原核DNA甲基化的表觀調(diào)控作用的研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞：原核；ＤＮＡ 甲基轉(zhuǎn)移酶；ＤＮＡ 甲基化；甲基化組；基因調(diào)控；表觀遺傳

中圖分類號(hào)：Ｑ９３３ 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ 文章編號(hào)：１００１-８３９５（２０２３）０４-０４２７-１１

ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００１-８３９５． ２０２３． ０４． ００１

ＤＮＡ 甲基化修飾最早于１９２５ 年在結(jié)核桿菌（Ｔｕｂｅｒｃｌｅ ｂａｃｉｌｌｕｓ）的基因組ＤＮＡ 中發(fā)現(xiàn)，隨后，在所有的生物中均檢測(cè)到存在ＤＮＡ 甲基化修飾［１］． 在真核生物中，ＤＮＡ 甲基化修飾主要以５-甲基胞嘧啶（ｍ５Ｃ）修飾為主，哺乳動(dòng)物中主要有３ 種ＤＮＡ 甲基轉(zhuǎn)移酶（ＭＴａｓｅ，ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），分別為ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２ 和ＤＮＭＴ３，它們可以催化ｍ５Ｃ 的修飾作用． 據(jù)報(bào)道，在哺乳動(dòng)物中，甲基化修飾的核苷酸占基因組比例為２％ ～７％，并且約７０％ 的ｍ５Ｃ 位于串聯(lián)的ＣｐＧ 島中［２-３］． 真核的ＤＮＡ 甲基化修飾是表觀遺傳的重要機(jī)制之一． 如ＤＮＡ 甲基化可通過招募或阻止轉(zhuǎn)錄因子與ＤＮＡ 結(jié)合，從而調(diào)控基因表達(dá)；同時(shí)，通過從頭甲基化和去甲基化的作用，基因組的甲基化修飾呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化． 這種變化不僅調(diào)控發(fā)育過程，而且與癌癥等疾病有關(guān)［４-５］．

在原核細(xì)菌中，ＤＮＡ 甲基化修飾可發(fā)生在腺嘌呤（Ａ）和胞嘧啶（Ｃ）上，分別形成６-甲基腺嘌呤（ｍ６Ａ）、ｍ５Ｃ 和４-甲基胞嘧啶（ｍ４Ｃ），但這些修飾的核苷酸通常位于一個(gè)特定的保守基序中． 在細(xì)菌中，甲基化修飾的核苷酸在基因組中的比例較真核生物低，占比一般＜ １％ ，而且以ｍ６Ａ 為主，其次是ｍ５Ｃ，ｍ４Ｃ 最少［６-７］． ２０ 世紀(jì)６０ 年代，在原核細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了ＤＮＡ 限制修飾系統(tǒng)（Ｒ-Ｍ），并于１９６４ 年從大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中首次分離純化出ＭＴａｓｅ［８］，自此確定了ＤＮＡ 甲基化修飾的來源，由此發(fā)現(xiàn)的ＤＮＡ 限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)基因工程技術(shù)的建立起到了關(guān)鍵的作用［９］．

在原核細(xì)胞中，ＤＮＡ 甲基化修飾作為Ｒ-Ｍ 的一個(gè)組成部分，其功能主要是作為一種ＤＮＡ 的“標(biāo)記”，以此識(shí)別、保護(hù)自身的基因組ＤＮＡ，避免限制酶切割；而外來入侵的噬菌體ＤＮＡ 因?yàn)闆]有甲基化修飾的“標(biāo)記”，因此被切割［１０］． 所以，長(zhǎng)期以來一般都認(rèn)為原核的ＤＮＡ 限制修飾系統(tǒng)是一種防御噬菌體侵染的機(jī)制． 但是，在許多細(xì)菌中，還存在一類孤生（ｏｒｐｈａｎ）的ＭＴａｓｅ，沒有伴隨的限制酶，通過對(duì)ＤＮＡ的甲基化修飾，能夠在細(xì)胞內(nèi)參與一些細(xì)胞過程． 一個(gè)經(jīng)典的例子就是大腸桿菌的Ｄａｍ （ＤＮＡ ａｄｅｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），它識(shí)別ＧＡＴＣ 基序形成ｍ６Ａ 修飾（Ｇｍ ＡＴＣ），可參與調(diào)控ＤＮＡ 復(fù)制起始等細(xì)胞過程［１１］． 隨著三代ＤＮＡ 測(cè)序的出現(xiàn)和發(fā)展，在細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)了越來越多的甲基化修飾基序，為重新認(rèn)識(shí)和研究細(xì)菌甲基化修飾的生物學(xué)功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)［１２-１３］． 本文在簡(jiǎn)要回顧細(xì)菌中的ＤＮＡ 甲基化酶的種類和ＤＮＡ 甲基化修飾的檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)綜述近年來有關(guān)細(xì)菌甲基化修飾在調(diào)控各種細(xì)胞過程中的作用和分子機(jī)制．

１ 細(xì)菌的ＤＮＡ 甲基化修飾酶

原核的ＭＴａｓｅ 種類繁多，大部分歸屬于Ｒ-Ｍ系統(tǒng)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)、切割ＤＮＡ 方式和輔因的不同，將Ｒ-Ｍ 系統(tǒng)分為４ 類［１４-１５］，即ＴｙｐｅⅠ、Ｔｙｐｅ Ⅱ、Ｔｙｐｅ Ⅲ、Ｔｙｐｅ ＩＶ． Ｔｙｐｅ Ｉ 系統(tǒng)由ＭＴａｓｅ （Ｍ）、限制酶（Ｒ）和調(diào)節(jié)（Ｓ）等３ 種亞基組成，并且Ｒ／ Ｓ 復(fù)合體可單獨(dú)行使修飾功能；Ｔｙｐｅ Ⅱ 系統(tǒng)通常由２ 個(gè)獨(dú)立的Ｒ 和Ｍ 亞基構(gòu)成，并分別具有裂解切割和修飾功能；Ｔｙｐｅ Ⅲ也由Ｒ／ Ｍ^２ 種亞基組成，但限制修飾功能必需由２ 個(gè)亞基一起共同作用．

此外，在原核基因組中還廣泛編碼獨(dú)立的孤生ＭＴａｓｅ，而且在細(xì)菌的種、屬水平上，并不存在保守性［１６］． 因此，不同類群細(xì)菌的ＭＴａｓｅ，種類繁多，并且識(shí)別不同的ＤＮＡ 基序，催化產(chǎn)生３ 種不同的甲基化修飾．

最近在細(xì)菌的另一種宿主防御系統(tǒng)ＢＲＥＸ（ｂａｃ-ｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）中也發(fā)現(xiàn)了ＭＴａｓｅ 的存在，該系統(tǒng)中的ＭＴａｓｅ 通過對(duì)細(xì)菌自身的ＤＮＡ 進(jìn)行甲基化修飾以識(shí)別外來入侵ＤＮＡ，但與限制修飾系統(tǒng)不同的是，ＢＲＥＸ 通過抑制病毒ＤＮＡ 的復(fù)制來防御病毒的入侵［１７-１８］．

ＭＴａｓｅ 催化ＤＮＡ 甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將供體Ｓ腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移到ＤＮＡ 鏈中的胞嘧啶的４位氮原子、５ 位碳原子或腺嘌呤的６ 位氮原子上，分別形成ｍ４Ｃ、ｍ５Ｃ 以及ｍ６Ａ 等３ 種甲基化修飾［１９］．不同的ＭＴａｓｅ 在氨基酸組成和結(jié)構(gòu)上具有一定的保守性，可以對(duì)ＭＴａｓｅ 中的氨基酸保守基序進(jìn)行區(qū)分和識(shí)別． 根據(jù)ＭＴａｓｅ 中的保守結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)，其可分成α、β、γ 等３ 個(gè)組（ｇｒｏｕｐ）［２０］，分別包含９個(gè)相對(duì)保守的基序（Ｉ ～ Ｘ）和一個(gè)序列識(shí)別域（ＴＲＤ）． 其中，基序Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｘ 組成Ｓ-腺苷甲硫氨酸的結(jié)合域；基序ＩＶ ～ ＶＩＩＩ 組成催化域［２１］． 因此，借助保守基序很容易從基因組數(shù)據(jù)中挖掘并鑒別相關(guān)的甲基化基因，但是對(duì)其修飾的基序仍不能得到準(zhǔn)確的結(jié)果．

２ 原核甲基化修飾的分析方法與技術(shù)

研究ＤＮＡ 甲基化修飾的表觀遺傳，首先需要鑒定分析甲基化位點(diǎn)． 雖然過去已經(jīng)發(fā)展多種方法和

技術(shù)［２２］，但主要是針對(duì)真核ｍ５Ｃ 修飾． 例如亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展［２３］，極大地推動(dòng)了真核甲基化表觀的研究． 由于細(xì)菌基因組中編碼的ＭＴａｓｅ種類繁多，識(shí)別ＤＮＡ 基序也不相同，而且甲基化修飾以ｍ６Ａ 為主． 因此，上述方法很少應(yīng)用于細(xì)菌ＤＮＡ 甲基化的研究．

在檢測(cè)原核ＤＮＡ 的甲基化修飾時(shí)，最早采用高效液相色譜（ＨＰＬＣ）或者色譜分離與質(zhì)譜聯(lián)用（ＬＣ-ＭＳ／ ＭＳ）對(duì)基因組ＤＮＡ 降解后的產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量檢測(cè)． 如Ｅｈｒｌｉｃｈ 等［７］采用ＨＰＬＣ 技術(shù)，分析了２６ 種細(xì)菌菌株基因組ＤＮＡ 甲基化修飾的情況，發(fā)現(xiàn)９０％的菌株含有ｍ６Ａ，而ｍ４Ｃ 僅出現(xiàn)在少數(shù)菌株中，ＨＰＬＣ 技術(shù)需要較多的ＤＮＡ 樣品（３ ～１０ μｇ）． 后來，采用更為靈敏的ＬＣ-ＭＳ／ ＭＳ 技術(shù)，只需要５ ～１００ｎｇ ＤＮＡ［２４-２５］． 這類方法實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)便，適用于所有的ＤＮＡ 樣品，并不局限于原核． 該技術(shù)要點(diǎn)主要包括利用酶或酸徹底水解ＤＮＡ 樣品，然后通過ＨＰＬＣ分離、分部檢測(cè)或通過質(zhì)譜鑒定甲基化修飾的核苷酸． 色譜分離鑒定技術(shù)可以在全基因組水平上分析獲取各種甲基化修飾的種類和相對(duì)豐度，但不能獲取修飾位點(diǎn)或序列信息． 因此，很難與細(xì)胞的表型和功能聯(lián)系起來，并且也不能確定甲基化修飾與特定ＭＴａｓｅ 之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系．

自從制備能夠特異識(shí)別ｍ５Ｃ 和ｍ６Ａ 甲基化修飾的抗體后，酶聯(lián)免疫（ＥＬＩＳＡ）技術(shù)也用于鑒定ＤＮＡ 樣品中的甲基化修飾． 迄今已有幾種商業(yè)化的試劑盒，如Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 公司的ｍ５Ｃ ＤＮＡ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ公司的ＭｅｔｈｙｌＦｌａｓｈ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ｍ５Ｃ ＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ 等，但這類試劑盒大多針對(duì)ｍ５Ｃ 修飾，主要應(yīng)用于真核細(xì)胞． ＥＬＩＳＡ 技術(shù)操作方便，可以覆蓋全基因組，但是不太穩(wěn)定，也許只適合于粗略比較不同ＤＮＡ 樣品的甲基化修飾程度，如１． ５ ～２ 倍的差異［２６］．

第三代ＤＮＡ 測(cè)序技術(shù)，如單分子實(shí)時(shí)ＤＮＡ 測(cè)序（ｓｉｎｇｌｅ-ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ，ＳＭＲＴ）和納米孔（Ｎａｎ-ｏｐｏｒｅ）ＤＮＡ 測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，直接推動(dòng)了原核ＤＮＡ甲基化修飾的研究［２７］． ＳＭＲＴ 測(cè)序能夠直接讀取甲基化和非甲基化的核苷酸，在ＤＮＡ 測(cè)序的過程中，ＤＮＡ 聚合反應(yīng)在甲基化修飾的堿基位置會(huì)出現(xiàn)“延遲”（ＩＰＤ），從而可通過ＤＮＡ 聚合酶反應(yīng)在動(dòng)力學(xué)上的差異，分辨不同的甲基化修飾以及正常的４ 種核苷酸［２７］． ＳＭＲＴ 技術(shù)［２８］以及納米孔測(cè)序平臺(tái)［２９］為原核細(xì)菌的甲基化和表觀遺傳的研究開辟了一條新的途徑，能夠在基因組的水平上獲取整個(gè)表觀遺傳的序列信息、繪制全基因組甲基化組（ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ）．例如，Ｂｌｏｗ 等［３０］一次性對(duì)２３０ 種不同種屬的細(xì)菌進(jìn)行了ＳＭＲＴ 測(cè)序，繪制了全基因組甲基化圖譜，共鑒定出８５８ 個(gè)甲基化基序、注釋１ ４５９ 個(gè)ＭＴａｓｅ 編碼基因，其中約一半屬于孤生的ＭＴａｓｅ． 自２０１２ 年ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ 和Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ 公司的研究小組利用ＳＭＲＴ 技術(shù)測(cè)序了６ 個(gè)原核甲基化組、繪制出全基因組的表觀修飾圖譜［３１］，截至２０２１ 年經(jīng)甲基化組測(cè)序的細(xì)菌超過４ ０００ 種［３２］．

第三代ＤＮＡ 測(cè)序技術(shù)能夠快速解析甲基化修飾位點(diǎn)，但是鑒定相應(yīng)的ＭＴａｓｅ 仍然是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)的工作． 通過生物信息學(xué)的分析，雖然可以推測(cè)挖掘得到的ＭＴａｓｅ 與其對(duì)應(yīng)的甲基化修飾基序之間的關(guān)系，但是實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證必不可少． 一般常采用生物信息學(xué)方法分析找到候選的ＭＴａｓｅ 基因，然后通過遺傳或生化分析，驗(yàn)證候選的ＭＴａｓｅ 是否能夠催化修飾特異的ＤＮＡ 基序． 例如，通過共表達(dá)短小芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＢＡ０６ 菌株中候選的ＴｙｐｅＩ 限制修飾系統(tǒng)的Ｍ／ Ｓ 亞基，通過胞內(nèi)和胞外生化分析，鑒定了一個(gè)新的Ｔｙｐｅ Ｉ 甲基化修飾基序及其限制修飾系統(tǒng)［３３］． 但是這種策略比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，發(fā)展高通量的技術(shù)或方法尤為必要． Ｊｅｎｓｅｎ 等［３４］發(fā)展了一個(gè)基于包含串聯(lián)甲基化基序的載體和自動(dòng)克隆的高通量技術(shù)，用于分析了２ 個(gè)乙酸細(xì)菌（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ 和Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍｗｏｏｄｉｉ）中的２３ 個(gè)ＭＴａｓｅ 和１２ 個(gè)甲基化修飾基序，最后確定了１１ 個(gè)基序相對(duì)應(yīng)的ＭＴａｓｅ． 其技術(shù)要點(diǎn)包括：１）將ＳＭＲＴ 測(cè)序鑒定的甲基化修飾基序串聯(lián)克隆在一個(gè)載體中；２）將所有候選的ＤＮＡ 甲基轉(zhuǎn)移酶基因分別克隆上述載體，轉(zhuǎn)化Ｅ． ｃｏｉｌ，誘導(dǎo)表達(dá)ＭＴａｓｅ；３）分別從不同轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒、合并、線性化；４）將合并的質(zhì)粒ＤＮＡ 進(jìn)行ＳＭＲＴ 測(cè)序；５）通過序列分析確定一一對(duì)應(yīng)的甲基化基序和ＤＮＡ甲基轉(zhuǎn)移酶．

３ 甲基化修飾調(diào)控ＤＮＡ 錯(cuò)配修復(fù)和細(xì)胞周期

Ｄａｍ 是一個(gè)經(jīng)典的孤生ＭＴａｓｅ，能識(shí)別修飾基序ＧＡＴＣ． 早期在大腸桿菌和沙門氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中發(fā)現(xiàn)，ｄａｍ 基因缺失后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生高頻突變［３５］，這種表型說明ｄａｍ 突變菌株不能及時(shí)修復(fù)ＤＮＡ 復(fù)制產(chǎn)生的錯(cuò)配． 在正常狀態(tài)下，錯(cuò)配堿基修復(fù)系統(tǒng)（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｒｅｐａｉｒ ｓｙｓｔｅｍ）負(fù)責(zé)修復(fù)ＤＮＡ 復(fù)制產(chǎn)生的錯(cuò)配堿基． 該系統(tǒng)由ＭｕｔＳ-ＭｕｔＬ-ＭｕｔＨ 這３ 個(gè)亞基組成，ＭｕｔＳ 掃描識(shí)別錯(cuò)配的ＤＮＡ，并結(jié)合在錯(cuò)配的ＤＮＡ 上，然后招募ＭｕｔＨ，形成修復(fù)復(fù)合體． ＭｕｔＨ 在非甲基化ＧＡＴＣ 基序靠近Ｇ 的５′端切割磷酸二酯鍵；ＵｖｒＤ 解旋酶驅(qū)離ＭｕｔＨ，并降解單鏈ＤＮＡ，形成一段缺口． 該缺口由ＤＮＡ 聚合酶ＩＩＩ補(bǔ)缺，ＤＮＡ 連接酶封閉切口． 最后，Ｄａｍ 將修復(fù)的新鏈甲基化，從而完成錯(cuò)配堿基的修復(fù)． 在ＤＮＡ 復(fù)制過程中，舊鏈呈甲基化狀態(tài)（ＧｍＡＴＣ），新鏈此時(shí)還未甲基化． 因此，舊鏈中的Ｇｍ ＡＴＣ 甲基化修飾相當(dāng)于一個(gè)“標(biāo)記”，用于錯(cuò)配堿基修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別并區(qū)分新、舊鏈． 如果缺失ｄａｍ，未被甲基化的新、舊兩條鏈均可能被ＭｕｔＨ 切割，因此提高突變頻率［３６］．

在Ｅ.ｃｏｌｉ 中，ＤＮＡ 復(fù)制由ＤｎａＡ 蛋白結(jié)合復(fù)制起點(diǎn)（ｏｒｉ）啟動(dòng)． ｏｒｉ 序列中包括１２ 個(gè)ＧＡＴＣ 位點(diǎn)，并且ＤｎａＡ 只能結(jié)合ＧＡＴＣ 全部甲基化的ｏｒｉ，不能結(jié)合半甲基化ＧＡＴＣ 的復(fù)制起點(diǎn)． 另一個(gè)蛋白ＳｅｑＡ能夠結(jié)合半甲基化的ｏｒｉ，因此可以保持ｏｒｉ 在一定時(shí)間內(nèi)保持半甲基化狀態(tài)，從而延緩新一輪的ＤＮＡ復(fù)制． 此外，ＤｎａＡ 自身的表達(dá)也受制于Ｄａｍ 甲基化修飾的調(diào)控［３７］． ＤＮＡ 甲基化修飾調(diào)控細(xì)胞周期的另一個(gè)經(jīng)典例子來自于ＣｃｒＭ （ｃｅｌｌ-ｃｙｃｌｅ-ｒｅｇｕｌａ-ｔｅｄ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），其編碼基因廣泛存在于變形菌綱（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）中，是新月桿菌（Ｃａｕ-ｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、根癌農(nóng)桿菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ-ｆａｃｉｅｎｓ）、苜蓿根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）和流產(chǎn)布魯氏菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）等細(xì)菌的一個(gè)必需基因．新月桿菌是一個(gè)二態(tài)型的細(xì)菌，細(xì)胞不對(duì)稱分裂后形成２ 種細(xì)胞：Ｓｗａｒｍｅｒ 細(xì)胞和Ｓｔａｌｋｅｄ 細(xì)胞，染色體ＤＮＡ 只能在Ｓｔａｌｋｅｄ 細(xì)胞中才能復(fù)制． 新月桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)（Ｃｏｒｉ）存在５ 個(gè)ＣｃｒＭ 的識(shí)別修飾基序ＧＡＮＴＣ． 在Ｓｔａｌｋｅｄ 細(xì)胞中，ＣｃｒＭ 表達(dá)，將復(fù)制起點(diǎn)完全甲基化，從而啟動(dòng)ＤＮＡ 復(fù)制． 當(dāng)細(xì)胞完成ＤＮＡ 復(fù)制和分裂后，ＣｃｒＭ 被降解，因此在形成的新子細(xì)胞中，染色體ＤＮＡ 維持一種半甲基化狀態(tài)． 此外，另一個(gè)調(diào)控蛋白ＣｔｒＡ 結(jié)合甲基化的復(fù)制起點(diǎn)，在Ｓｗａｒｍｅｒ 細(xì)胞中抑制ＤＮＡ 復(fù)制，并且也調(diào)控ＣｃｒＭ 的表達(dá)［３７-３８］． 在上述２ 個(gè)例子中，復(fù)制起點(diǎn)的ＤＮＡ 甲基化修飾被認(rèn)為是啟動(dòng)ＤＮＡ 復(fù)制的一種分子信號(hào)，而且通過與相關(guān)蛋白的互作參與調(diào)控．

４ 原核甲基化修飾的基因調(diào)控功能

在原核細(xì)胞中，ＭＴａｓｅ 及其甲基化修飾除了作為限制修飾系統(tǒng)防御外源ＤＮＡ 的入侵之外，越來越多的證據(jù)表明，ＤＮＡ 甲基化修飾也能參與或調(diào)控許多細(xì)胞功能，因此成為原核表觀遺傳研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容． 但與真核相比，相關(guān)的研究較為有限，已有的相關(guān)研究主要涉及個(gè)別的ＭＴａｓｅ 及其甲基化修飾． 隨著細(xì)菌甲基化組學(xué)的快速發(fā)展，許多細(xì)菌的ＤＮＡ 甲基化修飾基序的解析，為研究細(xì)菌甲基化修飾的生物學(xué)功能提供了一個(gè)極好的契機(jī)．

４． １ 甲基化修飾調(diào)控基因表達(dá) ＤＮＡ 甲基化修飾

可能改變ＤＮＡ 結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響與蛋白質(zhì)的結(jié)合［３９］．目前已發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，如Ｅ． ｃｏｌｉ 的Ｌｒｐ、ＯｘｙＲ、Ｆｕｒ、ＨｄｆＲ 和新月桿菌的ＧｃｒＡ、ＭｕｃＲ 等與ＤＮＡ 結(jié)合時(shí)，目標(biāo)ＤＮＡ 的甲基化狀態(tài)會(huì)影響其結(jié)合作用． 因此，在甲基化修飾位于這些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，可能調(diào)控基因的表達(dá)［１１，４０］． 例如，在沙門氏菌（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉ-ｃａ）中，ｓｔｄ 菌毛（ｆｉｍｂｒｉａｌ）操縱子在野生菌中不能表達(dá)，其啟動(dòng)子中存在３ 個(gè)Ｄａｍ 的甲基化基序（ＧＡＴＣ），敲除ｄａｍ 基因能激活ｓｔｄ 的表達(dá)，但需要轉(zhuǎn)錄因子ＨｄｆＲ． 體外實(shí)驗(yàn)表明ＨｄｆＲ 只能結(jié)合無甲基化修飾的啟動(dòng)子片段，不能結(jié)合甲基化修飾的啟動(dòng)子． 此外，ＨｄｆＲ 與ＳｔｄＥ 和ＳｔｄＦ 形成一個(gè)正調(diào)控回路［４１-４２］． 在新月桿菌中，σ７０因子的輔因ＧｃｒＡ 能特異結(jié)合ＣｃｒＭ 甲基化修飾的ＤＮＡ 位點(diǎn)（Ｇｍ ＡＮＴＣ），并招募ＲＮＡ 聚合酶ＩＩ，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄；ＧｃｒＡ 調(diào)控的基因可能超過２００ 個(gè)． 進(jìn)一步的研究表明，ＧｃｒＡ在細(xì)胞Ｓ 期還可不對(duì)稱激活編碼鏈甲基化修飾的細(xì)胞骨架基因（ｃｒｅＳ）［４３-４５］．

在腸桿菌科中，Ｄａｍ 甲基化修飾在調(diào)控上述基因時(shí)，其作用模式類似于一個(gè)雙穩(wěn)態(tài)（ｂｉｓｔａｂｌｅ）的“開／ 關(guān)”（ＯＮ／ ＯＦＦ）． 在一些亞群體中處于“開”狀態(tài)，另一些亞群體處于“關(guān)”狀態(tài)，導(dǎo)致形成異質(zhì)性的亞細(xì)胞群體． 最近，西班牙的Ｃａｓａｄｅｓúｓ 團(tuán)隊(duì)［４６］利用單細(xì)胞技術(shù)重新分析了沙門氏菌中Ｄａｍ 甲基化修飾關(guān)聯(lián)的基因在Ｄａｍ 敲除、過表達(dá)等遺傳背景下的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)１０ 個(gè)新的基因依賴于甲基化修飾而表現(xiàn)雙穩(wěn)態(tài)表達(dá)模式，而且“開”或“關(guān)”亞群體的大小與培養(yǎng)條件有關(guān)． 進(jìn)一步說明甲基化修飾表觀遺傳在調(diào)控細(xì)菌群體異質(zhì)性的功能，這可能對(duì)細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境等方面具有重要的意義．

除了上述幾個(gè)經(jīng)典的甲基化修飾的調(diào)控，近來在其他細(xì)菌中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些新的ＭＴａｓｅ 能夠調(diào)控基因表達(dá)． 在枯草芽孢桿菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中，孤生ＭＴａｓｅ（ＤｎｍＡ）識(shí)別修飾不對(duì)稱ＧＡＣＧｍ ＡＧ 基序，當(dāng)敲除后導(dǎo)致許多基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變，其中在ｓｃｐＡ 基因的啟動(dòng)子３５ 區(qū)下游存在一個(gè)ＧＡＣＧＡＧ 基序，在ｄｎｍＡ 敲除背景下，ｇｆｐ 報(bào)告基因的表達(dá)顯著下調(diào)；當(dāng)識(shí)別基序中的修飾位點(diǎn)從Ａ 突變?yōu)椋?或Ｔ 后會(huì)消除這種影響；證明了甲基化修飾在ｓｃｐＡ 基因中的調(diào)控作用． 進(jìn)一步利用甲基化修飾和未修飾的２ 條寡核苷酸通過Ｐｕｌｌｄｏｗｎ 實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞裂解物種篩選出一個(gè)負(fù)調(diào)控蛋白ＳｃｏＣ，發(fā)現(xiàn)ＳｃｏＣ 對(duì)未甲基化修飾的ＤＮＡ 的結(jié)合親和性更高．因此，認(rèn)為負(fù)調(diào)控蛋白ＳｃｏＣ 在ｄｎｍＡ 突變背景下更容易與該基因啟動(dòng)子結(jié)合，從而下調(diào)基因的表達(dá)［４７］． 值得注意的是，甲基化修飾與否并不會(huì)影響所有關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)． 在艱難梭狀芽胞桿菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）中，測(cè)序比較了３６ 株臨床分離物的甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)了１７ 個(gè)特有的甲基化修飾基序，并系統(tǒng)地研究了３６ 個(gè)分離物共有的一個(gè)孤生甲基化轉(zhuǎn)移酶ＣａｍＡ 的調(diào)控功能，ＣａｍＡ 識(shí)別修飾ＣＡＡＡＡｍＡ 基序，每個(gè)基因組中平均含有７ ７２１個(gè)，并富集在產(chǎn)孢、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等編碼基因中．此外，每個(gè)基因組中約有２７ 個(gè)ＣＡＡＡＡＡ 位點(diǎn)沒有甲基化修飾，這些位點(diǎn)被認(rèn)為可能因?yàn)楸晦D(zhuǎn)錄因子結(jié)合，規(guī)避了甲基化修飾，意味著這些基因可能受制于甲基化修飾調(diào)控． 為研究甲基化修飾的調(diào)控作用，采用比較轉(zhuǎn)錄組分析了ｃａｍＡ 缺失突變后的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)差異基因富集于ＣＡＡＡＡＡ 關(guān)聯(lián)的基因中，而且包括１００ 余個(gè)表達(dá)下調(diào)的產(chǎn)孢基因，與表型觀察一致，即ｃａｍＡ 缺失突變體的產(chǎn)孢能力下降． 最后，在小鼠感染模型中發(fā)現(xiàn)ｃａｍＡ 缺失突變體的致病性發(fā)生衰減［４８］．

在原核細(xì)菌中，有關(guān)甲基化修飾的調(diào)控作用大多來自于ｍ６Ａ 修飾，有關(guān)ｍ５Ｃ 和ｍ４Ｃ 修飾的調(diào)控研究非常有限． 最近，有研究者對(duì)幽門螺旋桿菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）的甲基化酶（ＪＨＰ１０５０）基因缺失突變菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)菌株Ｊ９９ 中２２５ 個(gè)基因的表達(dá)受到明顯影響，但在ＢＣＭ-３００ 菌株中只檢測(cè)到２９ 個(gè)差異表達(dá)基因，進(jìn)一步通過對(duì)修飾基序ＧＣＧＣ 的突變分析，證明了位于啟動(dòng)子的ｍ５Ｃ 甲基化修飾可直接調(diào)控基因的表達(dá)［４９］． 浙江大學(xué)李永泉團(tuán)隊(duì)［５０］最近在玫瑰孢鏈霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏ-ｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）Ｌ３０ 菌株中新鑒定了一個(gè)ｍ４Ｃ 修飾的ＭＴａｓｅ （ＳｒｏＬｍ３），經(jīng)多組學(xué)和突變分析發(fā)現(xiàn)該ＭＴａｓｅ 廣泛參與調(diào)控次生代謝，缺失后可提高達(dá)托霉素（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）的合成．

此外，運(yùn)用組學(xué)，特別是比較轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，在許多細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)敲除特定的ＭＴａｓｅ 或甲基化修飾缺失會(huì)改變大量基因的表達(dá)水平［３３，５１.５６］． 例如，在伯氏疏螺旋菌（Ｂｏｒｒｅｌｉ ａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）中，敲除２ 個(gè)質(zhì)粒編碼的ＭＴａｓｅ 基因，分別改變數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)［５３］． 在化膿鏈球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）中，敲除Ｉ 型Ｒ-Ｍ 系統(tǒng)后卻只有２０ 個(gè)基因發(fā)生了顯著的變化，但均下調(diào)表達(dá)［５１］． 利用ＭＴａｓｅ 抑制劑（５-ａｚａ-ｃｙｔｉｄｉｎｅ）處理Ｅ． ｃｏｌｉ 細(xì)胞，比較轉(zhuǎn)錄組分析也發(fā)現(xiàn)數(shù)十個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變［５４］． 在植物病原細(xì)菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）中，采用蛋白組技術(shù)比較分析了３ 個(gè)ＭＴａｓｅ 基因過表達(dá)的菌株，發(fā)現(xiàn)１００ 余個(gè)顯著表達(dá)的蛋白，其中包括部分重疊的蛋白，但更多的差異蛋白富集于在不同的ＧＯ 功能，說明這３ 個(gè)ＭＴａｓｅ 可能具有不同調(diào)控功能［５５］．這些研究特別關(guān)注了與甲基化修飾基序關(guān)聯(lián)的基因，認(rèn)為這可能是甲基化修飾直接調(diào)控的靶基因．但是，這類研究仍然不夠深入，不能提供直接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明甲基化修飾與被調(diào)控基因的關(guān)聯(lián)． 因此，原核甲基化修飾表觀調(diào)控需要給予足夠的重視，進(jìn)一步研究闡明分子機(jī)制．

４． ２甲基化修飾相變調(diào)控 在原核細(xì)胞中，ＤＮＡ

甲基化修飾常常以相變（ｐｈａｓｅ-ｖａｒｉａｔｉｏｎ）方式發(fā)揮調(diào)控作用［５７］． 相變是指基因表達(dá)的隨機(jī)和可逆的改變． 因此，相變可能導(dǎo)致細(xì)菌群體產(chǎn)生不同表型的異質(zhì)性的亞群體，如改變病原細(xì)菌的定殖能力、適應(yīng)微生境以及宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答等［５７-６０］． 許多研究表明，細(xì)菌的Ｒ-Ｍ 系統(tǒng)可介導(dǎo)相變調(diào)控，在基因組上改變甲基化修飾模式，因此全局性地調(diào)控基因的表達(dá)，這些基因統(tǒng)稱為相變調(diào)控子（ｐｈａｓｅｖａｒｉｏｎｏｒ ｐｈａｓｅ-ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｕｌｏｎ）． 由于甲基化修飾介導(dǎo)的相變調(diào)控涉及病原細(xì)菌的致病性，有關(guān)病原細(xì)菌的相變調(diào)控基因的鑒定和相變調(diào)控的機(jī)制都進(jìn)行了大量的研究，近期已發(fā)表了多篇綜述性文獻(xiàn)總結(jié)評(píng)述了目前的研究進(jìn)展［５８-６１］． 下面僅就Ⅰ型和Ⅲ 型Ｒ-Ｍ 系統(tǒng)介導(dǎo)的相變調(diào)控作簡(jiǎn)要介紹．

細(xì)菌Ｉ 型Ｒ-Ｍ 系統(tǒng)由３ 個(gè)亞基組成，其中調(diào)節(jié)亞基（Ｓ）負(fù)責(zé)識(shí)別甲基化修飾基序． 在一些細(xì)菌基因組中，編碼Ｓ 亞基的基因不止一個(gè)，可能出現(xiàn)多個(gè)同源基因，并且在鄰近的位置存在一個(gè)編碼位點(diǎn)特異的重組酶基因． 例如，在肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＳＴ５５６ 菌株的基因組中存在３ 個(gè)Ｓ 亞基基因（Ｓ_Ａ、Ｓ_Ｂ、Ｓ_Ｃ），其中在Ｓ_Ｂ和Ｓ_Ｃ之間間隔一個(gè)ｐｓｒＡ 基因，編碼酪氨酸位點(diǎn)特異的重組酶，該重組酶介導(dǎo)３ 個(gè)Ｓ 之間的重組，產(chǎn)生不同ＳＡ等位基因，組成多樣化的Ｒ-Ｍ 系統(tǒng)，識(shí)別不同ＤＮＡ 基序，并產(chǎn)生不同的甲基化修飾模式，最終導(dǎo)致出現(xiàn)異質(zhì)性的亞群體． 其中，Ｓ 基因旁則的倒置重復(fù)序列是重組所必需的［６２-６３］． Ｉ 型Ｒ-Ｍ 相變調(diào)控可能影響多種細(xì)胞生理以及致病相關(guān)的表型［５８，６０］． 最近，在奈瑟淋球菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＦＡ１０９０ 菌株中敲除相變調(diào)控的Ｉ 型Ｒ-Ｍ 或改變修飾特異性，發(fā)現(xiàn)可以通過相變調(diào)控生物膜形成，并降低對(duì)人上皮細(xì)胞的附著以及對(duì)抗生素的抗性［６４］．

Ⅲ型Ｒ-Ｍ 系統(tǒng)介導(dǎo)的相變調(diào)控研究比較深入，在許多病原細(xì)菌中均發(fā)現(xiàn)存在Ⅲ型ＲＭ 相變調(diào)控． Ⅲ型ＭＴａｓｅ （Ｍｏｄ）在組織結(jié)構(gòu)中包括一個(gè)負(fù)責(zé)識(shí)別甲基化基序的ＴＲＤ 功能域，ＴＲＤ 域通常包含一種簡(jiǎn)單重復(fù)序列（ＳＳＲ），出現(xiàn)在約２０％ 的ｍｏｄ基因中［６１］． 不同的ＳＳＲ 序列，以及不同的重復(fù)次數(shù)和位置可能導(dǎo)致產(chǎn)生很多具有不同特異性的ｍｏｄ等位基因，也可能導(dǎo)致翻譯提前終止． 序列分析認(rèn)為ＴＲＤ 的進(jìn)化主要源于菌株或種間的ＤＮＡ 改組（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）［６５］． 例如奈斯淋球菌的ｍｏｄＢ 基因座已鑒定出７ 個(gè)等位基因［６６］． 在嗜血流感菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉ-ｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）中，ｍｏｄＡ 含有一個(gè)由４ 核苷酸ＡＧＣＣ組成的ＳＳＲ，由于ＡＧＣＣ 重復(fù)次數(shù)的不同形成了至少２１ 個(gè)等位基因，其中一些等位基因?qū)е路g提前終止，這種情況相當(dāng)于關(guān)閉甲基化修飾；另外一些等位基因則可能改變甲基化修飾的特異性，在不同的細(xì)胞亞群中產(chǎn)生不同的甲基化修飾模式，并調(diào)控不同生理功能，如ＭｏｄＡ２、ＭｏｄＡ５、ＭｏｄＡ１０ 主要介導(dǎo)抗生素抗性，ＭｏｄＡ４ 涉及免疫逃避，ＭｏｄＡ２ 相變調(diào)控還包括一些致病相關(guān)的基因［６７］．

４． ３甲基化修飾與致病性 最早直接發(fā)現(xiàn)ＤＮＡ 甲

基化修飾與細(xì)菌致病性的關(guān)聯(lián)源自沙門氏菌． Ｈｅｉｔｈｏｆｆ等［６８］發(fā)現(xiàn)ｄａｍ 缺陷的Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ 突變株通過口服灌注小鼠，其ＬＤ_５０致死劑量較野生型高１０ ０００ 倍以上，說明甲基化修飾的缺失導(dǎo)致沙門氏菌的致病性嚴(yán)重衰減． 后續(xù)的研究進(jìn)一步揭示了ｄａｍ 缺失導(dǎo)致致病性衰減的可能機(jī)制，如生物膜形成的缺陷［６９］、不能充分激活ＳＰＩ-１ 致病島［７０］、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性降低［７１］．

隨后，在其他病原細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)ＤＮＡ 甲基化的缺失可能導(dǎo)致致病性降低［７２］． 例如，在一些流感嗜血桿菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）菌株中，發(fā)現(xiàn)Ｄａｍ 甲基化修飾是病菌侵入內(nèi)皮和上皮細(xì)胞所必需的［７３］． 在銅綠假單胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１ 菌株中，發(fā)現(xiàn)甲基化修飾狀況與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)，敲除一個(gè)Ⅰ 型限制修飾系統(tǒng)后，在昆蟲大蠟螟（Ｇａｌｌｅｒｉａｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）侵染模型中導(dǎo)致致病性衰減［７４］；最近，在一株銅綠假單胞桿菌的臨床分離物中，鑒定出一個(gè)Ⅰ型ＲＭ 系統(tǒng)的ＭＴａｓｅ （Ｍ． ＰａｅＴＢＣＦＩＩ），敲除后也會(huì)導(dǎo)致致病性衰減，而且對(duì)一氧化氮（ＮＯ）敏感［７５］． 此外，更多的研究表明甲基化修飾可能調(diào)控致病相關(guān)的基因，從而影響致病性． 例如，在結(jié)核桿菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中，發(fā)現(xiàn)來自于歐美系的菌株編碼一個(gè)孤生的ＭＴａｓｅ（ＤａｍＡ），缺失后降低細(xì)菌對(duì)低氧的適應(yīng)性，而該基因不存在于北京系的菌株中，暗示該基因在不同的菌系中可能存在特異性的作用［７６］．

幽門螺旋桿菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）是一種重要的病原菌，可誘發(fā)胃癌，在其基因組中發(fā)現(xiàn)了比其他細(xì)菌更為豐富、多樣的限制修飾系統(tǒng)，可達(dá)全部編碼基因的２％ ［７７７８］，不同的菌株平均編碼多達(dá)３０ 余個(gè)ＭＴａｓｅ 基因［７９］，而且一些ＭＴａｓｅ 具有菌株的特異性［７７，８０］． Ｖａｌｅ 等［８１］通過分析來自于非洲、美洲、亞洲和歐洲的２２１ 個(gè)幽門螺旋桿菌菌株，發(fā)現(xiàn)限制修飾系統(tǒng)的多樣性具有地理起源特異性，認(rèn)為與菌株的適應(yīng)性有關(guān)． 在Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ 中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)Ⅲ型限制修飾系統(tǒng)ＭｏｄＨ 具有相變調(diào)控作用，ＭｏｄＨ 具有多達(dá)１５ 種特異的甲基化修飾模式，能夠調(diào)控相應(yīng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和附著相關(guān)基因的表達(dá)． 有趣的是，不同修飾基序的ＭｏｄＨ 對(duì)運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的調(diào)控呈現(xiàn)相反的作用，ＭｏｄＨ５ 上調(diào)鞭毛因子和ｈｏｏｋ 蛋白的表達(dá)；而ＭｏｄＨ１ 卻下調(diào)鞭毛ｈｏｏｋ 和ｒｏｄ 蛋白的表達(dá)［８２-８４］． 此外，通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析發(fā)現(xiàn)，Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ２６６９５ 菌株缺失一個(gè)ｍ４Ｃ 修飾的ＭＴａｓｅ（Ｍ２． ＨｐｙＡＩＩ），能夠?qū)е拢保埃?多個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生改變，其中也包括許多致病相關(guān)的基因［８５］． 不過，在Ｈ． ｐｙｌｏｒｉａ 中有關(guān)甲基化修飾與致病性的關(guān)聯(lián)性仍然缺乏動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)證據(jù)．

雖然許多研究表明，改變病原細(xì)菌甲基化修飾可能影響致病性，但其中的分子機(jī)制仍不清楚，一般認(rèn)為甲基化修飾可能通過改變特異基因的表達(dá)，導(dǎo)致致病性發(fā)生改變，另外一種可能則是與環(huán)境適應(yīng)有關(guān)．

由于一些研究發(fā)現(xiàn)ｍ５Ａ 修飾的缺失能夠大幅度衰減致病性，有人提出以病原細(xì)菌的甲基化修飾作為靶點(diǎn)，研究發(fā)展新的治療方案［８６］． 例如，Ｍｏｈｌｅｒ等利用沙門氏菌ｄａｍ 缺失突變體開發(fā)了活疫苗［８７］，或者合成、篩選細(xì)菌特異ＭＴａｓｅ 的抑制劑［８６］． 最近，Ｚｈｏｕ 等［８８］針對(duì)艱難梭狀芽胞桿菌特異性的ＭＴａｓｅ （ＣａｍＡ），篩選、分析了幾種Ｓ-腺苷甲硫氨酸結(jié)構(gòu)類似化合物對(duì)ＣａｍＡ 的抑制作用，發(fā)現(xiàn)３ 種化合物（ＳＧＣ０９４６、ＪＮＪ-６４６１９１７８ 和ＳＧＣ８１５８）在低濃度下能抑制ＣａｍＡ 的催化反應(yīng)，并解析了ＣａｍＡ-ＳＧＣ０９４６ 復(fù)合體結(jié)構(gòu)，顯示抑制劑導(dǎo)致Ｃａ-ｍＡ 的Ｎ-端結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生改變，可能影響ＣａｍＡ與甲基供體Ｓ-腺苷甲硫氨酸互作或甲基轉(zhuǎn)移． 這為臨床治療艱難梭狀芽胞桿菌等病原細(xì)菌的侵染提供了一個(gè)新的思路．

４． ４ 甲基化修飾與耐藥性 抗生素的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用雖然挽救了無數(shù)的生命，但是由于抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥性給人類帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，成為當(dāng)今主要醫(yī)療問題之一． 雖然對(duì)耐藥性的生化機(jī)制和遺傳學(xué)進(jìn)行了廣泛的研究，但仍然難以完全解釋耐藥性的機(jī)理． 最近，隨著原核表觀遺傳研究進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)ＤＮＡ 甲基化修飾在原核細(xì)菌耐藥性的發(fā)展過程中，可能扮演了重要的作用［８９］． 例如，利用酶聯(lián)免疫技術(shù)比較分析對(duì)環(huán)丙沙星抗性的３０ 株Ｅ． ｃｏｌｉ 臨床分離物與１０ 株敏感分離物的ｍ５Ｃ 修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因組的甲基化修飾水平與抗藥性存在顯著的負(fù)相關(guān)［９０］． 在另一項(xiàng)研究中，利用表觀組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)抗生素處理結(jié)核桿菌細(xì)胞后，抗性相關(guān)的基因被高度甲基化［９１］． 這些研究說明細(xì)菌的表觀修飾與抗藥性存在一定的關(guān)聯(lián)性．

在抗生素適應(yīng)性的進(jìn)化中，許多細(xì)菌在亞致死劑量下均能快速發(fā)展出適應(yīng)性抗性． 有研究表明這種適應(yīng)性抗性的獲得與細(xì)菌表觀修飾有關(guān)［９２］． 例如適應(yīng)性抗性中，甲基化修飾能上調(diào)與抗藥性相關(guān)的ＲＮＤ 外排泵基因的表達(dá)量［９３］． 在Ｅ． ｃｏｌｉ 抗性菌株中，敲除Ｄａｍ 甲基化修飾也能影響ＲＮＤ 相關(guān)的基因表達(dá)［９４］． ＳｕｇＥ 是腸桿菌中的一個(gè)膜通道蛋白［９５］，與抗生素抗性有關(guān)，并且過表達(dá)能夠提高抗藥性［９６］． 在大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)ｄｃｍ 甲基化修飾能夠上調(diào)ＳｕｇＥ 的表達(dá)，并提高細(xì)胞的抗藥性［９７］． 這些研究例證表明，甲基化修飾可通過調(diào)控抗藥性相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響抗性． 最近，在研究ｍ５Ｃ 修飾對(duì)霍亂弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）抗氨基糖苷類抗生素（新霉素）的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)敲除孤生甲基化酶（ｖｃｈＭ）上調(diào)分子伴侶ｇｒｏＥＳＬ-２ 基因的表達(dá)，同時(shí)提高了抗性；將位于ｇｒｏＥＳＬ-２ 基因啟動(dòng)子的４ 個(gè)甲基化修飾基序（ＲＣＣＧＧＹ）突變后，抑制啟動(dòng)子的甲基化修飾，也得到同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這充分地證明了甲基化修飾對(duì)ｇｒｏＥＳＬ 基因的調(diào)控作用［９８］．

在抗生素的適應(yīng)性抗性中，甲基化修飾也可能通過提高基因的突變頻率，導(dǎo)致產(chǎn)生或者適應(yīng)藥物脅迫． 比如，ｄｃｍ 形成ｍ４Ｃ 甲基化修飾，可能因?yàn)椋恚矗?脫氨基反應(yīng)，導(dǎo)致Ｃ 轉(zhuǎn)換為Ｔ，從而在Ｄｃｍ 的識(shí)別位點(diǎn)（ＣＣＷＧＧ）誘發(fā)形成突變熱點(diǎn)． 通過對(duì)千余個(gè)Ｅ． ｃｏｌｉ 和沙門氏菌的臨床分離物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果分析表明在自然條件下ＣＣＷＧＧ 位點(diǎn)的突變頻率確實(shí)大大提高［９９］． 甲基化修飾導(dǎo)致的突變?cè)黾訜o疑對(duì)細(xì)菌適應(yīng)不同的環(huán)境，包括抗藥性都是有利的［１００］． Ｄａｍ對(duì)Ｅ． ｃｏｌｉ 抗藥性的研究表明，ＧＡＴＣ 甲基化修飾缺失導(dǎo)致對(duì)氨芐青霉素等的抗性顯著降低，但是在抗生素暴露下，ＧＡＴＣ 的甲基化水平?jīng)]有明顯的變化，說明甲基化修飾并不通過直接調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)影響抗性． 有趣的是，當(dāng)在ｄａｍ 缺失背景下，進(jìn)一步缺失ＤＮＡ 錯(cuò)配修復(fù)基因（ｍｕｔＨ 或ｍｕｔＳ）可以恢復(fù)細(xì)胞對(duì)氨芐的抗性，說明甲基化修飾缺失導(dǎo)致的抗生素敏感表型是因?yàn)椋模危?錯(cuò)配修復(fù)響應(yīng)抗性，在修復(fù)過程中，由于缺乏ＧＡＴＣ 信號(hào)，可能將錯(cuò)配ＤＮＡ 因?yàn)椋停酰簦?切割轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈斷裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡． 當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺失后，細(xì)胞通過忍耐相應(yīng)的錯(cuò)配突變，反而可能提升其存活率［１０１］．

５ 展望

綜上所述，ＲＭ 系統(tǒng)不僅具有防御功能，而且在細(xì)胞周期、基因表達(dá)調(diào)控、病原細(xì)菌表觀調(diào)控等方面也發(fā)揮了重要的作用． 雖然原核生物的ＤＮＡ甲基化修飾及其生物學(xué)功能的研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，但是原核生物的ＭