代謝組學(xué)技術(shù)在母牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)代謝病研究中的應(yīng)用

摘 要：動物機體為維持生命的正常運轉(zhuǎn)會產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，使用代謝組學(xué)技術(shù)對機體代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，通過對代謝產(chǎn)物水平的變化情況進(jìn)行分析，能夠準(zhǔn)確、直接反映動物機體所處的生理狀態(tài)變化。母牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)代謝病一直是影響母牛生產(chǎn)性能的重要疾病之一，因此受到畜禽業(yè)從業(yè)者及科研工作者的廣泛關(guān)注。通過使用代謝組學(xué)技術(shù)對從圍產(chǎn)期母牛身上所獲取的體液、組織等樣本進(jìn)行研究，關(guān)注其中含量發(fā)生顯著變化的代謝產(chǎn)物及相關(guān)代謝通路，從而更加全面地了解母牛圍產(chǎn)期機體代謝物、代謝途徑的改變，以及營養(yǎng)代謝病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。綜述了代謝組學(xué)技術(shù)在母牛圍產(chǎn)期機體代謝物變化規(guī)律和營養(yǎng)代謝病研究中的應(yīng)用，基于代謝組學(xué)深入研究圍產(chǎn)期前后不同階段不同樣本中代謝物水平的變化，更好地了解疾病發(fā)病機制，以識別患病奶牛和健康奶牛之間的差異代謝物，從而為啟動預(yù)防措施提供關(guān)鍵信息。

關(guān)鍵詞：代謝組學(xué)； 母牛； 圍產(chǎn)期； 營養(yǎng)代謝病

中圖分類號：S858.23" " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " 文章編號：1002-204X（2023）11-0070-04

doi：10.3969/j.issn.1002-204x.2023.11.017

Application of Metabolomics Techniques in the Study of Perinatal Nutritional Metabolic Diseases in Cows

Wang Jiandong， Liang Xiaojun*

（Institute of Animal Science， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Yinchuan， Ningxia 750002）

Abstract Various metabolites produced by animal body in order to maintain the normal operation of life， metabolomics technology can be used to detect metabolites and analyze the changes in the level of metabolites， which can accurately and directly reflect the changes in the physiological state of animal body. Perinatal nutritional metabolic disease of cows is one of the important diseases affecting the production performance of cows， so it has been widely concerned by livestock and poultry practitioners and scientific researchers. Metabolomics technology was used to study body fluid and tissue samples obtained from perinatal cows， focusing on metabolites with significant changes in content and related metabolic pathways， so as to more comprehensively understand the changes of metabolites and metabolic pathways and the occurrence and development of nutritional metabolic diseases in cows during perinatal period. This paper reviewed the application of metabolomics technology in the study of metabolite changes and nutritional metabolic diseases in cows during the perinatal period， with a view to further studying the changes of metabolite levels in different samples at different stages before and after the perinatal period based on metabolomics， better understanding the pathogenesis of diseases， and identifying the differences in metabolites between diseased and healthy cows. Thus providing critical information to initiate preventive measures.

