酶底物法和多管發(fā)酵法在廢水糞大腸菌群檢測中的對比

摘要：近年來，酶底物法被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的檢測分析，從而有效地應(yīng)對突發(fā)環(huán)境事件。本文結(jié)合酶底物法和多管發(fā)酵法的優(yōu)缺點，對二者檢測結(jié)果的相關(guān)性進行試驗驗證，并分析酶底物法的主要影響因素。研究表明，在糞大腸菌群檢測中，酶底物法結(jié)果與傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法相關(guān)性很好，溫度是酶底物法的主要影響因素。酶底物法操作簡便，適用于突發(fā)環(huán)境事件的應(yīng)急監(jiān)測。

關(guān)鍵詞：糞大腸菌群；酶底物法；多管發(fā)酵法；對比；相關(guān)性

中圖分類號：X832 文獻標識碼：A 文章編號：1008-9500（2023）08-00-03

DOI：10.3969/j.issn.1008-9500.2023.08.007

Comparison of Enzyme Substrate Method and Multi-tube Fermentation Method in Detecting Fecal Coliform Group in Wastewater

LI Shuhui

（Baoding Municipal Drainage Service Center of Hebei Province， Baoding 071025， China）

Abstract： In recent years， enzyme substrate method has been widely applied in the detection and analysis of total coliform group， fecal coliform group， and Escherichia coli in water quality， effectively responding to sudden environmental events. Combining the advantages and disadvantages of enzyme substrate method and multi-tube fermentation method， this paper experimentally verifies the correlation between the detection results of the two methods and analyzes the main influencing factors of enzyme substrate method. Research has shown that in the detection of fecal coliform group， the results of enzyme substrate method are highly correlated with traditional multi-tube fermentation method， and temperature is the main influencing factor of enzyme substrate method. The enzyme substrate method is easy to operate and suitable for emergency monitoring of sudden environmental events.

Keywords： fecal coliform group; enzyme substrate method; multi-tube fermentation method; comparison; correlation

糞大腸菌群是總大腸菌群的一部分，它是判斷水質(zhì)是否受到糞便污染的重要指標，是了解水體潔凈程度的重要參數(shù)。酶底物法是一種檢測水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法，是指在特定溫度下培養(yǎng)一定的時間，大腸菌群的細菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶分解鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG），使培養(yǎng)液呈黃色，從而判斷水樣是否含有糞大腸菌群，然后通過統(tǒng)計查表，計算樣品中糞大腸菌群的最可能數(shù)（MPN）。該方法具有簡便、快速的特點，培養(yǎng)基不必自行制備，無特別干擾。酶底物法已被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境的微生物檢測[1]，并通過《生活飲用水標準檢驗方法 第12部分：微生物指標》（GB/T 5750.12—2023）認證。本文結(jié)合酶底物法和多管發(fā)酵法的優(yōu)缺點，開展對比試驗，明確酶底物法的主要影響因素，以便更好地將其應(yīng)用于廢水糞大腸菌群檢測中。

1 酶底物法和多管發(fā)酵法的優(yōu)缺點

1.1 酶底物法

近年來，在生產(chǎn)實踐中，水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群的檢測常常選用酶底物法。目前，酶底物法已被列入國家環(huán)境保護行業(yè)標準[2]，但相較于傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法，該方法還沒有得到普遍認可，需要進行更多驗證。

相比多管發(fā)酵法，酶底物法有很多優(yōu)勢。酶底物法試驗敏感性高，特異性更好[3]；操作簡單，快速方便，完成一個樣品檢測只需要幾分鐘，極大地減輕檢測人員的工作強度；結(jié)果讀取方式簡單，對檢測人員的技術(shù)要求不高，一般檢測人員都能勝任，可以實現(xiàn)多人同時批量進行；前期試驗準備工作較少，培養(yǎng)24 h就能獲得可靠的結(jié)果，非常適用于突發(fā)環(huán)境事件的應(yīng)急監(jiān)測；試驗后的廢棄物簡單，更容易進行滅菌處理。缺點是酶底物法使用的β-半乳糖苷酶、顯色底物和熒光底物都是商品化產(chǎn)品，試劑費用較高。

