類似金色蝴蝶圖案而得名[3]。金背鯉長(zhǎng)期作為稻田養(yǎng)殖對(duì)象，已形成了不逃逸、耐低氧、耐溫范圍廣等特點(diǎn)[4]，且稻田養(yǎng)殖成活率和產(chǎn)量較高[ 5 ] ，備受黔、桂、湘三?。▍^(qū)） 交界區(qū)域種養(yǎng)戶喜愛。

貴州省具有典型的喀什特地貌特征，決定了稻田面積小、土層薄，導(dǎo)致稻田養(yǎng)魚以平板式為主，平板式稻田養(yǎng)魚占全省總種養(yǎng)面積的80% 以上，形成了稻田養(yǎng)魚產(chǎn)量低、效益低的現(xiàn)狀。在發(fā)展歷程中，種養(yǎng)戶通過開挖“一”字溝和“十”字溝增加水體體積，來促進(jìn)稻魚增收。但生長(zhǎng)水環(huán)境的改變，導(dǎo)致腸道內(nèi)環(huán)境改變從而影響魚類的生長(zhǎng)[6-7]。魚類腸道是集消化、吸收、代謝、免疫、內(nèi)分泌于一體的特殊“微生物搖籃”，菌群數(shù)量眾多，各菌種之間互相制約，互相依存，達(dá)成一種生態(tài)平衡[8]。相關(guān)研究表明，魚類腸道的結(jié)構(gòu)、消化酶活性、微生物組成等對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]、維持菌群穩(wěn)態(tài)[11] 起著至關(guān)重要的作用。

目前，學(xué)者們對(duì)金背鯉的研究主要集中在形態(tài)特征[12]、主體風(fēng)味[13]、遺傳多樣性[14] 等方面，不同稻田生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)金背鯉腸道內(nèi)環(huán)境影響的研究甚少。因此，本研究采用組織學(xué)、酶學(xué)以及生物信息學(xué)方法探究不同稻田生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)金背鯉腸道結(jié)構(gòu)、消化酶活性和微生物群落的影響，以期為進(jìn)一步加強(qiáng)金背鯉資源的保護(hù)與利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)置

試驗(yàn)地點(diǎn)位于都勻市勻東鎮(zhèn)甲登村，該區(qū)域稻田養(yǎng)魚面積61.36 hm2，位于山區(qū)坡地上的養(yǎng)魚稻田呈梯田分布，由于田塊相對(duì)較小，絕大多數(shù)田塊不到0.07 hm2，這部分稻田不挖溝坑，稱為平板式養(yǎng)魚稻田，有45.33 hm2；部分田塊于稻田中間挖“一”字溝，有10.67 hm2；挖有“十”字溝的稻田相對(duì)較大，數(shù)量少，有5.67 hm2。在這些養(yǎng)魚稻田中，選擇位置相鄰、大小相近的9 塊稻田，即平板式稻田3 塊、“一”字溝稻田3 塊、“十”字溝稻田3 塊進(jìn)行試驗(yàn)。3 組養(yǎng)魚稻田分別命名為平板式組、“一”字溝組、“十”字溝組。3 組稻田基本情況見表1。金背鯉養(yǎng)殖周期為2022 年6 月22 日—9 月23 日，投放密度為225 kg/hm2，投放體質(zhì)量、體長(zhǎng)分別為（98.15±6.01） g、（15.13±0.75） cm。試驗(yàn)期間不使用農(nóng)藥，不投喂餌料。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)量金背鯉生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)，并采集樣品。每塊稻田隨機(jī)抓取5 尾魚，共45 尾，分別裝入9 個(gè)袋中，裝取相對(duì)應(yīng)的稻田水，充氧活體運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，分別放入暫養(yǎng)箱中禁食24 h 后取樣。采用MS222 麻醉后，用無(wú)菌水洗凈魚體，分離出腸道，再用PBS 緩沖液沖洗。每塊稻田隨機(jī)取3 尾金背鯉的腸道內(nèi)容物，混勻后放入10 mL 無(wú)菌管，液氮保存，用于腸道微生物測(cè)定。每塊稻田隨機(jī)取1 尾金背鯉前腸中間部位1 cm 腸道組織，用PBS溶液清洗干凈，4%（φ） 甲醛溶液固定，置于50 mL離心管，用于組織形態(tài)學(xué)觀察。每塊稻田隨機(jī)取1 尾金背鯉的腸道，置于10 mL 無(wú)菌離心管，?80 ℃保存，用于消化酶活性測(cè)定。