Key words Metabolomics; A cow; Perinatal period; Nutritional metabolic disease

圍產(chǎn)期母牛在分娩前后對營養(yǎng)的過度需求導(dǎo)致泌乳開始時出現(xiàn)嚴(yán)重的能量不足，為了抵消這種代謝失衡的一個主要調(diào)整是脂肪的快速動員，從而提供非酯化脂肪酸作為能量來源，最終導(dǎo)致其出現(xiàn)營養(yǎng)代謝性疾病[1]。母牛在出現(xiàn)營養(yǎng)代謝病后，會出現(xiàn)體重減輕、易感性增加和生育能力下降，給養(yǎng)殖場帶來一定的經(jīng)濟(jì)損失。代謝組學(xué)技術(shù)是系統(tǒng)生物學(xué)中必不可少的組成之一，通過分析生物體液、細(xì)胞和組織中的代謝物，通常用作生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的工具。由于信息學(xué)和分析技術(shù)的快速更新迭代，多元統(tǒng)計學(xué)方法的進(jìn)一步驗證和優(yōu)化，以及代謝數(shù)據(jù)庫的建立和完善，可以擴(kuò)展代謝組學(xué)分析以了解代謝通路和代謝網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能。此外，由于代謝組學(xué)技術(shù)具有靈敏度高的特點，可以檢測到生物代謝途徑中的代謝物含量的細(xì)微變化，可以深入了解各種生理條件和異常過程（包括疾病）的機制[2]。本文綜述了代謝組學(xué)技術(shù)在母牛圍產(chǎn)期常見營養(yǎng)代謝性疾病研究中的應(yīng)用，以期為今后母牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)代謝性疾病的防控和治療提供思路。

1 代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展

代謝組一詞由Nicholson等于1998年首次提出[3]，并于2000年初被確立[4]。代謝組學(xué)分析是一種高通量技術(shù)，可定量樣品（生物體液、組織等）中內(nèi)源性代謝物的水平[5]。隨著傅里葉變換紅外光譜法（FT-IR）、核磁共振技術(shù)（NMR）、質(zhì)譜法（MS）、色譜（LC，GC）及色譜質(zhì)譜連用技術(shù)等分析平臺的快速發(fā)展，關(guān)于生物體內(nèi)源性代謝物定量和代謝物變化規(guī)律分析的研究在過去十年中越來越受歡迎。GC-MS、LC-MS和NMR等是目前最常見的代謝組學(xué)檢測技術(shù)[6]，不同檢測方法對待測物質(zhì)屬性也存在一定的偏向性；GC-MS偏向于檢測極性較小，容易揮發(fā)的物質(zhì)；LC-MS偏向于檢測極性較大的物質(zhì)；NMR檢測無明顯偏向性。從大的方面講，代謝組學(xué)主要分為非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)，前者是一種無偏差測量樣品中所有代謝物的綜合技術(shù)，包括未知化合物，它最適合于假設(shè)生成研究，并導(dǎo)致新的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，盡管未知化合物的鑒定和分類仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。另一方面，靶向代謝組學(xué)量化化學(xué)和已知注釋的代謝物，通過將其質(zhì)量數(shù)與光譜數(shù)據(jù)庫中的已知化合物進(jìn)行比較來標(biāo)記測量的代謝物[7-9]。

2 代謝組學(xué)技術(shù)在母牛圍產(chǎn)期中的應(yīng)用

奶牛的代謝反應(yīng)在從懷孕晚期到泌乳早期的過渡過程中發(fā)生了實質(zhì)性變化。然而，與生理代謝的這些變化相關(guān)的分子機制尚未有明確闡明。目前，有關(guān)圍產(chǎn)期母牛血液及其衍生物（血漿和血清）的研究頗多，以其從血液代謝物的角度研究圍產(chǎn)期母牛的機體代謝變化規(guī)律。LUO Z Z等[10]使用UHPLC/MS代謝組學(xué)分析方法，在正負(fù)離子模式下對待產(chǎn)奶牛在孕前約21 d和產(chǎn)后立即采集的血漿樣本進(jìn)行分析，鑒定出67種差異代謝物，包括氨基酸、脂質(zhì)、糖類和核苷酸。通路分析表明，妊娠晚期至泌乳早期增加的代謝產(chǎn)物主要參與脂質(zhì)代謝和能量代謝，而減少的代謝產(chǎn)物與氨基酸代謝有關(guān)。王菲菲等[11]通過采集產(chǎn)后奶牛0、7 d、14 d和21 d外周血樣本，進(jìn)行UPLC-MS/MS代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后7 d、14 d和21 d的血液樣本中代謝物無明顯改變；與產(chǎn)后0 d相比，能量代謝相關(guān)代謝物相對含量顯著下調(diào)，脂代謝相關(guān)代謝物相對含量顯著下調(diào)，氧化應(yīng)激相關(guān)代謝物相對含量顯著下調(diào)，膽汁酸代謝相關(guān)代謝物含量顯著上調(diào)。陶金忠等[12]采用1 H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)對產(chǎn)后第1、7、14和28天奶牛血漿樣本進(jìn)行分析，分娩第1天和第7天的奶牛血漿樣本無顯著差異，第14天和第1天共鑒定出6種差異代謝物，第28天與第1天存在8種差異代謝物，涉及能量代謝相關(guān)通路途徑。Kenéz ？魣等[13]對產(chǎn)前42 d、10 d和產(chǎn)后3、21、100 d奶牛血液樣本進(jìn)行靶向代謝組學(xué)分析，證明甘油磷脂和鞘脂的濃度在產(chǎn)犢前10 d和產(chǎn)犢后3 d明顯低于圍產(chǎn)期的早期或后期階段。此外，張瑞雪等[14]基于UPLC-MS/MS代謝組學(xué)技術(shù)對分娩前后（產(chǎn)前7～10 d和產(chǎn)后7～10 d）奶牛瘤胃液中代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)奶牛分娩前后瘤胃液中共有57種差異代謝物，涉及氨基酸代謝、糖類代謝、核苷酸代謝等。

