寧夏地區(qū)枸杞及其他寄主白粉病病原菌及葉際真菌鑒定

摘 要：為明確寧夏枸杞白粉病病原菌及葉際真菌種類，在寧夏不同地區(qū)采集枸杞及周邊其他寄主白粉病發(fā)病葉片，利用ITS擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)鑒定不同寄主白粉病病原菌種類及發(fā)病葉片葉際真菌多樣性。結(jié)果表明：各樣本真菌群落豐富，共鑒定出19種已知真菌，Shannon指數(shù)為1.5～4.0，其中枸杞白粉病樣本組間差異較小，不同寄主白粉病樣本組間差異較大；鑒定出枸杞白粉病病原菌為節(jié)絲殼屬穆氏節(jié)絲殼（Arthrocladiella mougeotii），西葫蘆白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii），以薺菜和‘中國(guó)枸杞’為寄主的白粉病病原菌為十字花科白粉菌（Erysiphe cruciferarum），全部白粉病樣本中均伴隨白粉菌的重寄生菌白粉寄生孢（Ampelomyces quisqualis）。

關(guān)鍵詞：枸杞； 白粉??； 擴(kuò)增子測(cè)序； 葉際真菌

中圖分類號(hào)：S567.19； S435.671" "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " 文章編號(hào)：1002-204X（2023）10-0042-07

doi：10.3969/j.issn.1002-204x.2023.10.011

Identification of Pathogen and Phyllophyte Fungi of Lycium barbarum

and other Hosts of Powdery Mildew in Ningxia

Nie Fengjie1， Li Yunxiang2*

（1.Research Center of Agricultural Biotechnology， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Yinchuan， Ningxia 750002; 2.Institute of Plant Protection， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Yinchuan， Ningxia 750002）

Abstract In order to identify the species of powdery mildew pathogen and the diversity of phyllophyte fungi in Ningxia， Lycium barbarum and other host leaves with powdery mildew were collected from different regions of Ningxia in 2022， and the species of pathogen and the diversity of phyllophyte in the affected leaves were identified by amplified ITS sequencing technology. The results showed that the fungal community was abundant in all samples， 19 known fungi appeared in all samples， and the Shannon index was between 1.5 and 4.0. The difference between the powdery mildew samples of Lycium barbarum was small， and the difference between the powdery mildew samples of different hosts was large. Arthrocladiella mougeotii was identified as the pathogen of powdery mildew of wolfberry， and Podosphaera xanthii was identified as the pathogen of powdery mildew of zucchini. Erysiphe cruciferarum was the pathogen in the samples of shepherd's purse and 'Chinese wolfberry'. Ampelomyces quisqualis， a hyperparasitism fungus was found in all the samples of powdery mildew.

Key words Lycium barbarum; Mildew; Amplicon sequencing; Phyllotropic fungi

寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）種植歷史悠久，因其優(yōu)質(zhì)品質(zhì)和獨(dú)特風(fēng)味聞名于世。寧夏枸杞富含多種維生素、礦物質(zhì)和氨基酸，尤其是維生素C、維生素E含量較高，還含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)和多種生物活性物質(zhì)[1-2]，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、養(yǎng)肝護(hù)肝、提高免疫力等功效[3-4]，被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域。枸杞白粉病是枸杞植株受到真菌感染引起的一種病害，在枸杞產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，主要是在枸杞葉片、莖部和果實(shí)表面形成白色或灰白色的粉狀物質(zhì)，影響葉片光合作用，導(dǎo)致植株無(wú)法正常進(jìn)行養(yǎng)分合成和生長(zhǎng)，葉片因?yàn)椴≡那趾ψ凕S、枯萎甚至死亡[5]。白粉病菌通過(guò)風(fēng)、水、昆蟲(chóng)等多種途徑傳播，一旦受到感染，病害極易迅速蔓延，進(jìn)一步加劇病害的危害程度，嚴(yán)重影響枸杞產(chǎn)量和品質(zhì)。

白粉病是由活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌引起的病害，病原菌與大量微生物共存于寄主葉際。葉際微生物是一個(gè)非常龐大、多樣性豐富的群體，目前已發(fā)現(xiàn)病原菌有細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌、藻類、線蟲(chóng)和一些原生動(dòng)物等[6]。受環(huán)境和植物本身生理特性影響，不同植物葉際微生物有所不同，包括侵染植物的病原菌、通過(guò)養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)和拮抗作用抑制病原菌生長(zhǎng)的菌株[7-8]，以及具有固氮、消化等作用促進(jìn)植物生長(zhǎng)的菌株[9]等。不同葉際微生物對(duì)寄主植物作用不同，因此，葉際微生物菌群平衡和植物健康息息相關(guān)。

