卵巢癌中PARP 抑制劑的耐藥機制及提高其敏感性的聯(lián)合治療策略

李賓，吝歡歡，韓飛飛，田美玲，段愛紅，柯小寧

卵巢癌是婦科三大常見惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤之首[1]。由于缺乏典型的早期癥狀及有效的篩查手段，約70%的患者在診斷時已為晚期，5 年生存率僅約30%[2]。目前公認的一線治療方案是手術和含鉑化療，但長期效果并不滿意，超過70%的患者在2 年內復發(fā)[2]。近年來，維持治療已成為延長治療反應時間和疾病復發(fā)間期的重要策略[3]。多項臨床試驗證實多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑[poly(ADP-ribose)polymerase inhibitor，PARPi]可使卵巢癌患者獲益[4-5]，為卵巢癌的治療開啟了新篇章。盡管已證實PARPi 可以延長卵巢癌患者的無進展生存期，但癌細胞不可避免地會產生耐藥性，這成為PARPi長期使用的障礙。因此，迫切需要對PARPi 的作用機制和耐藥機制進行研究，以期克服PARPi 的耐藥性并提高其敏感性?，F(xiàn)就PARPi 的作用機制、潛在耐藥機制及提高PARPi 敏感性的策略進行綜述。

1 PARP 概述

PARP 是一類催化靶蛋白或其自身ADP-核糖基化的細胞核酶，在DNA 單鏈斷裂（single-strand breakage，SSB）的堿基切除修復（base excision repair，BER）中發(fā)揮至關重要的作用。目前已知的PARP 家族由18 個成員組成，其中PARP1 是最重要的酶，占細胞內PARP 總活性的85%～90%。PARP1 參與DNA 修復、維持基因組完整性和DNA 復制叉的穩(wěn)定以及染色質重塑等，是該家族中研究最多的成員[6]。當感應到SSB 信號后，PARP1 的鋅指結構域迅速識別并結合在損傷位點，構象改變并激活PARP1 催化活性，催化β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-nicotinamide adenine dinucleotide，β-NAD+）分解為ADP-核糖和煙酰胺，然后以分解產生的ADP-核糖為底物，使核受體蛋白（包括PARP1 自身、DNA 修復因子、組蛋白以及各種轉錄因子等）發(fā)生多ADP-核糖基化修飾[Poly(ADP-ribosyl)ation，PARylation]，然后進一步募集下游DNA 損傷修復相關蛋白[如XRCC1、DNA連接酶3 和DNA 聚合酶θ（DNA polymerase θ，Polθ）等]迅速遷移至損傷部位，重塑受損DNA 的染色質結構，從而有效修復SSB[6]。由于負電荷大量蓄積，導致PARP1 從DNA 上解離下來，解離下來的PARPADP 聚合物在多ADP-核糖水解酶 [poly (ADPribose)glycohydrolase，PARG]作用下被裂解。裂解后的ADP-核糖可重新用于合成β-NAD+，而重新形成單體的PARP1 可被再次激活，循環(huán)作用于DNA 損傷位點，完成DNA 損傷修復，這一過程即為PARP1催化循環(huán)[6]。

2 PARPi 的作用機制

2.1 酶促抑制PARP1 的酶活性可被PARPi 靶向抑制，使之不能通過PARylation 進一步募集DNA 損傷修復相關蛋白發(fā)揮作用[6]。PARPi 干擾SSB 的修復，導致未修復的SSB 積累，持久的SSB 未能及時修復糾正使DNA 復制叉停滯或減速，轉化為高度細胞毒性的DNA 雙鏈斷裂（double-strand breakage，DSB）。正常情況下，同源重組修復（homologous recombination repair，HRR）可高保真修復DSB，使細胞存活，而乳腺癌相關基因（breast cancer-related gene，BRCA）缺陷或同源重組缺陷（homologous recombination deficiency，HRD）的腫瘤細胞則不能通過HRR 進行修復，需啟動非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）進行修復，引起基因組不穩(wěn)定，從而殺傷腫瘤細胞。以上即為PARPi 與BRCA 缺陷（或HRD）聯(lián)合的合成致死的基本原理，推動了PARPi 在臨床治療中的應用，并且在多項臨床試驗中使卵巢癌患者獲益，其已經應用于卵巢癌的一線和二線維持治療。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）獲批上市的PARPi 有奧拉帕利（Olaparib，2014）、魯卡帕利（Rucaparib，2016）、尼拉帕利（Niraparib，2017）和他拉唑帕利（Talazoparib，2018）。

