寧夏水稻品種Wx基因檢測(cè)及品質(zhì)分析

摘 要：直鏈淀粉含量與蠟質(zhì)基因（Wx）的基因型有關(guān)，Wx基因第一內(nèi)含子的剪接效率決定直鏈淀粉含量，進(jìn)而影響稻米品質(zhì)。應(yīng)用特異PCR鑒定方法對(duì)18份寧夏審定的水稻品種Wx基因第一內(nèi)含子供體+1位堿基G/T進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)，按國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)樣品稻米的直鏈淀粉含量及其他相關(guān)品質(zhì)性狀。結(jié)果表明，18份供試材料Wx基因的多態(tài)性全部為T型，是Wxb基因型；參試樣品直鏈淀粉含量為15.3%～18.5%；AC含量與堊白粒率、堊白度、膠稠度和食味值有一定的相關(guān)性，但不顯著。

關(guān)鍵詞：水稻； 蠟質(zhì)基因； 基因檢測(cè)； 稻米品質(zhì)

中圖分類號(hào)：S511" " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " 文章編號(hào)：1002-204X（2023）10-0014-04

doi：10.3969/j.issn.1002-204x.2023.10.005

Wx Gene Detection and Quality Analysis of Ningxia Rice Varieties

Wang Xin1， Yin Yanbo1， He Qi1， Li Hong1， Zhao Meijuan2

（1.Crops Institution， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Yinchuan， Ningxia 750002; 2.Lingwu Agricultural Technology Extension Service Center， Lingwu， Ningxia 751400）

Abstract The amylose content is related to the genotype of the waxy gene （Wx）， and the splicing efficiency of the first intron of the Wx gene determines the amylose content， which in turn affects rice quality. A specific PCR method was used to detect the donor+1 base G/T of the first intron of Wx gene in 18 rice varieties approved in Ningxia; At the same time， the amylose content and other related quality traits of the sample rice were tested according to the national standard method. The results showed that the polymorphisms of the Wx gene in 18 samples were all T genotype， which was Wxb genotype; The amylose content of the test sample is 15.3%～18.5%; There was a certain correlation between AC content and chalkiness percentage， chalkiness， gel consistency and taste value， but it was not significant.

Key words Rice; Wax gene; Gene detection; Rice quality

寧夏引黃灌區(qū)是全國(guó)最佳優(yōu)質(zhì)粳稻生態(tài)區(qū)之一[1]，水稻種植歷史悠久，是寧夏標(biāo)志性作物。寧夏生產(chǎn)的大米品質(zhì)好、食味佳，是全國(guó)唯一以省（區(qū)）冠名的地理標(biāo)志的農(nóng)產(chǎn)品。水稻是寧夏具有特色的區(qū)域性優(yōu)勢(shì)作物，單產(chǎn)穩(wěn)定在8 400 kg/hm2，是寧夏糧食平均單產(chǎn)的2.53倍，是引黃灌區(qū)糧食平均單產(chǎn)的1.16倍；寧夏水稻最高單產(chǎn)可達(dá)12 538.5 kg/hm2，百畝連片種植實(shí)現(xiàn)超高產(chǎn)[2]。品種是農(nóng)業(yè)發(fā)展的源頭，是農(nóng)業(yè)科技的“芯片”，寧夏水稻育種研究者多年來(lái)育成一批具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品種，不僅滿足當(dāng)?shù)禺a(chǎn)業(yè)發(fā)展和市場(chǎng)多方位的需求，而且輻射到甘肅、陜西、新疆等周邊省（區(qū)）大面積種植。在優(yōu)質(zhì)稻選育方面，2009年優(yōu)質(zhì)稻寧粳43號(hào)在全國(guó)優(yōu)質(zhì)粳稻食味品評(píng)中一舉奪冠；2016年優(yōu)質(zhì)香稻寧粳54號(hào)（11HW-1388）在首屆中國(guó)大米品牌大會(huì)上被評(píng)為“2016中國(guó)十大好吃米飯”；在2019年中國(guó)·黑龍江國(guó)際大米節(jié)，寧夏興唐米業(yè)集團(tuán)基地種植的“寧粳43號(hào)”獲得銀獎(jiǎng)，僅次于日本魚沼“越光”和五常市安家鄉(xiāng)“五優(yōu)稻4號(hào)”。這些品種支撐了寧夏的水稻產(chǎn)業(yè)，為了更好利用寧夏自然資源，推動(dòng)黃河流域高質(zhì)量發(fā)展，水稻品質(zhì)育種更加重要。