傳統(tǒng)的葉際微生物鑒定方法包括顯微技術(shù)觀察微生物特征分類[10]、純培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)、生理生化特征測(cè)定等[11-13]。據(jù)報(bào)道，目前環(huán)境微生物中能夠?qū)崿F(xiàn)人工分離并獲得純培養(yǎng)的占比很小，只有0.1%～3.0%的環(huán)境細(xì)菌被認(rèn)為是可培養(yǎng)的[14]。因此，通過(guò)傳統(tǒng)分離鑒定方法無(wú)法展示葉際微生物群落的全貌。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，高通量的擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)（Amplicon sequencing）被廣泛應(yīng)用于食品科學(xué)、微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、疾病診斷和基因組學(xué)等領(lǐng)域[15-17]，其基于PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)，通過(guò)引物擴(kuò)增目標(biāo)片段，對(duì)特定DNA或RNA片段進(jìn)行測(cè)序，具有高通量、高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)。對(duì)于環(huán)境微生物多樣性研究，高通量測(cè)序技術(shù)不僅可以檢測(cè)致病菌的存在，同時(shí)可提供更加全面和精準(zhǔn)的微生物分類信息，準(zhǔn)確了解微生物的組成和功能。

目前，寧夏地區(qū)枸杞白粉病病原菌缺乏系統(tǒng)性研究。為明確寧夏枸杞白粉病病原菌種類及葉際微生物多樣性，在寧夏不同枸杞種植基地系統(tǒng)開(kāi)展白粉病發(fā)生調(diào)查研究，利用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)鑒定寧夏枸杞白粉菌種類，發(fā)病葉片葉際真菌多樣性，以期為指導(dǎo)病害防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品：2022年在寧夏不同地區(qū)采集枸杞及周邊其他寄主白粉病發(fā)病葉片，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

試劑和儀器：Fungal DNA提取試劑盒，Omega Bio-Tek公司生產(chǎn)；Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒；Eppendore 5810R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendore公司生產(chǎn)；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Therom公司生產(chǎn)；Applied Biosystems 2720 thermal cycler PCR儀、Applied Biosystems 3730XL測(cè)序儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)；君意JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng)及君意JY300C Power Supply電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用Fungal DNA提取試劑盒，完成供試樣品DNA提取，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)檢測(cè)合格后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

25 μL擴(kuò)增體系：DNA 30 ng，5 uM正反向引物各1 μL，2 ng/μL BSA 3 μL，2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

擴(kuò)增引物序列：

ITS1：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；

ITS2：TGCGTTCTTCATCGATGC。

反應(yīng)程序：94 ℃模板預(yù)變性5 min，94 ℃模板 DNA變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.2.3 擴(kuò)增子測(cè)序

PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的條帶大小，并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫(kù)，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理得到有效數(shù)據(jù)，然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，基于OTU聚類結(jié)果利用mothur做rarefaction分析，用來(lái)比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度；利用mothur計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的shannon值，反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性；利用qiime2 diversity軟件評(píng)估樣品的Alpha多樣性；采用主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis）評(píng)估樣本Bate多樣性；基于Unweighted Unifrac距離矩陣，UPGMA方法聚類建樹(shù)，并將聚類結(jié)果與各樣品在門(mén)、綱、目、科、屬水平上的物種相對(duì)豐度整合展示。采用SPSS 20.0 One-Way ANOVE程序?qū)z測(cè)結(jié)果進(jìn)行Duncan氏差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控及OTU基礎(chǔ)分析

21個(gè)樣本提取基因組DNA，以ITS序列特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1），擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，構(gòu)建Miseq文庫(kù)，上機(jī)測(cè)序。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)控及OTU基礎(chǔ)分析，表明21個(gè)樣本共產(chǎn)生779個(gè)OTU，經(jīng)過(guò)抽平處理剩余706個(gè)。單個(gè)樣本OTU數(shù)目見(jiàn)圖2。所有樣本Q1～Q21共有OTU為31個(gè)，各樣本特有OTU數(shù)目在97～290個(gè)（圖2-A）。其中Q14最少，為97個(gè)；Q5最多，為290個(gè)。

