玉米秸稈水提-甘油協(xié)同蒸汽爆破預(yù)處理及其丁醇發(fā)酵研究

李曉娟, 董紅麗, 張宏森, 宋安東, 聶文喜, 王風(fēng)芹

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450046; 2.河南省鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,河南 鄭州 450002)

丁醇是重要的化工原料和可再生生物能源,與乙醇相比具有能量密度高、燃燒值高、蒸氣壓低、與汽油配伍性好及能以任意比例和汽油混合等多種優(yōu)良特性,現(xiàn)已成為僅次于乙醇的第二代可再生生物能源[1-2]。傳統(tǒng)的丁醇發(fā)酵以玉米淀粉和甘薯淀粉等為原料,原料成本占總成本的30%以上,且存在“與人爭(zhēng)糧,與糧爭(zhēng)地”的突出問(wèn)題,不利于丁醇發(fā)酵工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)丁醇,既可以實(shí)現(xiàn)資源的高效高值轉(zhuǎn)化,還可以減輕過(guò)度使用化石能源導(dǎo)致的能源危機(jī)、環(huán)境污染和溫室效應(yīng)。

秸稈等木質(zhì)纖維素資源是豐富的生物質(zhì)資源,中國(guó)僅玉米秸稈的年產(chǎn)量就達(dá)到2.7億t[4-5]。以秸稈等木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)生物能源和生物基化學(xué)品是資源高效利用的重要途徑[6]。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成,三者之間存在復(fù)雜的化學(xué)鍵連接,形成類(lèi)似鋼筋混凝土式堅(jiān)實(shí)致密的結(jié)構(gòu)。因此,在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化利用過(guò)程中,首先要通過(guò)物理、化學(xué)或生物等預(yù)處理技術(shù)打破細(xì)胞壁抗降解屏障,脫除部分半纖維素、木質(zhì)素以打散細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),增加底物的孔隙率,降低纖維素結(jié)晶度,提高酶對(duì)纖維素的可及性,進(jìn)而提高纖維素酶解效率和生物轉(zhuǎn)化效率[7-9]。

蒸汽爆破預(yù)處理具有設(shè)備投資少、環(huán)境污染小、能耗低等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是最具工業(yè)化應(yīng)用潛力的預(yù)處理技術(shù)之一[10],已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物秸稈、林業(yè)廢棄物和能源作物等預(yù)處理研究。然而,單獨(dú)的蒸汽爆破預(yù)處理仍然存在木質(zhì)纖維素酶解效率偏低的問(wèn)題,近年來(lái)聯(lián)合預(yù)處理技術(shù)逐漸興起。覃錦程等[11]經(jīng)離子液體和蒸汽爆破兩步預(yù)處理后,葡萄糖酶解效率提高到90%以上。LIU等[12]以3種離子液體聯(lián)合蒸汽爆破預(yù)處理水稻秸稈,葡萄糖產(chǎn)率均達(dá)到70%。甘油作為高沸點(diǎn)(290 ℃)有機(jī)溶劑,能夠有效去除半纖維素和木質(zhì)素,選擇性地保留纖維素[13],且甘油自身對(duì)纖維素酶的抑制作用小于離子液體[14]。此外,甘油可被微生物利用進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,減少了回收的難度和成本。WANG等[15]利用甘油協(xié)同蒸汽爆破預(yù)處理技術(shù),將玉米秸稈和甘油按照m(玉米秸稈)∶m(甘油)=1∶0.5進(jìn)行混合預(yù)浸后再進(jìn)行蒸汽爆破預(yù)處理,預(yù)處理玉米秸稈殘?jiān)欣w維素的酶解效率較單獨(dú)蒸汽爆破提高28.2%,該預(yù)處理體系甘油的用量較傳統(tǒng)的甘油預(yù)處理下降90%以上。

巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)CICC10391是一株可以同時(shí)利用葡萄糖和甘油生產(chǎn)丁醇的細(xì)菌。本研究首先比較單獨(dú)蒸汽爆破、水浸潤(rùn)蒸汽爆破、甘油協(xié)同蒸汽爆破和水提-甘油協(xié)同蒸汽爆破對(duì)玉米秸稈三素組成和酶解效率的影響。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)巴氏梭菌CICC10391對(duì)水提-甘油協(xié)同蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸稈水解液進(jìn)行厭氧瓶發(fā)酵生產(chǎn)丁醇,同時(shí)研究玉米漿對(duì)丁醇發(fā)酵的影響,進(jìn)而進(jìn)行5 L發(fā)酵罐擴(kuò)大發(fā)酵試驗(yàn),以期為甘油和玉米秸稈高效轉(zhuǎn)化生物丁醇的工業(yè)生產(chǎn)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

玉米秸稈(corn stover, CS):取自河南省鞏義市;未處理玉米秸稈的三素組分:纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31.1%±0.36%,半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.6%±0.27%,木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.9%±0.9%。玉米秸稈粉碎后過(guò)0.25 mm篩,45 ℃烘干至恒質(zhì)量后密封室溫(25 ℃)保存?zhèn)溆?。分析純?jí)甘油(≥99.7%)和商業(yè)纖維素酶(120 FPU·mL-1)分別購(gòu)自天津富宇精細(xì)化工有限公司和諾維信(中國(guó))生物科技有限公司;無(wú)菌去纖維蛋白羊血、對(duì)氨基苯甲酸、生物素和維生素B1購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;其余試劑購(gòu)自天津市大茂化工試劑廠。

巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)CICC10391,購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器設(shè)備

QBS-200B蒸汽爆破機(jī)(鶴壁正道有限公司);SHG-Ⅲ循環(huán)水真空泵(鞏義市英峪儀器廠);ZQLY-80A恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司);Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司);Agilent 7890A氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)。

1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基(1 L):胰蛋白胨15 g,大豆蛋白胨5 g,NaCl 5 g,121 ℃滅菌15 min,冷卻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%無(wú)菌去纖維蛋白羊血。

強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(reinforced clostridial medium,RCM)(1 L):胰蛋白胨10 g,酵母浸粉3 g,葡萄糖5 g,氯化鈉5 g,半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g,牛肉膏10 g,可溶性淀粉1 g,121 ℃滅菌15 min。

1.4 玉米秸稈水解液的制備

1.4.1 玉米秸稈水提方法 玉米秸稈45 ℃烘干后,按照m(玉米秸稈/g)∶V(去離子水/L)=1∶20加入去離子水,在95 ℃水浴鍋中水提2 h,過(guò)程中不斷攪拌,反應(yīng)完成后稱(chēng)質(zhì)量,把蒸發(fā)掉的水補(bǔ)上,達(dá)到與反應(yīng)前的質(zhì)量一致,然后用循環(huán)水真空泵抽濾固液混合物,使固液分離后,用高效液相色譜測(cè)定液體中糖含量,固體再經(jīng)充分水洗后在45 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量備用。

1.4.2 玉米秸稈預(yù)處理 預(yù)處理?xiàng)l件分為蒸汽爆破(SE)、水浸潤(rùn)蒸汽爆破(WSSE)、甘油協(xié)同蒸汽爆破(GASE)和水提-甘油協(xié)同蒸汽爆破(WE-GASE)4種,具體條件見(jiàn)表1。將玉米秸稈與水混合或甘油水溶液混合后室溫放置12 h,然后在2.0 MPa、保壓時(shí)間150 s條件下進(jìn)行蒸汽爆破。取一部分爆破后的玉米秸稈用自來(lái)水洗至液體無(wú)色,2層紗布過(guò)濾得到水洗后的固體殘?jiān)?45 ℃烘干后根據(jù)美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(National Renewable Energy Laboratory,NREL)制定的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行玉米秸稈的組分分析[16]。