3 代謝組學(xué)技術(shù)在奶牛生產(chǎn)性疾病研究中的應(yīng)用

3.1 代謝組學(xué)技術(shù)在母牛酮病研究中的應(yīng)用

酮病的發(fā)生與母牛圍產(chǎn)期這一特殊時期存在密切相關(guān)性，圍產(chǎn)期母牛由于妊娠、泌乳的需要對能量的需求大幅上升，而該時期母牛的干物質(zhì)攝入量顯著降低，導(dǎo)致機體能量供應(yīng)出現(xiàn)障礙，母牛處于能量負(fù)平衡狀態(tài)進(jìn)而動員脂肪分解供能，產(chǎn)生大量酮體從而引起酮病[15]。目前，尚不清楚母牛圍產(chǎn)期酮病發(fā)生的機制，但根據(jù)眾多的研究可知其發(fā)生機理與機體氨基酸、糖類及脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。

近些年，使用代謝組學(xué)技術(shù)對圍產(chǎn)期母牛機體代謝物變化規(guī)律、疾病發(fā)生機制的研究已成為當(dāng)下的熱點內(nèi)容，而血液類樣本由于易于獲得，且可以最直接、最有效地反映生物體的代謝情況，因而成為眾多研究人員的首選。孫玲偉[16]分別使用1H NMR和GC/MS兩種代謝組學(xué)檢測技術(shù)，對健康組、亞臨床酮病組和臨床酮病組3組奶牛血漿樣品進(jìn)行分析檢測，通過多元統(tǒng)計學(xué)分析方法，分別得到了兩種檢測方法在3組奶牛血漿樣品之間的差異物代謝，表明酮病的發(fā)生機理與機體氨基酸、糖脂代謝機能紊亂存在顯著聯(lián)系。李影[17]基于1H NMR技術(shù)研究了健康組奶牛、患Ⅰ型酮病組奶牛和患Ⅱ型酮病組奶牛之間的血漿差異代謝物，共篩選出26種顯著差異代謝物，涉及糖類、脂類及氨基酸代謝，表明奶牛酮病的發(fā)生機制與其代謝功能發(fā)生紊亂有關(guān)。乳液是一種穩(wěn)定可用的生物流體，每天定期收集，由于乳液易于獲得、高實用性使其優(yōu)于血液或尿液樣本，其中的差異代謝物也可作為預(yù)測酮病的生物標(biāo)志物。KLEIN M S等[18]運用NMR代謝組學(xué)技術(shù)對患有酮病奶牛的牛乳進(jìn)行差異性代謝物分析發(fā)現(xiàn)，甘油磷酸膽堿（GPC）和磷酸膽堿（PC）可作為潛在生物標(biāo)志物。有研究表明，血漿中丙酮和β-羥基丁酸（BHBA）是酮癥的診斷標(biāo)志物[19]。因此，牛乳中的酮體也可作為診斷的生物標(biāo)志物[20]。XU W等[21]采用代謝組學(xué)技術(shù)分析了產(chǎn)后奶牛第2周和第7周牛乳中差異性代謝物，發(fā)現(xiàn)牛乳中甘氨酸、膽堿、肉堿與泌乳奶牛的能量負(fù)平衡存在顯著相關(guān)性，可以作為診斷奶牛酮病的生物標(biāo)志物。此外，尿液中差異代謝也可作為診斷酮病的生物標(biāo)志物，且能夠反映機體代謝與飼糧之間的聯(lián)系。ZHANG G等[22]使用NMR、GC/MS和LC/MS 3種代謝組學(xué)檢測技術(shù)研究酮癥前、酮癥和酮癥后奶牛尿液中的代謝物圖譜，以確定潛在的代謝物改變，這些改變可用于將來識別易感奶牛的酮癥和參與疾病發(fā)展的代謝途徑。對比酮癥前、酮癥和酮癥后奶牛與正常對照組奶牛發(fā)現(xiàn)多種尿液代謝物改變，其中某些脂肪酸和甘油磷脂可作為酮病發(fā)病早期的生物標(biāo)志物。