2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析可反映樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性。從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體，并以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建稀釋性曲線（Rarefaction curve）（圖2-B），結(jié)果表明當(dāng)測(cè)序序列數(shù)達(dá)到30 000條時(shí)，稀釋曲線趨向平坦，OTU的數(shù)目接近飽和，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理、足夠反應(yīng)樣本菌群的多樣性情況。使用Qiime軟件計(jì)算，獲得21個(gè)樣本的Alpha多樣性指數(shù)（圖3）。其中，菌種豐富度指數(shù)（Chao1）表明，21個(gè)樣本群落中OTU數(shù)目在200～410個(gè)（圖3-A），樣本Q3群落中OTU最多，達(dá)400個(gè)以上；樣本Q4群落中OTU最少，接近200個(gè)。隨著測(cè)序深度的增加，21個(gè)樣本實(shí)際觀測(cè)物種數(shù)（Observed species）OTU的數(shù)目達(dá)到300個(gè)以上（圖3-B），其中Q5觀測(cè)物種數(shù)最多，為300個(gè)以上；Q14最少，為100個(gè)以下。譜系多樣性（PD_whole_tree）是基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)計(jì)算，兼顧樣本物種豐度以及進(jìn)化距離的一種多樣性指數(shù)，21個(gè)樣本中OTUs的代表序列構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的距離在15～40（圖3-C）。其中Q5譜系多樣性指數(shù)最大，接近40，表明群落多樣性最高；Q19譜系多樣性指數(shù)最小，為15，表明群落多樣性最低。Shannon指數(shù)用來(lái)估算樣品中微生物多樣性，21個(gè)樣本Shannon指數(shù)在1.5～4.0（圖3-D），其中樣本Q5 shannon值最大，接近4.0，群落多樣性最高；樣本Q14 shannon值最小，接近1.5，群落多樣性最低。

2.3 Bate多樣性分析

為了更好地顯示21個(gè)樣本之間的距離關(guān)系，采用主坐標(biāo)分析法（principal co-ordinates analysis， PCoA）分析樣本群落組成的相似性或差異性。結(jié)果（圖4）表明，PC1作為第一主坐標(biāo)軸解釋樣品中所有差異的30.60%，PC2解釋樣品中所有差異的22.48%。21個(gè)樣本中19個(gè)枸杞白粉病樣本間距離較近，聚為一組；西葫蘆白粉病樣本Q16為單獨(dú)一組，薺菜白粉病樣本Q13為單獨(dú)一組。說(shuō)明不同地區(qū)枸杞白粉病樣本組間差異較小，不同寄主白粉病樣本組間差異較大。

2.4 葉際真菌物種注釋

2.4.1 葉際真菌組成

基于Unweighted Unifrac距離矩陣、UPGMA方法聚類建樹(shù)，并將聚類結(jié)果與各樣品在門(mén)、綱、目、科、屬水平上的物種相對(duì)豐度整合展示。在門(mén)水平上，21個(gè)樣本中共出現(xiàn)4個(gè)已知門(mén)：子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）、羅茲菌門(mén)（Rozellomycota），1個(gè)未鑒定。所有樣本中子囊菌門(mén)均占優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度占72%～96%；其次為擔(dān)子菌門(mén)，相對(duì)豐度在2%～18%；未鑒定出相對(duì)豐度在2%～24%。

在屬水平上（圖5-A），21個(gè)樣本中共出現(xiàn)屬19個(gè)，其中每個(gè)樣本中均存在的優(yōu)勢(shì)菌屬為節(jié)絲殼屬（Arthrocladiella）和安培菌屬（Ampelomyces），在各樣本中的相對(duì)豐度分別達(dá)到15%～54%和0.4%～15%，未知菌屬相對(duì)豐度在31%～67%。

在種水平上（圖5-B），21個(gè)樣本共出現(xiàn)種19個(gè)，鑒定結(jié)果表明19個(gè)枸杞白粉病病原菌屬子囊菌亞門(mén)、核菌綱、白粉菌目、節(jié)絲殼屬穆氏節(jié)絲殼（A. mougeotii）。21個(gè)白粉病樣本中均伴隨白粉菌的重寄生菌白粉寄生孢（A. quisqualis）。

2.4.2 OTU及其分類學(xué)heatmap分析

21個(gè)不同寄主來(lái)源白粉病樣本中微生物種水平上豐度變化見(jiàn)圖6。Heatmap將各樣本微生物物種或樣本間豐度相似性聚為4類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。Ⅰ類微生物在21個(gè)樣本中豐度較低，包括7個(gè)種：新西蘭假子囊藻（Pseudoascochyta novae-zelandiae）、絲擔(dān)子（Filobasidium floriforme）和（Filobasidium chernovii）、玫瑰孢子菌（Sporobolomyces roseus）、對(duì)稱孢（Symmetrospora symmetrica）、Papiliotrema flavescens、Sebacina flagelliformis。

Ⅱ類微生物在21個(gè)樣本中豐度普遍高于Ⅰ類，包括6個(gè)種：水稻孢子菌（Sporobolomyces oryzicola）、大蒜葉枯菌（Stemphylium vesicarium）、白色光子金桿菌（Aureobasidium leucospermi）、Kondoa sorb、卡恩斯維希尼克氏酵母（Vishniacozyma carnescens）、斑點(diǎn)鏈格孢屬（Alternaria aragakii）。其中：Alternaria aragakiiz是Q1的優(yōu)勢(shì)菌株，相對(duì)豐度達(dá)到70%以上。