1.3 腸道組織切片

腸道標(biāo)本經(jīng)梯度脫水后用石蠟包埋，4 μm 切片，蘇木精?伊紅（HE） 染色，封片后自然風(fēng)干。

1.4 腸道形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

1） 采用Eclipse Ci-L 正向白光攝影顯微鏡（Nikon，日本），對(duì)小腸組織分別進(jìn)行40×和100×成像。

2 ） 使用I m a g e - P r o P l u s 6 . 0 軟件（ M e d i aCybemetics，美國(guó)） 分析。

3） 在40×視野下，測(cè)量5 根完整腸絨毛指標(biāo)。

4） 在100×視野下，觀察腸道內(nèi)的杯狀細(xì)胞數(shù)量。

1.5 腸道消化酶活性檢測(cè)

根據(jù)試劑盒（南京建成生物科技有限公司，中國(guó)） 說明書測(cè)定消化酶活性。

1.6 腸道菌群總DNA 提取及生物學(xué)分析

使用FastDNA?SPIN（MP Biomedicals，上海） 試劑盒從金背鯉腸道內(nèi)容物中提取D N A ， 采用Nanodrop 對(duì)DNA 進(jìn)行精確定量，并通過12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量。總DNA 根據(jù)細(xì)菌16S rRNA 基因V3～V4 片段的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為5× reaction buffer 和5× GC buffer 各5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（3′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-5′）（10μ m o l / L ） 和下游引物（ 3 ′ - G G A C T A C H V G GGTWTCTAAT-5′）（10 μmol/L） 各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA 聚合酶0.25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 預(yù)變性2 min；98 ℃ 變性15 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

使用18 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，將純化后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至成都諾米代謝生物科技有限公司的IlluminaMiseq 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。調(diào)用Qiime cutadapttrim-paired 切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列，再通過Qiime dada2 denoise-paired 調(diào)用D A D A 2 進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體。以1 0 0% 相似度將序列聚類成為可操作分類單元（ASVs）。所有文庫(kù)經(jīng)去噪后，合并ASVs 特征序列，去除singletons ASVs，以處理后的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)的分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0 軟件（美國(guó)） 對(duì)消化酶活性的結(jié)果進(jìn)行分析，Plt;0.05 表示差異顯著。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism 7.0 繪圖。在腸道菌群分析中，Alpha 多樣性分析中的Chao1、Shannon、Simpson 和群落覆蓋率（Goods-coverage）指數(shù)，使用Qiime2 軟件計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 組稻田條件下金背鯉生長(zhǎng)狀況

金背鯉在稻田中經(jīng)過93 d，即1 個(gè)水稻種植季節(jié)后，樣品終體質(zhì)量、體長(zhǎng)、增重率和成活率均體現(xiàn)為“十”字溝組最高，其次是“一”字溝組，平板式組最低；3 組金背鯉終體質(zhì)量、體長(zhǎng)、增重率和成活率差異均不顯著（Pgt;0.05）。

2.2 3 組稻田條件下金背鯉腸道組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

3 組稻田金背鯉腸道組織形態(tài)見圖1。從整體來看，腸道組織結(jié)構(gòu)清晰可見。平板式組小腸組織結(jié)構(gòu)完整，絨毛細(xì)而密，多分枝，幾乎填滿了小腸（圖1A）。“一”字溝組腸黏膜皺襞排列整齊，間質(zhì)較寬（圖1B）。“十”字溝組腸道黏膜皺襞排列疏松，較短，間質(zhì)較寬（圖1C）。

2.3 3 組稻田條件下金背鯉腸道組織形態(tài)指標(biāo)

3 組稻田金背鯉腸道經(jīng)指標(biāo)測(cè)量后，平板式組絨毛最高（690.28 μm），“一”字溝組最矮（488.79μm）；“十”字溝組絨毛最寬（173.59 μm），平板式組最窄（139.69 μm）。3 組金背鯉絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度、肌層厚度和杯狀細(xì)胞數(shù)量均差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.4 3 組稻田條件下金背鯉腸道消化酶活性