水稻稻米品質(zhì)主要包括加工、外觀、蒸煮食味、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。其中：蒸煮食味品質(zhì)中的直鏈淀粉含量、糊化溫度、膠稠度是衡量稻米口感的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為，直鏈淀粉含量（AC）是稻米蒸煮食味品質(zhì)的決定因素。水稻蠟質(zhì)基因（Waxy，Wx）是控制稻米直鏈淀粉含量的主效基因，其編碼的顆粒結(jié)合淀粉合酶（GBSSI）直接控制水稻籽粒直鏈淀粉的合成。因此，Wx基因?qū)Φ久渍糁笫澄镀焚|(zhì)起決定性作用。根據(jù)非糯水稻品種中Wx基因產(chǎn)物（GBSSI）含量差異，將Wx基因區(qū)分為Wxa和Wxb兩種等位類型。Wxa控制高直鏈淀粉含量稻米的形成。Wxa基因Int1-1位點(diǎn)堿基為G，Wxb對(duì)應(yīng)位點(diǎn)處堿基為T，造成兩者直鏈淀粉含量顯著差異，Wxa和Wxb基因序列在第十外顯子第115位堿基處存在的單核苷酸多態(tài)性。此外，克隆了Wxi n等位基因，證明在第6外顯子上發(fā)生A/C變異可導(dǎo)致直鏈淀粉含量降至中等水平（18%～22%）。還有3個(gè)“軟米基因”，即Wxm q、Wxm p和Wxo p相繼被克隆[3-4]。與Wxb相比，Wxm q在第4和第5外顯子處存在兩處突變，導(dǎo)致直鏈淀粉含量降到10%左右；Wxm p在第4外顯子發(fā)生突變，位置與Wxm" q相同；第5外顯子沒(méi)有突變。在水稻品質(zhì)育種中，稻作科學(xué)家不斷發(fā)掘和鑒定Wx基因的等位變異類型，解析Wx基因的調(diào)控機(jī)理，以利用Wx基因的等位變異創(chuàng)制直鏈淀粉含量豐富多變的水稻品種。

本試驗(yàn)通過(guò)特異PCR鑒定方法對(duì)18份寧夏水稻品種Wx的G/T多態(tài)性進(jìn)行研究，同時(shí)利用國(guó)標(biāo)法對(duì)米樣進(jìn)行測(cè)定，為寧夏稻米品質(zhì)育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所提供的18份審定水稻品種。2022年4月，將18份材料種植于寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所王太堡試驗(yàn)田，每份材料種植3行，隨機(jī)排列，栽插株行距為19.0 cm×9.9 cm，按照常規(guī)大田方式管理。在抽穗期，對(duì)葉片取樣，用于基因型鑒定。成熟后每份材料收獲500 g稻谷用于稻米品質(zhì)測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Wx基因檢測(cè)

參照蔡秀玲等[5]的方法，基于Wx基因In1（G/T）位點(diǎn)的堿基差異，設(shè)計(jì)PCR-AccI分子標(biāo)記對(duì)Wxa與Wxb等位基因進(jìn)行檢測(cè)?；蚪MDNA采用SDS法提取，用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量。PCR反應(yīng)體系為2×Taq Master Mix 15 μL，10 μmol/L正反引物各1 μL，DNA模板1 μL，反應(yīng)總體積30 μL，用ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序：94.0 ℃預(yù)變性5 min；94.0 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72.0 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72.0 ℃延伸10 min，4 ℃保存；8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，銀染法顯色拍照。上游引物為WxⅠ-F，序列5'-GTGGAAGCATCACGAGTT-3'；下游引物為WxI-R，序列為5'-C