3.2 代謝組學(xué)技術(shù)在母牛脂肪肝研究中的應(yīng)用

母牛脂肪肝的發(fā)病機制與其受到體內(nèi)外多種不良因素刺激有關(guān)，所導(dǎo)致的機體營養(yǎng)代謝性紊亂病[23]。脂肪肝是高產(chǎn)奶牛的主要代謝紊亂病，會影響動物的生產(chǎn)性能，主要發(fā)生在從妊娠到早期哺乳的關(guān)鍵過渡期間。病因：圍產(chǎn)期階段奶牛體內(nèi)激素分泌會發(fā)生變化，使其采食量減少，機體泌乳所需能量較大，機體所需能量與其獲得的能量不平衡，促使其動員脂肪產(chǎn)生脂肪酸用于提供能量，多出部分就會被運送到肝臟，重新生成脂肪形成堆積，最終引起脂肪肝[24]。

IMHASLY S等[25]為了確定母牛脂肪肝潛在的小分子生物標(biāo)志物作為一種新的診斷替代方案，通過LC/MS技術(shù)對脂肪肝奶牛代謝標(biāo)志物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)29個差異代謝物；其中甘氨酸和谷氨酰胺可作為關(guān)鍵標(biāo)志物，6種磷脂酰膽堿可作為潛在生物標(biāo)志物，但需要開展深入的相關(guān)研究，以了解它是否與疾病有因果關(guān)系。XU C等[26]采用1H NMR技術(shù)研究患有脂肪肝的奶牛和正常奶牛（對照）的血漿代謝譜以鑒定新的生物標(biāo)志物，分析結(jié)果表明，脂肪肝組和正常組共鑒別出14種顯著差異代謝產(chǎn)物，該分析揭示了脂肪肝組較正常組內(nèi)源性代謝物的概況，這可能為奶牛脂肪肝的診斷提供潛在的生物標(biāo)志物。張璇等[27]采用代謝組學(xué)技術(shù)分析奶牛血液、尿液和糞便樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血液中L-天冬酰胺、棕櫚油酸、L-絲氨酸、硬脂酸、十九烷酸、巖芹酸、十七烷酸等可作為判定奶牛脂肪肝的潛在生物標(biāo)志物。

4 小結(jié)