分別測(cè)定平板式組、“一”字溝組和“十”字溝組稻田金背鯉腸道中的淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和纖維素酶活性，結(jié)果見表2。淀粉酶活性為“十”字溝組最高（0.93 U·mg?1），“一”字溝組最低（0.78 U·mg?1），3 組間差異不顯著（Pgt;0.05）。脂肪酶活性為“一”字溝組最高（159.99 U·mg?1），平板式組最低（105.71 U·mg? 1 ），3 組間差異不顯著（Pgt;0.05）?！耙弧弊譁辖M（4 676.12 U·mg? 1 ） 和“十”字溝組（4 662.65 U·mg?1） 的胰蛋白酶活性顯著高于平板式組（3 752.34 U·mg?1） （Plt;0.05），“一”字溝組和“十”字溝組差異不顯著（Pgt;0.05）。纖維素酶活性為“十”字溝組最高（31.52 U·mg? 1 ），“一”字溝組次之（30.90 U·mg?1），平板式組最低（25.23 U·mg?1），3 組間差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.5 3 組稻田條件下金背鯉腸道菌群測(cè)序數(shù)據(jù)和多樣性

Illumina MiSeq 測(cè)序共獲得有效序列487 407條，以100% 相似度將序列聚類成為ASVs，經(jīng)過濾和注釋后聚類為5 032 個(gè)ASVs。平板式組、“一”字溝組、“ 十” 字溝組金背鯉共有和特有的ASVs 見圖2。3 組稻田金背鯉腸道菌群樣本中A S V s 從高到低為“ 一” 字溝組gt; 平板式組gt;“十”字溝組；平板式組有1 506 個(gè)，“一”字溝組有2 732 個(gè)，“十”字溝組有1 396 個(gè)。3 組稻田金背鯉腸道菌群間共享A S V s 為1 1 9 個(gè)， 占比2.36%。3 組稻田之間，平板式組和“一”字溝組共享ASVs 最多，為308 個(gè)；而平板式組和“十”字溝組共享ASVs 最少，僅162 個(gè)?！耙弧弊譁辖M獨(dú)有ASVs 最多，有2 292 個(gè)；平板式次之，為1 155個(gè)；“十”字溝組最少，僅1 102 個(gè)。

3 組稻田金背鯉腸道菌群的Alpha 多樣性分析結(jié)果見圖3。每個(gè)樣本的群落覆蓋率均超過99.38%，說明采集樣品未被測(cè)序的概率很低?！耙弧弊譁辖M的Chao1 指數(shù)最高，表明其腸道菌群內(nèi)物種極為豐富； “ 十” 字溝組最低。3 組稻田金背鯉的Simpson 和Shannon 指數(shù)表現(xiàn)為“一”字溝組最高， “十”字溝組最低。3 組稻田金背鯉的多樣性指標(biāo)均無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）。

基于主坐標(biāo)分析（Principal coordinate analysis，PCoA） 相似矩陣的Beta 多樣性分析結(jié)果見圖4。Beta 多樣性可以反映不同組金背鯉腸道樣品細(xì)菌群落的相似性，在ASVs 水平上，基于非加權(quán)Unifrac距離對(duì)樣本進(jìn)行PCoA 分析，評(píng)估不同組樣本之間菌群結(jié)構(gòu)的相似性。結(jié)果顯示，3 個(gè)組別的距離較遠(yuǎn)且沒有重疊，說明3 個(gè)組別的腸道菌群存在差異。但根據(jù)PERMANOVA 結(jié)果，平板式與“一”字溝組、平板式組與“十”字溝組以及“一”字溝與“十”字溝組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

2.6 3 組稻田條件下金背鯉腸道微生物群落組成及差異

3 組稻田金背鯉腸道菌群在門水平的相對(duì)豐度如圖5 所示。共鑒定出38 個(gè)門，3 個(gè)組別相對(duì)豐度均大于0.1% 的菌門有12 個(gè)。將相對(duì)豐度最高的前3 個(gè)菌門定義為優(yōu)勢(shì)菌門。平板式組的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、梭桿菌門Fusobacteria；“一”字溝組的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、放線菌門A c t i n o b a c t e r i a 、厚壁菌門；“十”字溝組的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門。其中變形菌門、厚壁菌門是3 組稻田條件的共同優(yōu)勢(shì)菌門。

在屬水平上，將相對(duì)豐度最高的前3 個(gè)菌屬定義為優(yōu)勢(shì)菌屬。如圖6 所示，3 個(gè)組別中，平板式組的優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌屬Streptococcus、鯨桿菌屬Cetobacterium、紅桿菌屬Rhodobacter；“一”字溝組的優(yōu)勢(shì)菌屬為鯨桿菌屬、鏈球菌屬、放線菌屬Actinomyces；“十”字溝組的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳球菌屬Lactococcus、腸桿菌屬Enterobacter、鏈球菌屬。