GTCGTGCAGACGAACA-3'。

1.2.2 品質(zhì)性狀的測(cè)定

稻米品質(zhì)檢測(cè)參照NY/T 83—2017《米質(zhì)測(cè)定方法》，按照NY 147—88《大米測(cè)定方法》[6]測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，包括糙米率、精米率、整精米率、堊白粒率、堊白度、米粒長(zhǎng)、米粒寬、長(zhǎng)/寬等，并用堿消值間接測(cè)定法和米膠延伸法測(cè)定糊化溫度和膠稠度。直鏈淀粉含量（AC）測(cè)定：參照標(biāo)準(zhǔn)樣品由中國(guó)水稻研究所提供，直鏈淀粉含量分別為1.5%、10.1%、16.3%和27.6%。蛋白質(zhì)含量和食味值采用佐竹STA1B米飯食味儀進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wx基因多態(tài)性位點(diǎn)及直鏈淀粉含量

引物 Wx-F/Wx-R擴(kuò)增和AccⅠ酶切結(jié)果（表1）表明，供試的18個(gè)寧夏粳稻品種（系）中的In1（G/T）位點(diǎn)全部為T，酶切后只有1條460 bp的條帶。供試材料的直鏈淀粉含量最高值是18.5%（寧粳28號(hào)），最小值是15.2%（富源4號(hào)），平均值為16.9%。結(jié)果表明，供試的寧夏粳稻材料全部為Wxb基因型，直鏈淀粉含量表現(xiàn)為中低水平，不同品種間的直鏈淀粉含量差異顯著。

2.2 稻米品質(zhì)差異性

品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果（表2）表明，供試材料全部達(dá)到國(guó)標(biāo)優(yōu)質(zhì)米3級(jí)及以上水平。其中：達(dá)到國(guó)標(biāo)2級(jí)的材料有7份，占供試材料的38.9%：達(dá)到國(guó)標(biāo)1級(jí)的有3份，占供試材料的16.7%。供試材料的粒型（長(zhǎng)/寬）在1.7～2.2，平均值為1.95，粒型主要為中長(zhǎng)粒。整精米率的范圍在61.9%～74.7%，平均值為69.6%，供試材料整精米率達(dá)到國(guó)標(biāo)優(yōu)質(zhì)米3級(jí)及以上水平。堊白度范圍在0.9%～5.9%，平均值為3.12%。膠稠度范圍在60.0～83.0 mm，平均值為71.1 mm。食味值得分范圍在73.5～82.1分，平均值為78.1分，食味值較高。結(jié)果表明，Wxb基因型的粳稻材料品質(zhì)較優(yōu)。

2.3 直鏈淀粉含量與主要品質(zhì)性狀的相關(guān)性

選擇稻米品質(zhì)檢測(cè)的加工、外觀、蒸煮食味品質(zhì)中的主要指標(biāo)整精米率、堊白度、膠稠度以及食味值，分析其與直鏈淀粉含量的關(guān)系。結(jié)果（圖1）表明，Wxb基因型的供試材料中整精米率的最高值為74.7%，對(duì)應(yīng)直鏈淀粉含量為17.5%；隨著AC含量的增加整精米率呈下降趨勢(shì)，相關(guān)系數(shù)R2=0.045，AC與整精米率間相關(guān)性不顯著。直鏈淀粉含量分別為16.8%和17.5%時(shí)，對(duì)應(yīng)的堊白度0.9%為最小值；直鏈淀粉含量為17.2%時(shí)，對(duì)應(yīng)的堊白度5.9%為最大值；AC含量與堊白度相關(guān)系數(shù)R2=0.046，相關(guān)性不顯著。膠稠度最大值為83 mm時(shí)，直鏈淀粉含量為15.4%；隨著AC含量的增加，膠稠度沒(méi)有明顯的變化，相關(guān)系數(shù)R2=0.001 5，表明，Wxb基因型的供試材料中AC與膠稠度沒(méi)有顯著相關(guān)關(guān)系。供試材料中食味值最高為82.1分，對(duì)應(yīng)的直鏈淀粉含量為16.8%，AC含量與食味值的相關(guān)系數(shù)R2=0.001，相關(guān)性不顯著。