表1 玉米秸稈預(yù)處理?xiàng)l件Table 1 Pretreatment conditions of corn stover

1.4.3 預(yù)處理玉米秸稈的非水洗纖維素酶解 分別用1.4.2預(yù)處理后的玉米秸稈直接進(jìn)行纖維素酶解(酶解前未經(jīng)過(guò)水洗處理),纖維素酶添加量為20 FPU·g-1,用5 mol·L-1NaOH調(diào)pH值至4.8,于48 ℃、180 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱中酶解48 h。采用循環(huán)水真空泵抽濾收集液體,取0.1 mL用去離子水稀釋10倍,利用高效液相色譜測(cè)定水解液中糖和甘油含量,并計(jì)算纖維素酶解效率。

1.5 菌種活化與種子液制備

購(gòu)買(mǎi)的巴氏梭菌CICC10391菌株保存在凍干管中,將其接入到RCM培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)2 d,然后按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入到RCM培養(yǎng)基中,連續(xù)傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)2 d的巴氏梭菌CICC10391菌株培養(yǎng)液以體積分?jǐn)?shù)10%接種量再次轉(zhuǎn)接入RCM培養(yǎng)基,37 ℃厭氧培養(yǎng)1 d后的培養(yǎng)液作為發(fā)酵培養(yǎng)基的種子液。

1.6 含甘油玉米秸稈水解液丁醇發(fā)酵試驗(yàn)

1.6.1 水解液制備與活性炭脫毒 按照1.4.2的方法對(duì)玉米秸稈進(jìn)行水提-甘油協(xié)同蒸汽爆破預(yù)處理,按照1.4.3的方法對(duì)預(yù)處理后的玉米秸稈進(jìn)行酶解,過(guò)濾后得到水解液,然后在水解液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的活性炭,50 ℃水浴鍋中攪拌反應(yīng)1 h,反應(yīng)結(jié)束后抽濾,得到脫毒水解液,用5 mol·L-1NaOH將脫毒水解液pH值調(diào)至6.5,用于發(fā)酵培養(yǎng)基制備。

1.6.2 發(fā)酵培養(yǎng)基制備 在脫毒水解液中加入酵母浸粉1 g·L-1,碳酸鈣7.5 g·L-1,以每瓶45 mL分裝入?yún)捬跗恐?總?cè)莘e65 mL),115 ℃滅菌15 min,冷卻至室溫(25 ℃)后,加入經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾的緩沖液、維生素儲(chǔ)存液和礦質(zhì)元素儲(chǔ)存液(stock solutions)各1 mL。緩沖液含有磷酸二氫鉀25 g·L-1、磷酸氫二鉀25 g·L-1、硫酸銨250 g·L-1;維生素儲(chǔ)存液含有對(duì)氨基苯甲酸0.5 mg·L-1、生物素0.05 mg·L-1、維生素B10.5 mg·L-1;礦質(zhì)元素儲(chǔ)存液含有七水硫酸鎂10 g·L-1、七水硫酸亞鐵5 g·L-1[17]。發(fā)酵初始pH值為6.5。

1.6.3 厭氧瓶發(fā)酵試驗(yàn) 種子液按體積分?jǐn)?shù)10%接種量接入到玉米秸稈水解液發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧發(fā)酵70 h,每隔10 h取樣1 mL,10 000 r·min-1、離心10 min后取上清液于-20 ℃保存,待發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵上清液中底物和產(chǎn)物質(zhì)量濃度,計(jì)算底物利用率和丁醇產(chǎn)生速率。

1.6.4 添加玉米漿對(duì)丁醇發(fā)酵的影響 玉米秸稈水解液發(fā)酵培養(yǎng)基中額外添加2.5 g·L-1玉米漿,按體積分?jǐn)?shù)10%加入種子液,厭氧瓶中發(fā)酵96 h,每隔24 h取樣1 mL,上清液于-20 ℃保存,待發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵上清液中底物和產(chǎn)物質(zhì)量濃度,計(jì)算底物利用率和丁醇產(chǎn)生速率。