2.2 PARP“捕獲”（PARP trapping）隨著對PARPi 的深入研究，發(fā)現(xiàn)其作用機制不局限于通過競爭性結合PARP 的催化結構域活性位點，阻斷和抑制PARP 酶活性。越來越多的研究認為PARPi 可干擾PARP 發(fā)生PARylation，使其不能從DNA 上解離，而將PARP“捕獲”于DNA 損傷位點，穩(wěn)定的PARP-DNA 復合物可抑制SSB 修復，并使停滯的DNA復制叉降解為DSB，從而比酶促抑制能更有效地殺傷癌細胞[7]。相關研究表明，PARPi 引起的PARP“捕獲”造成的細胞毒性高于單純的PARP 缺失或功能抑制[8]。然而，雖然已顯示出相同的抑制PARP 催化活性的能力，但是目前也并非所有臨床階段的PARPi 都具有相同的PARP“捕獲”活性?！安东@”PARP 的能力與每種藥物殺傷癌細胞的能力密切相關，目前臨床上的PARPi 可根據其“捕獲”PARP 的能力和細胞毒性效力進行排名（從最強到最弱）：他拉唑帕利＞＞尼拉帕利＞奧拉帕利=魯卡帕利＞＞維利帕尼（Veliparib，未上市）[8-9]。

3 PARPi 的耐藥機制

盡管PARPi 治療已取得一定效果，但隨著臨床實踐中越來越多的應用不可避免地引發(fā)了PARPi的耐藥性問題，以及隨之而來的疾病復發(fā)和患者預后不良。較多研究探索了PARPi 獲得性耐藥的機制，包括HRR 恢復、DNA 復制叉保護、PARP“捕獲”減少及藥物外排增加等。然而目前其具體機制仍未完全闡明，且同一個體可能存在多種機制并隨著時間的推移而變化，PARPi 在臨床應用中仍具有挑戰(zhàn)。

3.1 HRR 恢復PARPi 最常見的獲得性耐藥機制是HRD 腫瘤中HRR 的恢復[10]。HRR 的恢復可通過HRR 相關蛋白表達的恢復或對HRR 途徑抑制作用的減弱，從而減少基因組的不穩(wěn)定性和復制壓力。其中，體細胞回復突變是恢復HRR 相關蛋白表達最典型的方式。體細胞回復突變即體細胞移碼突變或無義突變的腫瘤中恢復HRR 相關基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF），導致功能性蛋白質的重新表達，從而部分恢復HRR[11]。除BRCA1/2 基因外，體細胞回復突變還發(fā)生在多個其他HRR 相關基因中，如RAD51C、RAD51D 和PALB2[12]。另外，BRCA1啟動子區(qū)去甲基化可導致因甲基化表觀遺傳學沉默的BRCA1 蛋白的重新表達[11]。此外，BRCA1 外顯子11 中的移碼突變可能產生BRCA1 蛋白亞型（BRCA1-δ11q），仍然具有部分殘留活性，可導致PARPi 的部分耐藥性[13]。

恢復HRR 的另一種機制是BRCA 缺陷癌細胞中DNA 損傷反應的重新選擇，即通過下調NHEJ，減少對HRR 途徑的抑制[11，14]。HRR 和NHEJ 競爭性修復DSB，正常情況下BRCA1 蛋白通過抑制p53 結合蛋白1（p53-binding protein 1，53BP1）啟動HRR，BRCA1 蛋白的缺失會阻止53BP1 從DNA 末端釋放并招募相關因子（RIF1、REV7 和shieldin），通過保護DNA 末端啟動NHEJ。53BP1 及相關因子的功能喪失將導致DNA 末端切除，使RAD51 在缺乏BRCA1蛋白的情況下被募集并恢復HRR，從而使癌細胞對PARPi 產生耐藥性。

3.2 DNA 復制叉保護DNA 復制叉的穩(wěn)定性是誘導PARPi 耐藥的機制之一。在DNA 復制過程中，Pax 轉錄激活結構域互作蛋白（Pax transactivation domain-interacting protein，PTIP）和Zeste 基因增強子同源物2（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）負責募集核酸酶MRE11 和MUS81，使得PARP1 和BRCA1/2 蛋白保護停滯復制叉處的新生DNA 不被核酸酶降解[14-15]。然而，在BRCA 缺陷的癌細胞中，EZH2 和PTIP 活性在復制叉處受到限制，從而減少核酸酶的募集并導致復制叉保護。此外，已證明染色質重塑因子SMARCAL1、ZRANB3 和HLTF 是MRE11依賴性復制叉降解所必需的，BRCA 缺陷的癌細胞中這些因子的缺失可保護復制叉免受降解[15]。可見，PARPi 可使未受保護的復制叉崩解，復制叉保護則導致PARPi 耐藥。

3.3 PARP“捕獲”減少PARP1 突變和PARG 的缺失使PARP1 的“捕獲”減少，從而引起對PARPi 的耐藥[11,16]。研究發(fā)現(xiàn)一種常見于PARPi 耐藥患者腫瘤樣本中的PARP1 突變（R591C），這與PARP1 在DNA上的“捕獲”減少有關，從而導致PARPi 耐藥[17]。PARG 可逆轉PARylation，防止多ADP-核糖積累，因此，PARG 與PARPi 協(xié)同發(fā)揮作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)，在PARPi 處理的BRCA2 缺陷的乳腺癌細胞中，阻斷細胞PARG 的表達引起多ADP-核糖積累，從而通過增加PARP1 依賴性DNA 損傷修復來減少PARP1 在DNA 上的“捕獲”，導致PARPi 耐藥；另外，在漿液性卵巢癌和三陰性乳腺癌組織中均發(fā)現(xiàn)了PARG 陰性表達[18]。推測卵巢癌可能也通過這種機制導致耐藥，有助于患者PARPi 耐藥性的預測。

3.4 藥物外排增加目前普遍認為編碼藥物外排泵P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的ABCB1 基因的過度表達是不同類別藥物化療耐藥的常見機制[19]。腫瘤細胞通過增加藥物外排泵的數量促進藥物外排，降低細胞內藥物濃度，從而減弱藥物的治療作用，產生耐藥性。已在PARPi 耐藥的卵巢癌細胞系中觀察到P-gp 的過度表達，并且PARPi 與P-gp抑制劑Tariquidar 的共同治療可恢復腫瘤細胞對PARPi 的敏感性[16,20]。提示P-gp 可能是增加PARPi敏感性的一個重要靶點。

3.5 其他①信號通路失調：已報道細胞間質表皮轉化因子（cellular mesenchymal to epithelial transition factor，c-MET）、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、共濟失調毛細血管擴張突變基因（ataxia telangiectasia mutated gene，ATM）/ATM 和Rad3 相關蛋白激酶（ATM and Rad3 related kinase，ATR）等信號通路的異常調節(jié)與PARPi 耐藥有關[11，14-15]。受體酪氨酸激酶c-MET 可直接磷酸化PARP1，激活PARP1 酶活性，降低與PARPi 的結合親和力，從而誘導PARPi 耐藥性[21]。另外，PARPi 可激活PI3K/Akt 通路，進而激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），導致BRCA1、RAD50、RAD51 和FANC2 的表達增加，誘導細胞凋亡抵抗和線粒體保護，從而促進腫瘤細胞生長和增殖[22]。ATM 和ATR是DNA 損傷反應途徑中的重要因子，主要負責募集組蛋白H2A 和DNA 修復復合物，ATM/ATR 通路的激活可通過恢復HRR 導致PARPi 耐藥[23]。②細胞周期控制的改變：細胞周期調節(jié)因子如細胞周期蛋白依賴性激酶12（cyclin-dependent kinases 12，CDK12）可以調節(jié)DNA 損傷修復基因的轉錄；WEE1 作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以通過抑制CDK1 和CDK2 的活性將細胞周期阻滯在G2/M 期，為DNA修復提供時間。研究發(fā)現(xiàn)，CDK12 和WEE1 的過度表達可通過恢復HRR，促進PARPi 耐藥性[16,24]。③微小RNA（microRNA，miRNA）：多項研究發(fā)現(xiàn)miRNA與PARPi 耐藥性有關，如miR-622 通過直接抑制NHEJ 途徑中Ku70/80 異二聚體的表達，促進HRR修復，誘導PARPi 耐藥[25]。此外，拮抗miR-182 可使BRCA1 蛋白表達升高，通過促進HRR 誘導PARPi耐藥[26]。