1.2 多管發(fā)酵法

多管發(fā)酵法是糞大腸菌群檢測的傳統(tǒng)方法[4]，被業(yè)界廣泛認可，它以MPN表示試驗結(jié)果。該方法根據(jù)統(tǒng)計學(xué)理論，估計水體中糞大腸菌群密度和衛(wèi)生質(zhì)量。多管發(fā)酵法需要將樣品進行系列倍比稀釋，再分別接種到含有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中，初發(fā)酵培養(yǎng)，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣結(jié)果，所得陽性樣本再轉(zhuǎn)接到選擇性液體（EC）培養(yǎng)基中復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)來驗證初發(fā)酵的試驗結(jié)果。目前，該方法多用于要求標準高及具有檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定（CMA）的實驗室。

多管發(fā)酵法檢測糞大腸菌群，既有優(yōu)點，也有缺點。優(yōu)點是不需要昂貴的藥品、器皿，只需要普通市售培養(yǎng)試劑、培養(yǎng)皿及試管等玻璃器皿。從缺點來看，試驗全程要求無菌條件，培養(yǎng)條件嚴苛，不利于實現(xiàn)多人操作；操作步驟煩瑣冗長，從乳糖蛋白胨培養(yǎng)液和EC培養(yǎng)液的制備到初發(fā)酵24 h和復(fù)發(fā)酵24 h，一個樣品歷經(jīng)3～5 d，如需陰陽菌株的驗證培養(yǎng)，整個過程用時更長，不利于實際生產(chǎn)的應(yīng)急監(jiān)測；對檢測人員的操作技能要求高，只有少數(shù)有相關(guān)能力的專業(yè)人員才能勝任，不利于實現(xiàn)多人操作；試驗前后所用器皿較多，消毒清理過程繁重，工作強度大，耗材量大，不利于實驗室的批量檢測。多種因素導(dǎo)致多管發(fā)酵法不能對水質(zhì)的衛(wèi)生學(xué)狀況給出快速評價，制約其實際應(yīng)用價值。

2 對比試驗

相較于多管發(fā)酵法，酶底物法有很多優(yōu)勢，簡便實用。但是，酶底物法的準確度和可信度目前還受到部分質(zhì)疑，有必要對兩種方法進行對比試驗。

2.1 試驗設(shè)備及材料

多管發(fā)酵法需要準備無菌操作臺、2臺隔水恒溫培養(yǎng)箱和基本生物試驗玻璃器皿。酶底物法需要準備科立得試劑、97孔定量盤（含49個大孔，48個小孔）、97孔標準陽性比色盤、程控定量封口機和無菌水。

保定市銀定莊污水處理廠和保定市溪源污水處理廠的水質(zhì)存在差異，各采集3個點位的水樣。取污水處理廠加入次氯酸鈉前的二沉池出水、加入次氯酸鈉后接觸池前端水樣和加入次氯酸鈉后接觸池末端鄰近外排口出水，1種水樣沒有滅菌，2種水樣接受同濃度的次氯酸鈉溶液滅菌，但作用時間不同。

2.2 試驗方法及步驟

兩座污水處理廠的3種水樣分別采用多管發(fā)酵法和酶底物法進行試驗分析。其中，各自加入空白試驗和驗證試驗。

2.2.1 前期準備

多管發(fā)酵法需要做好前期準備。一是單倍和三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基的制備及滅菌。二是試管（每個樣品15管）、小導(dǎo)管、移液管、接種針、無菌水、培養(yǎng)皿的打包滅菌。三是操作間基本試驗器材的準備和無菌處理。酶底物法也需要做好前期準備。采用科立得成品培養(yǎng)板和一次性配套產(chǎn)品。因樣品濃度低，本次試驗無須制備無菌水。

2.2.2 陰陽驗證菌株蘇醒試驗

多管發(fā)酵法將陰陽菌株（用大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌）進行蘇醒培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24～48 h。酶底物法進行質(zhì)控驗證（用標準菌株做同步試驗），培養(yǎng)時間為24 h±2 h。

2.2.3 初發(fā)酵

多管發(fā)酵法將已蘇醒驗證菌株和待檢樣品分別分3個稀釋梯度接種到乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中（每個樣品15管），37.0 ℃±0.5 ℃溫度的隔水培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h±2 h。酶底物法將一份科立得試劑加入100 mL水樣中，同時加入一份培養(yǎng)用干粉藥劑，扣蓋搖勻，將其倒入培養(yǎng)板中用封口機封口，放入44.5 ℃±0.5 ℃隔水恒溫箱培養(yǎng)24 h±2 h。

2.2.4 復(fù)發(fā)酵

多管發(fā)酵法將初發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣的所有陽性管分別轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)基中，繼續(xù)在44.5 ℃±0.5 ℃隔水恒溫箱培養(yǎng)24 h±2 h。酶底物法不需要復(fù)發(fā)酵。