1.6.5 5 L發(fā)酵罐擴(kuò)大發(fā)酵試驗(yàn) 每個(gè)發(fā)酵罐中裝2.5 L玉米秸稈水解液發(fā)酵培養(yǎng)基,按體積分?jǐn)?shù)10%加入種子液,轉(zhuǎn)速50 r·min-1,用2 mol·L-1H2SO4和5 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值為6,37 ℃發(fā)酵60 h,每隔10 h用移液管取樣5 mL。-20 ℃保存,待發(fā)酵結(jié)束測(cè)定發(fā)酵上清液中底物和產(chǎn)物質(zhì)量濃度,計(jì)算底物利用率和丁醇產(chǎn)生速率。

1.7 測(cè)定方法

1.7.1 殘?zhí)?、甘油及酸的含量測(cè)定 發(fā)酵過(guò)程中殘留的葡萄糖、木糖和甘油,以及產(chǎn)生的乙酸、丁酸的含量均采用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,RID-10A折射率檢測(cè)器,Aminex HPX-87H柱,柱溫65 ℃,洗脫液為5 mmol H2SO4,流速0.6 mL·min-1,保留時(shí)間25 min。

1.7.2 乙醇、丁醇產(chǎn)量的測(cè)定 發(fā)酵產(chǎn)生的溶劑(乙醇、丁醇)產(chǎn)量使用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,ZB-WAX Plus色譜柱;FID檢測(cè)器,溫度250 ℃;載氣為N2,流速為1.5 L·min-1,H2流速為30 mL·min-1,空氣流速為350 mL·min-1,分流比為20∶1;進(jìn)樣量為0.2 μL,進(jìn)樣口溫度為200 ℃;柱溫箱的起始溫度為45 ℃,保持1 min后以10 ℃·min-1的速率升至55 ℃并保持1 min,再以15 ℃·min-1的速率升至80 ℃并保持0.5 min,最后以20 ℃·min-1的速率升至120 ℃并保持1 min。

1.8 計(jì)算方法

γc=m2/m1×100%

(1)

γh=m4/m3×100%

(2)

γl=m6/m5×100%

(3)

kc= 0.9w/m2×100%

(4)

η=(ρ1-ρ2)/ρ1×100%

(5)

vb=ρb/t×100%

(6)

式中:m1、m3、m5分別為預(yù)處理前玉米秸稈中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的質(zhì)量;m2、m4、m6分別為預(yù)處理后玉米秸稈殘?jiān)欣w維素、半纖維素、木質(zhì)素的質(zhì)量;γc、γh、γl分別為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素回收率;kc為纖維素酶解效率;w為酶解葡萄糖產(chǎn)量;η為底物利用率;ρ1為初始底物質(zhì)量濃度;ρ2為殘留底物質(zhì)量濃度;vb為丁醇產(chǎn)生速率;ρb為丁醇質(zhì)量濃度;t為發(fā)酵時(shí)間。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019和SPSS Statistics 29.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,p<0.05表示差異顯著,采用GraphPad Prism v8.0 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)玉米秸稈固體殘?jiān)亟M成及纖維素酶解效率的影響

2.1.1 不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)玉米秸稈固體殘?jiān)欣w維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的影響 比較單獨(dú)蒸汽爆破(SE)、水浸潤(rùn)蒸汽爆破(WSSE)和甘油協(xié)同蒸汽爆破(GASE)預(yù)處理對(duì)玉米秸稈固體殘?jiān)欣w維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的影響,結(jié)果如表2所示。在3種預(yù)處理?xiàng)l件下,預(yù)處理固體殘?jiān)欣w維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.2%～39.9%,回收率為76.8%～78.5%,三者之間沒(méi)有顯著差異;GASE預(yù)處理?xiàng)l件下,固體殘?jiān)邪肜w維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.4%,回收率為36.1%,顯著低于SE和WSSE預(yù)處理。SE和GASE預(yù)處理?xiàng)l件下木質(zhì)素的回收率均超過(guò)100%,推測(cè)是在蒸汽爆破過(guò)程中固體物料表面有偽木質(zhì)素沉積[18]。