4 提高PARPi 敏感性的策略

以上PARPi 的作用機制和耐藥機制為克服PARPi 耐藥和提高敏感性提供了理論基礎。通過針對特定耐藥機制的抑制，藥物的聯(lián)合治療策略有可能預防和對抗PARPi 的耐藥性，從而提高PARPi 的敏感性和抗腫瘤作用。目前正在研究的主要的聯(lián)合治療策略如下。①聯(lián)合抗血管生成藥物：PARPi 和抗血管生成藥物可能是上皮性卵巢癌中評估最多的組合[16,19]，主要的抗血管生成藥物有貝伐珠單抗和西地尼布?？寡苌伤幬锟梢鸺毎毖?，誘導HRR信號通路下調，導致HRD。對于PARPi 維持治療后腫瘤進展的卵巢癌患者，抗血管生成藥物與PARPi聯(lián)合使用可能會帶來一些臨床益處[27]。盡管該組合的潛在機制仍未完全清晰，但現(xiàn)有研究顯示PARPi和抗血管生成藥物之間具有協(xié)同作用。②聯(lián)合細胞周期檢查點蛋白抑制劑：主要包括ATR、CHK1 和WEE1 抑制劑[11]。PARPi 與細胞周期檢查點蛋白抑制劑相結合可以最大限度地增加細胞周期G1 期和S期的損傷累積，并通過最小化修復時間來抑制G2期的修復，從而增加DNA 損傷并導致細胞死亡，二者具有協(xié)同作用，可應用于HRR 恢復和DNA 復制叉保護引起的耐藥。③聯(lián)合PI3K/Akt/mTOR 通路抑制劑：PI3K/Akt/mTOR 通路在高級別漿液性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PARPi 和PI3K/Akt/mTOR 通路抑制劑聯(lián)合應用可誘導HRD 為中心的多種機制，二者具有協(xié)同作用。如PI3K 抑制劑可下調BRCA1/2 表達并誘導HRD[16]；mTOR 抑制劑可抑制DSB 修復蛋白SUV39H1，同時抑制HRR 相關基因表達[28]。④聯(lián)合Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）/細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路抑制劑：Ras/Raf/MEK/ERK 通路激活后參與BRCA1 的轉錄調控。MEK 抑制劑的基本原理為誘導HRD、降低DNA 損傷檢查點活性和促進細胞凋亡。PARPi 和Ras/Raf/MEK/ERK 通路抑制劑協(xié)同作用，通過增加DNA 損傷和細胞凋亡提高卵巢癌細胞對PARPi 的敏感性[19]。⑤聯(lián)合表觀遺傳修飾劑：表觀遺傳學修飾劑主要有溴結構域和超末端結構域（bromodomain and extraterminal domain，BET）抑制劑和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑。細胞系和異種移植卵巢癌模型的臨床前數據均表明，抑制BET 和HDAC 可以通過增強PARP 相關的DNA 損傷，減少BRCA1 蛋白表達，以及通過破壞復制叉進程增加基因組不穩(wěn)定性，誘導HRD，從而增強PARPi 的活性[29]。然而，這些藥物的臨床前景因血液學毒性受到限制。⑥抑制藥物外排：由于藥物外排泵P-gp 在PARPi 耐藥卵巢癌細胞中過度表達，PARPi 和外排泵抑制劑Tariquidar 的聯(lián)合治療可恢復卵巢癌細胞對PARPi 的敏感性[20]。另外，研發(fā)高選擇性PARPi 可以避免這種耐藥機制并克服耐藥性。⑦聯(lián)合免疫治療：該聯(lián)合治療策略的基本原理基于兩個假設，其一，PARPi 治療HRD 的卵巢癌具有更高的腫瘤突變負荷，導致腫瘤新抗原負荷升高，刺激抗腫瘤免疫反應增強，即PARPi 通過提高突變負荷來增加患者對免疫治療的敏感性；其二，PARPi 治療可通過激活干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）通路激活先天免疫反應，并可上調程序性死亡受體配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表達，PARPi 聯(lián)合免疫治療可增強抗腫瘤作用[19]。Ⅱ期臨床試驗表明，PARPi 和抗PD-L1 抗體度伐利尤單抗（Durvalumab）聯(lián)合使用對胚系BRCA1/2 突變的乳腺癌和卵巢癌均表現(xiàn)出良好的反應[16]。此外，目前該聯(lián)合治療策略對新診斷和復發(fā)（鉑敏感或耐藥）卵巢癌患者的療效的相關臨床試驗仍在進行中。⑧聯(lián)合Polθ 抑制劑：HRD 腫瘤細胞的修復依賴于替代NHEJ（aNHEJ），包括微同源介導的末端連接（MMEJ）。Polθ 在卵巢癌中表達上調并通過MMEJ 修復DSB[11]。新生霉素可抑制Polθ 的ATP 酶活性，引起DNA 損傷和細胞死亡，從而增強PARPi 活性。有研究發(fā)現(xiàn)，Polθ 的小分子抑制劑ART558 可抑制MMEJ 修復過程，在BRCA1/2 突變細胞（包括卵巢癌和乳腺癌細胞）中引起DNA 損傷和合成致死效應，并增強PARPi的作用[30]。因此，Polθ 抑制可能是卵巢癌藥物治療的潛在策略，可與PARPi 聯(lián)合或單獨應用。

5 結語與展望

目前越來越多的卵巢癌患者可以通過PARPi維持治療獲益，然而，耐藥性問題成為其臨床應用的障礙。PARPi 耐藥性是由多種機制引起的，且在同一個體中可能存在多種耐藥機制。因此，PARPi 耐藥性在臨床治療中可能與臨床前研究不同，需要更多的臨床樣本和研究來進一步確定更全面的PARPi 耐藥機制。藥物的聯(lián)合治療策略可能有助于改善PARPi 的耐藥性，提高其敏感性，但仍需要更多研究證實。另外，哪種聯(lián)合治療策略可使患者獲益最大、聯(lián)合用藥是否會產生更多的毒副作用、患者能否承受多種藥物的經濟壓力，這些都是臨床關注的熱點問題，有待更多研究明確。