目前，基于動物營養(yǎng)代謝病的代謝組學(xué)研究還有待于探究，代謝組學(xué)技術(shù)在營養(yǎng)代謝病的發(fā)病機制和營養(yǎng)代謝病生物標(biāo)志物的研究中發(fā)揮越來越重要作用。但由于代謝組學(xué)檢測技術(shù)需要專門的檢測儀器且檢測成本較高，所檢測樣本前準(zhǔn)備和處理需要根據(jù)樣本類型進(jìn)行不同的處理。此外，當(dāng)前不同的代謝組學(xué)檢測方法對相同樣本中所含代謝物檢測會出現(xiàn)明顯的差異性和不可重復(fù)性，基于該問題需要找到適合特定樣本的最佳檢測方法，并對其進(jìn)行系統(tǒng)和精細(xì)的優(yōu)化。如何從代謝組學(xué)檢測后產(chǎn)生的龐大數(shù)據(jù)量中準(zhǔn)確地鑒定和定量這些代謝產(chǎn)物，以及如何從海量數(shù)據(jù)中提取有用的信息，也是亟待研究者解決的問題。因此，雖然代謝組學(xué)技術(shù)在研究母牛圍產(chǎn)期不同階段機體代謝物變化規(guī)律，鑒定母牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)代謝病的潛在生物標(biāo)志物方面具有特異性和可重復(fù)性，但樣品分析的成本和數(shù)據(jù)分析及挖掘方法可能會限制其被眾多研究人員普遍使用。由此展望，隨著代謝組學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展、優(yōu)化，數(shù)據(jù)分析方法的可靠性和準(zhǔn)確性得到進(jìn)一步驗證和完善，以及與其他諸如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及微生物組學(xué)技術(shù)聯(lián)用，將為母牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)代謝性疾病的發(fā)病過程和機理的研究提供可行的檢測方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] INGVARTSEN K L. Feeding-and management-related diseases in the transition cow： Physiologic adaptations around calving and strategies to reduce feeding-related diseases[J]. Animal Feed Science and Technology， 2006， 126（3-4）：175-213.

[2] TUGIZIMANA F， STEENKAMP P A， PIATER L A， et al. A Conversation on data mining strategies in LC-MS untargeted metabolomics： pre-processing and

pre-treatment steps[J]. Metabolites， 2016，6（4）：40.

[3] OLIVER S G， WINSON M K， KELL D B， et al. Systematic functional analysis of the yeast genome[J]. Trends in Biotechnology， 1998，16（9）：373-378.

[4] GRIFFIN J L. The Cinderella story of metabolic profiling： does metabolomics get to go to the functional genomics ball？[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London， Series B. Biological Sciences， 2006， 361（1465）：147-161.

[5] CLISH C B. Metabolomics： an emerging but powerful tool for precision medicine[J]. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies， 2015，1：a000588.

[6] MACEDO A N， FACCIO A T， FUKUJI T S， et al. Analytical platforms for mass spectrometry-based metabolomics of polar and ionizable metabolites[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology， 2021，1336：215-242.

[7] SCHRIMPE-RUTLEDGE A C， CODREANU S G， SHERROD S D， et al. Untargeted metabolomics strategies-challenges and emerging directions[J]. Journal of the American Society for Mass Spectrometry， 2016，27（12）：1897-1905.

[8] WANG J H， BYUN J， PENNATHUR S. Analytical approaches to metabolomics and applications to systems biology[J]. Seminars in Nephrology， 2010，30（5）：500-511.

[9] JOHNSON C H， IVANISEVIC J， SIUZDAK G. Metabolomics： beyond biomarkers and towards mechanisms[J]. Nature Reviews： Molecular Cell Biology， 2016，17（7）：451-459.

[10] LUO Z Z， SHEN L H， JIANG J， et al. Plasma metabolite changes in dairy cows during parturition identified using untargeted metabolomics[J]. Journal of Dairy Science， 2019，102（5）：4639-4650.

[11] 王菲菲，孔維怡，段靜丹，等. 奶牛圍產(chǎn)后期血液代謝物動態(tài)變化規(guī)律研究[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2023，35（2）：953-967.

[12] 陶金忠，郭延生. 奶牛產(chǎn)后血漿1H-NMR代謝組學(xué)分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2016，47（1）：198-206.

[13] KEN？魪Z ？魣， D？魧NICKE S， ROLLE-KAMPCZYK U， et al. A metabolomics approach to characterize phenotypes of metabolic transition from late pregnancy to early lactation in dairy cows[J]. Metabolomics， 2016，12：165-176.

[14] 張瑞雪，劉欣，徐曉鋒，等. 奶牛分娩前后瘤胃代謝物變化規(guī)律及其代謝通路研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2021，52（11）：3137-3148.

[15] WHITE H M. The Role of TCA cycle anaplerosis in ketosis and fatty liver in periparturient dairy cows[J]. Animals， 2015，5（3）：793-802.

[16] 孫玲偉. 基于1H NMR和GC/MS技術(shù)的奶牛酮病血漿代謝組學(xué)分析[D]. 大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2014.

[17] 李影. 基于1H NMR技術(shù)的奶牛Ⅰ型和Ⅱ型酮病血漿代謝組學(xué)分析[D]. 大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2015.

[18] KLEIN M S， BUTTCHEREIT N， MIEMCZYK S P， et al. NMR metabolomic analysis of dairy cows reveals milk glycerophosphocholine to phosphocholine ratio as prognostic biomarker for risk of ketosis[J]. Journal of Proteome Research， 2012，11（2）：1373-1381. [19] ZHOU Z， LOOR J J， PICCIOLI-CAPPELLI F， et al. Circulating amino acids in blood plasma during the peripartal period in dairy cows with different liver functionality index[J]. Journal of Dairy Science， 2016， 99（3）：2257-2267.

[20] LEBLANC S. Monitoring metabolic health of dairy cattle in the transition period[J]. Journal of Reproduction and Development， 2010，56：29-35.

[21] XU W， VERVOORT J， SACCENTI E， et al. Milk metabolomics data reveal the energy balance of individual dairy cows in early lactation[J]. Scientific Reports， 2018，8（1）：15828.

[22] ZHANG G S， MANDAL R， WISHART D S， et al. A multi-platform metabolomics approach identifies urinary metabolite signatures that differentiate ketotic from healthy dairy cows[J]. Frontiers in Veterinary Science， 2021，8：595983.

[23] SHI K R， LI R R， XU Z J， et al. Identification of crucial genetic factors， such as PPARγ， that regulate the pathogenesis of fatty liver disease in dairy cows is imperative for the sustainable development of dairy industry[J]. Animals， 2020，10（4）：639.

[24] SHI K R， NIU F G， ZHANG Q， et al. Identification of whole-genome significant single uucleotide polymorphisms in candidate genes associated with serum biochemical traits in Chinese holstein cattle[J]. Frontiers in Genetics， 2020，11：163.

[25] IMHASLY S， NAEGELI H， BAUMANN S， et al. Metabolomic biomarkers correlating with hepatic lipidosis in dairy cows[J]. BMC Veterinary Research， 2014，

10：122.

[26] XU C， SUN L W， XIA C， et al. （1）H-nuclear magnetic resonance-based plasma metabolic profiling of dairy cows with fatty liver[J]. Asian-australasian Journal of Animal Sciences， 2016，29（2）：219-229.

[27] 張璇. 圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝疾病診斷的代謝標(biāo)記物篩選[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

責(zé)任編輯：達(dá)海莉

作者簡介：王建東（1980—），男，寧夏同心人，碩士，副研究員，主要從事反芻動物健康養(yǎng)殖和疾病防治工作。

*通信作者：梁小軍（1971—），男，寧夏固原人，寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所所長，研究員，主要從事家畜繁育和健康養(yǎng)殖方面的研究與示范推廣工作。

收稿日期：2023-09-06