Ⅲ類微生物包括2個(gè)種：Lysurus cruciatus和葫蘆科寄主常見(jiàn)的單囊殼白粉菌（P. xanthii），在以西葫蘆為寄主的Q16樣本中相對(duì)豐度達(dá)到70%以上。

Ⅳ類微生物在21個(gè)樣本中豐度普遍高于其他3類，包括4個(gè)種和未知種，其中以枸杞為寄主的樣本中均以穆氏節(jié)絲殼（A. mougeotii）為優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度均在70%以上，均伴隨著白粉寄生孢（A. quisqualis）共存。在以薺菜和枸杞為寄主的樣本Q13、Q15中十字花科白粉菌（E. cruciferarum）為優(yōu)勢(shì)菌株，相對(duì)豐度在70%以上。另外，高前霍爾特曼氏菌（Holtermanniella takashimae）和未鑒定出的菌株也具有較高豐度。

3 結(jié)論與討論

白粉病是一種由專性寄生真菌引起的病害，主要危害植物葉片、花朵和果實(shí)，在植物組織上形成白色或灰色的粉狀物，影響葉片的光合作用[18-19]，導(dǎo)致植物無(wú)法正常進(jìn)行養(yǎng)分合成和生長(zhǎng)；葉片會(huì)因?yàn)檎婢那趾Χ兊么嗳?，容易受到其他病害和害蟲(chóng)的侵襲。白粉病真菌通過(guò)風(fēng)、水、昆蟲(chóng)等多種途徑傳播，一旦植物受到感染，病害很容易在植物群體中迅速蔓延，進(jìn)一步加劇病害危害程度。白粉病嚴(yán)重影響枸杞產(chǎn)量和品質(zhì)，及時(shí)預(yù)防和控制白粉病的傳播至關(guān)重要。目前，由于對(duì)病原菌缺乏系統(tǒng)性研究，寧夏地區(qū)枸杞白粉病防控主要依靠化學(xué)藥劑，尚未形成高效的綠色防控技術(shù)。

由于技術(shù)限制，白粉病菌的種類鑒定常采用ITS序列比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析等方法[5，20]，只能鑒定白粉病菌的種類，無(wú)法鑒定發(fā)病葉片、葉際微生物種群多樣性。本研究于2022年在寧夏不同地區(qū)采集枸杞及其他寄主白粉病發(fā)病葉片，首次采用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)鑒定寧夏枸杞白粉菌及其葉際真菌組成，明確了不同寄主白粉病樣本內(nèi)真菌群落豐富，共鑒定出子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、被孢霉門(mén)、羅茲菌門(mén)等19種已知真菌，其中枸杞白粉病病原菌為A. mougeotii，西葫蘆白粉病菌病原菌為P. xanthii，以薺菜和‘中國(guó)枸杞’為寄主的樣本中白粉病病原菌為E. cruciferarum，21個(gè)白粉病樣本中均伴隨白粉菌的重寄生菌白粉寄生孢A. quisqualis。

白粉寄生孢是白粉菌上常見(jiàn)的重寄生真菌，能在一定程度上抑制白粉病的發(fā)生，被認(rèn)為是一種有效的生防菌而用于白粉病的防治。利用白粉寄生孢防治白粉病國(guó)外已經(jīng)有很多成功的例子，有的菌株已形成商品制劑并在部分國(guó)家登記使用[21]。研究表明[22]來(lái)自相同寄主真菌和不同寄主植物的白粉寄生孢存在致病性分化，白粉寄生孢在離體條件下對(duì)白粉菌的選擇性與其在自然條件下的寄生率、重寄生強(qiáng)度有一定的相關(guān)性。由于不同種群和地域間的白粉寄生孢存在一定的遺傳差異，在不同環(huán)境中應(yīng)用白粉寄生孢來(lái)防治黃瓜、蘋(píng)果白粉病存在一定的選擇性[23]。利用白粉寄生孢防治枸杞白粉病未見(jiàn)報(bào)道，還需進(jìn)一步開(kāi)展不同寄主、不同地區(qū)白粉寄生孢的分離鑒定，篩選具有生防效果的白粉寄生孢菌株，為探索寄主、白粉菌、白粉寄生孢三者互作模式，為枸杞白粉病綠色防控提供理論基礎(chǔ)和菌物資源。

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責(zé)任編輯：李曉瑞

基金項(xiàng)目：寧夏農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新專項(xiàng)科技創(chuàng)新引導(dǎo)項(xiàng)目（NKYG-22-01）。

作者簡(jiǎn)介：聶峰杰（1985—），女，甘肅武威人，碩士，副研究員，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用。

*通信作者：李云翔（1971—），男，寧夏鹽池人，副研究員，研究方向?yàn)橹参锊『C合防治。

收稿日期：2023-08-23