表2 不同預(yù)處理對(duì)玉米秸稈固體殘?jiān)M成及其回收率的影響

為了降低偽木質(zhì)素對(duì)纖維素酶解產(chǎn)生的不利影響,首先對(duì)玉米秸稈進(jìn)行水提,再進(jìn)行甘油協(xié)同蒸汽爆破預(yù)處理(WE-GASE)。在該預(yù)處理?xiàng)l件下固體殘?jiān)欣w維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到43.6%,顯著高于未水提的處理,但是由于水提過(guò)程的物料損失,纖維素的回收率降低為73.2%;固體殘?jiān)心举|(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)由28.6%下降為24.7%,木質(zhì)素的回收率由117.3%下降為86.5%;二者的顯著降低表明水提能夠?qū)⑺苄蕴窍闯?能有效防止可溶性糖在蒸汽爆破預(yù)處理過(guò)程中轉(zhuǎn)化和凝結(jié)在生物質(zhì)表面形成偽木質(zhì)素。

2.1.2 不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)玉米秸稈纖維素酶解的影響 如表3所示,玉米秸稈經(jīng)SE預(yù)處理后進(jìn)行酶解,酶解效率僅為53.1%,酶解葡萄糖產(chǎn)量為165.4 g·kg-1秸稈。經(jīng)WSSE和GASE預(yù)處理后,玉米秸稈纖維素的酶解效率分別提高到59.6%和78.1%,葡萄糖的產(chǎn)量分別達(dá)到179.8和237.2 g·kg-1秸稈,表明GASE可以更有效地提高纖維素的酶解效率和葡萄糖的產(chǎn)量。玉米秸稈經(jīng)WE-GASE預(yù)處理后纖維素酶解效率進(jìn)一步顯著提高,達(dá)到了89.7%,水解液葡萄糖產(chǎn)量254.7 g·kg-1秸稈,較SE預(yù)處理分別提高了68.9%和54.5%;水提過(guò)程中葡萄糖產(chǎn)量26.1 g·kg-1秸稈,WE-GASE預(yù)處理玉米秸稈酶解葡萄糖產(chǎn)量為254.7 g·kg-1秸稈,總葡萄糖產(chǎn)量280.8 g·kg-1秸稈,較SE提高了69.8%。水提-甘油協(xié)同蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸稈效果最好,以該方法對(duì)玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理,預(yù)處理后的玉米秸稈進(jìn)行非水洗酶解制備含甘油玉米秸稈水解液開(kāi)展丁醇發(fā)酵研究。

表3 不同預(yù)處理對(duì)玉米秸稈纖維素酶解效率及葡萄糖產(chǎn)量的影響

2.2 含甘油玉米秸稈水解液的丁醇發(fā)酵研究

2.2.1 含甘油玉米秸稈水解液的厭氧瓶丁醇發(fā)酵 將WE-GASE預(yù)處理玉米秸稈水解液經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的活性炭脫毒后進(jìn)行丁醇發(fā)酵。由圖1-A可知,巴氏梭菌CICC10391可以利用水解液中的葡萄糖和甘油,但不能利用木糖。發(fā)酵結(jié)束后葡萄糖質(zhì)量濃度由初始的28.2降低到7.4 g·L-1,甘油質(zhì)量濃度由27.3降低到15.5 g·L-1,利用率分別達(dá)到73.9%和43.1%。由圖1-B可知,發(fā)酵70 h后丁醇和乙醇的質(zhì)量濃度分別為6.3 和0.6 g·L-1,丁醇產(chǎn)生速率0.09 g·L-1·h-1,乙酸和丁酸的質(zhì)量濃度分別為3.6和5.6 g·L-1。丁醇發(fā)酵產(chǎn)生速率較低,推測(cè)與發(fā)酵過(guò)程中丁酸的質(zhì)量濃度過(guò)高有關(guān),丁酸積累過(guò)多,使菌株生長(zhǎng)受到抑制,同時(shí)抑制丁酸轉(zhuǎn)化為丁醇。