3 組稻田條件下的金背鯉腸道菌群中，本研究采用LEfSe 方法分析得出，5 個(gè)分類群的相對(duì)豐度存在差異，LDA 評(píng)分gt;2， Plt;0.05。在平板式組、“一”字溝組和“十”字溝組中分別鑒定出0、4 和1 種標(biāo)志物種，其中，“一”字溝組的標(biāo)志物種為雙歧桿菌目B i f i d o b a c t e r i a l e s 、雙歧桿菌科Bifidobacteriaceae、雙歧桿菌屬Bifidobacterium 以及萬(wàn)尼氏紅微菌屬Rhodomicrobium；“十”字溝組的標(biāo)志物種為拉恩氏菌屬Rahnella。

2.7 3 組稻田條件下金背鯉腸道核心菌群分析

將相對(duì)豐度大于0.1% 的菌群定義為3 組金背鯉腸道的核心菌群，經(jīng)過分析，相對(duì)豐度大于0.1% 的共有核心菌群有30 個(gè)屬，這些菌屬隸屬于8 個(gè)菌門；分布最廣的主要在放線菌門和厚壁菌門，其次是綠彎菌門Chloroflexi，極少部分分布在軟壁菌門T e n e r i c u t e s 、梭桿菌門和疣微菌門Verrucomicrobia。

在放線菌門中，有18 個(gè)核心菌屬，其中相對(duì)豐度最高的為“一”字溝組的unidentified_HOC36，占9.86%；其次為“十”字溝組的unidentified_Propionibacteriaceae （丙酸桿菌科），占7.77%；相對(duì)豐度排第3 位的核心菌屬為“ 十” 字溝組的unidentified_OPB41，占4.24%。在厚壁菌門中，有3 個(gè)核心菌屬，其中相對(duì)豐度最高的為平板式組的鏈球菌屬，占17.65%；其次為“一”字溝組的unidentified_Peptostreptococcaceae （消化鏈球菌科），占4.60%；第3 位為“十”字溝組的鏈球菌屬，占2.35%。在綠彎菌門中，有3 個(gè)核心菌屬，分別是unidentified_SJA-15 （占3.17%）、unidentified_Ellin6529（占1.43%）以及unidentified_GCA004 （占1.35%），均分布在“一”字溝組。

3 討論與結(jié)論

3.1 有溝坑稻田對(duì)金背鯉腸道結(jié)構(gòu)和消化酶活性的影響

稻田中增加魚溝、魚坑的“一”字溝組和“十”字溝組稻田的水體量有所增加，一方面提高了稻田載魚量，另一方面，形成了稻田魚的棲息場(chǎng)所。本研究結(jié)果顯示，“十”字溝組金背鯉腸道絨毛最寬，其次是“一”字溝組，最窄的是沒挖溝坑的平板式組。增加溝坑使得稻田中天然餌料增加，有利于金背鯉游動(dòng)覓食以攝食到更多的食物。當(dāng)金背鯉攝食較多的食物后，腸道結(jié)構(gòu)更加發(fā)達(dá)，消化吸收食物的能力增強(qiáng)。金背鯉絨毛增寬，可以加大腸道與食物的接觸機(jī)會(huì)，增大吸收面積，進(jìn)而促進(jìn)金背鯉的生長(zhǎng)。

腸道消化酶活性是衡量魚類消化和吸收飼料能力的重要指標(biāo)，消化酶活性反映魚類利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力[15]。本研究結(jié)果顯示，“一”字溝組金背鯉腸道的胰蛋白酶活性顯著高于平板式組，說明開挖“一”字溝有利于提高稻田金背鯉的消化酶活性。已經(jīng)有研究表明，稻魚種養(yǎng)中浮游動(dòng)物的總個(gè)體數(shù)和類群數(shù)顯著低于水稻單種，主要減少原因是稻田中魚類捕食[16]。Tsuruta等[16] 研究表明，鯉科魚類攝食富含蛋白和脂肪的水生動(dòng)物，稻魚系統(tǒng)的浮游動(dòng)物和甲殼類、寡毛綱等底棲無(wú)脊椎動(dòng)物的密度均低于單種水稻的。因此，相比沒有溝坑的平板式稻田，開挖溝坑增加了稻田中生物餌料的種類和數(shù)量，稻田金背鯉有機(jī)會(huì)攝食更多的浮游動(dòng)物、螺類、水生昆蟲以及外來昆蟲的卵和幼體等，金背鯉攝食的蛋白質(zhì)增多，顯著提升蛋白酶活性，同時(shí)也可提升脂肪酶活性。