2.2.5 結(jié)果求值方法

多管發(fā)酵法查MPN表，得出每100 mL水樣中糞大腸菌群MPN值，再計算出每升水樣中糞大腸菌群數(shù)量。酶底物法查97孔定量盤法MPN表，得到每100 mL樣品中糞大腸菌群MPN值，再根據(jù)稀釋倍數(shù)得出每升水樣的糞大腸菌群數(shù)量。

2.2.6 最小檢出限

多管發(fā)酵法最小檢出限為20 MPN/L；酶底物法最小檢出限為10 MPN/L。

2.2.7 試驗后期處理

多管發(fā)酵法的所有試驗器材需要121 ℃高溫加熱20 min進行滅菌消毒，然后清洗。酶底物法培養(yǎng)后，試驗器材121 ℃高溫滅菌20 min，按一般廢棄物處理。

2.3 方法結(jié)果對比

兩種方法的煩瑣程度和試驗難度不同，對試驗操作人員的技術(shù)能力要求差別較大[5]。多管發(fā)酵法所用培養(yǎng)基質(zhì)量有效期較短，因此培養(yǎng)基的配制頻次和驗證頻次較多，該試驗驗證菌株價格不菲，極大地提高試驗成本，驗證菌株每月需要傳代轉(zhuǎn)接，更增加技術(shù)人員的勞動成本。經(jīng)比較，酶底物法優(yōu)勢明顯。

保定市兩座污水處理廠水樣的糞大腸菌群檢測結(jié)果如表1所示。將保定市銀定莊污水處理廠3組檢測結(jié)果進行配對t檢驗，得出t檢驗值為-1.002，顯著性系數(shù)P=0.422，P＞0.05，即沒有顯著性差異；將保定市溪源污水處理廠3組檢測結(jié)果進行配對t檢驗，得出t檢驗值為-1.000，顯著性系數(shù)P=0.423，P＞0.05，即沒有顯著性差異。

3 酶底物法的主要影響因素——溫度

酶底物法檢測糞大腸菌群時，培養(yǎng)溫度必須控制在44.5 ℃±0.5 ℃，可見溫度對酶底物法結(jié)果至關(guān)重要。溫度對結(jié)果影響較大，有必要對其做試驗驗證。

依據(jù)《污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》（HJ 91.1—2019），保定市銀定莊污水處理廠、保定市溪源污水處理廠出口各取500 mL水樣，再分取3份水樣（100 mL），用酶底物法檢測糞大腸菌群，在同一環(huán)境下用不同培養(yǎng)溫度培養(yǎng)24 h。經(jīng)試驗，保定市銀定莊污水處理廠水樣40 ℃恒溫培養(yǎng)的檢測結(jié)果為490 MPN/L，44.5 ℃恒溫培養(yǎng)的檢測結(jié)果為180 MPN/L，48 ℃恒溫培養(yǎng)的檢測結(jié)果為60 MPN/L；保定市溪源污水處理廠水樣40 ℃恒溫培養(yǎng)的檢測結(jié)果為520 MPN/L，44.5 ℃恒溫培養(yǎng)的檢測結(jié)果為240 MPN/L，48 ℃恒溫培養(yǎng)的檢測結(jié)果為140 MPN/L。結(jié)果表明，溫度對酶底物法的糞大腸菌群檢測結(jié)果有很大影響，溫度較低，趨向大腸菌群適宜溫度（37 ℃）時，其他大腸菌群的生長使結(jié)果明顯偏高，而溫度過高不利于糞大腸菌群的生長，使結(jié)果偏低。因此，試驗要嚴格控制糞大腸菌群的最佳培養(yǎng)溫度（44.5 ℃±0.5 ℃）。同理，用酶底物法檢測糞大腸菌群時，一經(jīng)壓模成型，就應(yīng)盡快放入已提前調(diào)好44.5 ℃的隔水恒溫培養(yǎng)箱，縮短低于此溫度的室內(nèi)存放時間，以免造成結(jié)果偏差。

4 結(jié)論

經(jīng)對比分析，酶底物法與多管發(fā)酵法檢測結(jié)果的相關(guān)性很好，沒有顯著性差異。但是，酶底物法操作簡便，時效性強，它在實際生產(chǎn)中尤其適用于應(yīng)急監(jiān)測和批量檢測。酶底物法可以與水質(zhì)余氯監(jiān)測同步應(yīng)用，有效處置突發(fā)水環(huán)境事件，尤其是醫(yī)療廢水的加密、高頻次檢測，該方法非常高效實用。

參考文獻

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