A:底物利用質(zhì)量濃度;B:產(chǎn)物生成質(zhì)量濃度。下同。

2.2.2 玉米漿對(duì)含甘油玉米秸稈水解液丁醇發(fā)酵的影響 在上述研究基礎(chǔ)上,在WE-GASE預(yù)處理玉米秸稈水解液中額外添加質(zhì)量濃度為2.5 g·L-1的玉米漿干粉,探究玉米漿對(duì)丁醇發(fā)酵的影響。由圖2-A可知,發(fā)酵96 h,葡萄糖質(zhì)量濃度由初始的29.8降低到3.8 g·L-1,利用率達(dá)到87.2%;木糖質(zhì)量濃度由7.9降低到6.0 g·L-1,利用率為24.1%;甘油質(zhì)量濃度由34.3 g·L-1降低到16.7 g·L-1,利用率為51.3%。由圖2-B可知,發(fā)酵72 h時(shí)丁醇和乙醇的質(zhì)量濃度分別達(dá)到了8.2 和2.1 g·L-1,丁醇產(chǎn)生速率0.11 g·L-1·h-1,乙酸和丁酸質(zhì)量濃度分別為3.1 和5.1 g·L-1,相比未添加玉米漿的發(fā)酵碳源利用率和丁醇質(zhì)量濃度均顯著提高,而乙酸丁酸維持較高水平。

圖2 玉米漿對(duì)含甘油玉米秸稈水解液丁醇發(fā)酵過(guò)程中底物利用與產(chǎn)物生成的影響

2.2.3 含甘油玉米秸稈水解液的發(fā)酵罐丁醇發(fā)酵 WE-GASE預(yù)處理玉米秸稈水解液發(fā)酵中產(chǎn)酸較多會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液pH值失衡。為有效控制發(fā)酵液pH,采用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行含甘油玉米秸稈水解液丁醇發(fā)酵。水解液經(jīng)活性炭脫毒且玉米漿添加量為2.5 g·L-1,發(fā)酵pH值控制在6.0。由圖3-A可知,發(fā)酵50 h葡萄糖消耗完畢,木糖質(zhì)量濃度由8.8降低到7.9 g·L-1,基本無(wú)變化,甘油質(zhì)量濃度由30.8降低到6.5 g·L-1,葡萄糖和甘油的利用率進(jìn)一步提高,分別達(dá)到100.0%和78.9%,且發(fā)酵周期明顯縮短。由圖3-B可知,此時(shí)產(chǎn)物中丁醇和乙醇的質(zhì)量濃度分別達(dá)到7.3 和1.2 g·L-1,丁醇的產(chǎn)生速率為0.15 g·L-1·h-1,乙酸和丁酸的質(zhì)量濃度分別為4.0和2.4 g·L-1。

圖3 5 L發(fā)酵罐中含甘油玉米秸稈水解液丁醇發(fā)酵的底物利用和產(chǎn)物生成情況

3 結(jié)論與討論

為避免出現(xiàn)“與人爭(zhēng)糧”等問(wèn)題,以木質(zhì)纖維素材料作為發(fā)酵底物生產(chǎn)丁醇成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。復(fù)雜的木質(zhì)素和半纖維素交聯(lián)結(jié)構(gòu)阻止了微生物直接利用纖維素,因此利用秸稈等作為發(fā)酵原料時(shí)需要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理[19-20]。XU等[21]運(yùn)用離子液體經(jīng)兩步法先后將氫氧化膽堿C5H15NO2和1-乙基-3-甲基咪唑二甲基苯酚([Emin][DMP])用于預(yù)處理玉米秸稈,最終木質(zhì)素脫除率77.28%,纖維素溶解度達(dá)到52.14%。HU等[22]將乙?；x子液體用于竹子的半纖維素溶解,發(fā)現(xiàn)溶解度受溫度影響很大,隨溫度升高溶解度增大。雖然使用離子液體進(jìn)行預(yù)處理的研究較多,但仍需要進(jìn)一步探索條件及優(yōu)化效果,且成本較高[23],限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