3.2 有溝坑稻田對(duì)金背鯉腸道優(yōu)勢(shì)菌群組成的影響

稻田增加溝坑，一方面使金背鯉腸道微生物群落發(fā)生變化，另一方面，使金背鯉腸道的優(yōu)勢(shì)菌群也產(chǎn)生一定變化。PCoA 相似矩陣的Beta 多樣性分析顯示，3 個(gè)組別的距離較遠(yuǎn)且沒有重疊，說明在稻田增加溝坑以后，金背鯉的腸道菌群產(chǎn)生了差異，并且溝坑方式不同，差異也不同。就優(yōu)勢(shì)菌群而言，從門的水平來看，沒有溝坑的平板式組金背鯉腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門；開挖“一”字溝及“十”字溝后，優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門。主要變化是增加溝坑后，變形菌門、厚壁菌門仍然是優(yōu)勢(shì)菌門，但放線菌門取代梭桿菌門成為優(yōu)勢(shì)菌門。

有研究表明，變形菌門和厚壁菌門是許多魚類中最典型的2 種優(yōu)勢(shì)菌門，如大口黑鱸[17]、中國(guó)花鱸[18]等。在平板式稻田增加溝坑后，變形菌門和厚壁菌門依然是金背鯉腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群，放線菌門是新出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌門。放線菌門有助于魚類腸道分解有機(jī)質(zhì)，在有機(jī)物質(zhì)的周轉(zhuǎn)和碳循環(huán)中起重要作用[19]。當(dāng)金背鯉在稻田中攝食更豐富、更多的水生動(dòng)物時(shí)，放線菌門微生物增多幫助金背鯉分解有機(jī)物質(zhì)，促進(jìn)其快速生長(zhǎng)。優(yōu)勢(shì)菌門的變化表明稻田金背鯉的腸道微生物群落因稻田環(huán)境的改變而發(fā)生變化。

同樣，在屬水平上，平板式組的優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌屬、鯨桿菌屬、紅桿菌屬。與平板式組相比，“一”字溝組除了保持共有的鏈球菌屬和鯨桿菌屬外，放線菌屬取代紅桿菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌屬，只有1 種優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生了變化；而“十”字溝組有2 種優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生了變化，只有鏈球菌屬是共有菌屬，乳球菌屬、腸桿菌屬是其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌屬。結(jié)果表明，在稻田增加溝坑后，稻田金背鯉的優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生很大的變化，并且腸道菌群受“十”字溝影響比受“一”字溝的影響更大。優(yōu)勢(shì)菌屬的變化同樣表明稻田金背鯉的腸道微生物群落因稻田環(huán)境的改變而改變。

通過LEfSe 分析，平板式組沒有鑒定出標(biāo)志物種，“一”字溝組和“十”字溝組分別鑒定出4 和1 種。其中雙歧桿菌是挖溝后出現(xiàn)的標(biāo)志物種，可以有效抑制病原微生物，提高消化率[20]，增強(qiáng)腸道健康[21]。Zhang 等[22] 研究證明，在肉雞基礎(chǔ)飼料中添加1% （w） 的雙歧桿菌可顯著降低腸道中沙門氏菌和大腸埃希菌數(shù)量，促進(jìn)乳酸桿菌增殖，大大提高肉雞生長(zhǎng)性能。結(jié)果表明，相較于平板式，有溝坑的稻田更有利于金背鯉的健康生長(zhǎng)。

3.3 稻田增加溝坑后金背鯉腸道核心菌群的組成保持相對(duì)穩(wěn)定

3組稻田金背鯉腸道菌群的Alpha 多樣性分析中，3 組稻田金背鯉腸道菌群的Chao1、Shannon 和Simpson 指數(shù)均無(wú)顯著差異，表明稻田增加溝坑后，金背鯉腸道核心菌群的組成保持相對(duì)穩(wěn)定。