3 討論與結(jié)論

水稻種植區(qū)域廣泛多元，Wx基因的等位變異及持續(xù)的人為選擇加大了Wx基因等位變異的地區(qū)分布差異，其結(jié)果直接導(dǎo)致不同地區(qū)水稻栽培品種之間的直鏈淀粉含量差異。本試驗(yàn)Wx基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果表明，供試的寧夏主要審定粳稻品種全部是T基因型，為Wxb基因類型，其品種相對(duì)Wxa等位變異類型的直鏈淀粉含量較低。本試驗(yàn)的供試材料品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果表明，供試材料的直鏈淀粉含量為15.2%～18.5%，且全部達(dá)到國(guó)標(biāo)優(yōu)質(zhì)米3級(jí)及以上水平，其中有3份達(dá)到了國(guó)標(biāo)優(yōu)質(zhì)米1級(jí)。表明，Wxb基因類型的供試材料品質(zhì)較好，可以加強(qiáng)Wxb基因類型中的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)材料的選擇。

隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)稻米品質(zhì)的要求越來(lái)越高。同時(shí)，由于地理差異及生活習(xí)慣不同，對(duì)大米口味要求也不盡相同。不斷發(fā)掘和鑒定Wx基因的等位變異類型，可以利用Wx基因的等位變異創(chuàng)制直鏈淀粉含量豐富多變的水稻品種，適應(yīng)不同消費(fèi)者的需求。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，建議在選育優(yōu)質(zhì)米過(guò)程中可先明確Wx基因型，通過(guò)Wx基因型的選擇確定適宜的直鏈淀粉含量的范圍，通過(guò)雜交育種、基因編輯、分子標(biāo)記輔助育種等方法，培育食味好的優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、高抗的水稻新品種。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王興盛. 寧夏水稻[J]. 北方水稻，2007（1）：19-22，31.

[2] 王昕，殷延勃，馬洪文，等. 水稻品種寧粳48號(hào)選育報(bào)告及其高產(chǎn)栽培技術(shù)[J]. 寧夏農(nóng)林科技，2020，61（4）：5-6，14.

[3] 朱昌蘭，沈文飚，翟虎渠，等. 水稻低直鏈淀粉含量基因育種利用的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（2）：157-162.

[4] MIKAMI I， UWATOKO N， IKEDA Y， et al. Allelic diversification at the wx locus in landraces of Asian rice[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2008，116（7）：979-989.

[5] 蔡秀玲，劉巧泉，湯述翥，等. 用于篩選直鏈淀粉含量為中等的秈稻品種的分子標(biāo)記[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2002，28（2）：137-144.

[6] 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)加工標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). 米質(zhì)測(cè)定方法：NY/T 83—2017[S]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2017.

責(zé)任編輯：達(dá)海莉

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)自然基金項(xiàng)目（2021AAC03274）、耐鹽堿水稻新材料創(chuàng)制應(yīng)用研究與示范項(xiàng)目（2022BBF03032-01）。

作者簡(jiǎn)介：王昕（1975—），男，寧夏中寧人，碩士，副研究員，主要從事水稻遺傳育種工作。

收稿日期：2023-03-17" 修回日期：2023-03-19