本研究首先對(duì)比了不同預(yù)處理?xiàng)l件下進(jìn)行蒸汽爆破對(duì)玉米秸稈酶解的影響,與單獨(dú)蒸汽爆破預(yù)處理后纖維素酶解效率53.1%、葡萄糖產(chǎn)量165.4 g·kg-1秸稈相比,玉米秸稈經(jīng)過(guò)水提并按照m(秸稈/g)∶m(甘油/g)∶v(水/L)=1∶0.4∶0.1進(jìn)行甘油協(xié)同蒸汽爆破后,纖維素的酶解效率達(dá)到89.7%,葡萄糖產(chǎn)量254.7 g·kg-1,較單獨(dú)蒸汽爆破預(yù)處理分別提高68.9%和54.5%,這表明水提-甘油協(xié)同蒸汽爆破可以有效提高纖維素的酶解效率和葡萄糖的產(chǎn)量。WANG等[15]按照m(秸稈)∶m(甘油)=1∶0.5進(jìn)行甘油協(xié)同蒸汽爆破時(shí),酶解效率為68.1%,相比之下,本研究進(jìn)一步減少了甘油的用量,且纖維素酶解效率有一定提高。甘油協(xié)同蒸汽爆破預(yù)處理過(guò)程中甘油的回收率為70%。甘油回收率低的原因主要有兩個(gè):一是因?yàn)楦视蛥f(xié)同蒸汽爆破預(yù)處理后物料中甘油和水含量較高,回收過(guò)程中甘油隨液體流失;二是蒸汽爆破過(guò)程中甘油與小分子糖類(lèi)尤其是木糖發(fā)生糖苷化反應(yīng),生成甘油葡萄糖苷或甘油木糖苷[24],但殘留的甘油與糖共同被微生物利用生產(chǎn)生物燃料和生物基化學(xué)品,如1,3-丙二醇[25-26]、乙醇、2,3-丁二醇和微生物油脂等[27],有效避免了有機(jī)溶劑回收難、環(huán)境污染重等問(wèn)題。

玉米秸稈經(jīng)水提和甘油協(xié)同蒸汽爆破預(yù)處理的水解液中含有大量木質(zhì)纖維素降解副產(chǎn)物,如糠醛、5-HMF、有機(jī)酸和酚類(lèi)等有毒物質(zhì),不利于菌株的生長(zhǎng)代謝[28],需要通過(guò)物理化學(xué)方法(如活性炭吸附、overliming、水洗等[29])對(duì)預(yù)處理水解液進(jìn)行脫毒以降低水解液中有毒物質(zhì)的含量。有研究報(bào)道玉米漿能夠提高微生物菌株對(duì)有毒物質(zhì)的耐受能力[30]。本研究在利用活性炭對(duì)水解液脫毒后添加玉米漿進(jìn)行丁醇發(fā)酵,發(fā)酵72 h產(chǎn)物丁醇和乙醇的質(zhì)量濃度分別為8.2和2.0 g·L-1,但發(fā)酵液中乙酸和丁酸濃度較高,容易引發(fā)“酸崩潰”[31]。在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行含甘油玉米秸稈水解液丁醇發(fā)酵,控制發(fā)酵液pH值為6.0,實(shí)現(xiàn)了水提-甘油協(xié)同蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸稈水解液高效生產(chǎn)丁醇,經(jīng)50 h發(fā)酵后葡萄糖和甘油利用率分別達(dá)到100.0%和78.9%,丁醇質(zhì)量濃度達(dá)到7.3 g·L-1。

本研究通過(guò)水提顯著提高了玉米秸稈甘油協(xié)同蒸汽爆破預(yù)處理效果,實(shí)現(xiàn)了預(yù)處理玉米秸稈的高效酶解,水解液中甘油和葡萄糖同時(shí)被微生物菌株利用生產(chǎn)丁醇,解決了預(yù)處理過(guò)程中甘油回收難、成本高等難題,為玉米秸稈和生物柴油副產(chǎn)物甘油的高值轉(zhuǎn)化提供了新的思路。