就優(yōu)勢(shì)菌群而言，稻田增加溝坑后，金背鯉腸道內(nèi)仍保持相對(duì)穩(wěn)定的核心菌群；厚壁菌門、變形菌門仍是優(yōu)勢(shì)菌群，放線菌門取代梭桿菌門成為優(yōu)勢(shì)菌門，在這些門中，對(duì)稻田金背鯉核心菌群貢獻(xiàn)最大的是鯨桿菌屬和鏈球菌屬。

在宿主與腸道微生物長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，有些微生物會(huì)定植在宿主腸道中，成為核心菌群。有研究表明，宿主的核心細(xì)菌比例取決于其生理階段，而不是外部環(huán)境[23]。在本研究中，3 組金背鯉腸道中相對(duì)豐度大于0.1% 的共有核心菌群有30 個(gè)屬，這些菌屬隸屬于8 個(gè)菌門；稻田中增加溝坑后，這30 個(gè)核心菌屬所占的比例出現(xiàn)差異，但同樣主要分布在放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門。一些物種在不同的發(fā)育階段，核心菌群保持相對(duì)穩(wěn)定，一些物種在不同的環(huán)境中也保持了核心菌群的相對(duì)穩(wěn)定。如Wang 等[24] 調(diào)查了中華絨螯蟹腸道菌群在3 個(gè)生長(zhǎng)階段的發(fā)育情況，確定從幼蟹到成蟹的核心菌群為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。處于不同生長(zhǎng)環(huán)境的日本沼蝦的腸道內(nèi)，變形菌門是主要的核心菌門，厚壁菌門和放線菌門次之[25]。本研究在增加稻田溝坑后，相對(duì)豐度大于0.1% 的30 個(gè)核心菌屬同平板式組保持一致，表明金背鯉腸道核心菌群保持相對(duì)穩(wěn)定。

3.4 結(jié)論

在稻田中開挖溝坑后，稻田金背鯉的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于平板式組，腸道絨毛明顯增寬，胰蛋白酶活性顯著升高，消化能力提高；腸道微生物多樣性差異不顯著，說明金背鯉優(yōu)勢(shì)菌群和核心菌群保持相對(duì)穩(wěn)定。稻田金背鯉能適應(yīng)“一”字溝和“十”字溝的稻田種養(yǎng)模式，在稻田中增加溝坑更有利于金背鯉生長(zhǎng)。

致謝：感謝都勻市勻東鎮(zhèn)甲登村村級(jí)合作社對(duì)采樣稻田的安排協(xié)調(diào)，感謝都勻市楊里生態(tài)養(yǎng)殖有限公司楊再恩同志在試驗(yàn)期間稻田管理及采樣中提供的幫助。

參考文獻(xiàn)：

[1]葉茂林. 小議貴州出土的水塘稻田模型[J]. 貴州文史叢刊， 1990（4）： 32-37.

[2]張文爭(zhēng)， 楊立， 姚俊杰， 等. 稻田金背鯉尾柄肌纖維特征及相關(guān)代謝酶與基因表達(dá)研究[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，2023， 19（4）： 77-85.

[3]JI D， SU X， YAO J J， et al. Genetic diversity and geneticdifferentiation of populations of golden-backed carp（Cyprinus carpio var. Jinbei） in traditional rice fields inGuizhou， China[J]. Animals， 2022， 12（11）： 1377.

[4]張文爭(zhēng). 稻田養(yǎng)殖金背鯉肌肉生長(zhǎng)及PI3K/AKt 通路的研究[D]. 貴陽(yáng)： 貴州大學(xué)， 2023.

[5]莫飛龍， 韋玲靜， 賈慶光， 等. 金邊鯉稻田養(yǎng)殖對(duì)比試驗(yàn)[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚， 2021（9）： 17-18.

[6]李存玉， 徐永江， 柳學(xué)周， 等. 池塘和工廠化養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)的比較分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2015， 39（2）： 245-255.

[7]張紅斌， 王秀利. 養(yǎng)殖魚塘水質(zhì)動(dòng)態(tài)檢測(cè)與分析[J]. 漁業(yè)致富指南， 2019（19）： 63-68

[8]LI Q， HONG M J， ZHANG Y M， et al. Research progresson gastro-intestinal tract microorganism of marinefishs[J]. Pharmaceutical Biotechnology， 2016， 23（6）：561-564.

[9]KHOSRAVI S， RAHIMNEJAD S， HERAULT M， et al.Effects of protein hydrolysates supplementation in lowfish meal diets on growth performance， innate immunityand disease resistance of red sea bream Pagrus major[J].Fish amp; Shellfish Immunology， 2015， 45（2）： 858-868.

[10]BOLNICK D I， SNOWBERG L K， CAPORASO J G， etal. Major Histocompatibility Complex class IIb polymorphisminfluences gut microbiota composition and diversity[J]. Molecular Ecology， 2014， 23（19）： 4831-4845.

[11]XIAO F S， ZHU W G， YU Y H， et al. Host developmentoverwhelms environmental dispersal in governing theecological succession of zebrafish gut microbiota[J]. NPJBiofilms and Microbiomes， 2021， 7： 5.

[12]馬子堯， 潘紅， 王開闊， 等. 2 個(gè)鯉群體（Cyprinus carpioL.） 表型生長(zhǎng)性狀的AI 測(cè)量與手工測(cè)量的相關(guān)性分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2024， 40（14）： 157-164.

[13]于美娟， 楊慧[13] ， 余長(zhǎng)生， 等. 兩種養(yǎng)殖模式金背鯉腸道微生物菌群和主體風(fēng)味差異分析[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，2023， 19（3）： 151-163.

[14]紀(jì)達(dá)， 許勁松， 姚俊杰， 等. 貴州省5 個(gè)金背鯉（Cyprinuscarpio var. Jinbei） 地理種群的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志， 2022， 35（5）： 8-17.

[15]DAWOOD M A O， MAGOUZ F I， MANSOUR M， et al.Evaluation of yeast fermented poultry by-product meal inNile tilapia （Oreochromis niloticus） feed： Effects ongrowth performance， digestive enzymes activity， innateimmunity， and antioxidant capacity[J]. Frontiers in VeterinaryScience， 2020， 6： 516.

[16]TSURUTA T， YAMAGUCHI M， ABE S， et al. Effect offish in rice-fish culture on the rice yield[J]. Fisheries Science，2011， 77（1）： 95-106.

[17]ZHOU Y L， HE G L， JIN T， et al. High dietary starch impairsintestinal health and microbiota of largemouth bass，Micropterus salmoides[J]. Aquaculture， 2021， 534：736261.

[18]梁祖鑾， 趙吉臣， 廖敏澤， 等. 不同生長(zhǎng)階段中國(guó)花鱸腸道和環(huán)境微生物群落分析[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2024， 39（2）： 215-224.

[19]王美茹， 崔鵬飛， 汝少國(guó). 養(yǎng)殖水環(huán)境中抗生素對(duì)魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)、功能和抗性組的影響研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)， 2023， 18（3）： 94-111.

[20]SAHANDI J， JAFARYAN H， SOLTANI M， et al. Theuse of two Bifidobacterium strains enhanced growth performanceand nutrient utilization of rainbow trout （Oncorhynchusmykiss） fry[J]. Probiotics and AntimicrobialProteins， 2019， 11（3）： 966-972.

[21]于俊. 雙歧桿菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)、腸道形態(tài)指標(biāo)的影響[J]. 飼料研究， 2023， 46（6）： 33-37.

[22]ZHANG L， ZHANG R， JIA H， et al. Supplementation ofprobiotics in water beneficial growth performance， carcasstraits， immune function， and antioxidant capacity inbroiler chickens[J]. Open Life Sciences， 2021， 16（1）：311-322.

[23]ALBERDI A， AIZPURUA O， BOHMANN K， et al. Dovertebrate gut metagenomes confer rapid ecological adaptation？[J]. Trends in Ecology amp; Evolution， 2016，31（9）： 689-699.

[24]WANG C， ZHOU Y， LV D， et al. Change in the intestinalbacterial community structure associated with environmentalmicroorganisms during the growth of Eriocheirsinensis[J]. MicrobiologyOpen， 2019， 8（5）： e727.

[25]TZENG T， PAO Y Y， CHEN P C， et al. Effects of hostphylogeny and habitats on gut microbiomes of orientalriver prawn （Macrobrachium nipponense）[J]. PLoS One，2015， 10（7）： e0132860.

【責(zé)任編輯 李慶玲】

基金項(xiàng)目：貴州省農(nóng)業(yè)重大產(chǎn)業(yè)科學(xué)研究攻關(guān)項(xiàng)目（黔教合KY 字[2019]013）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻漁綜合種養(yǎng)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2023-1）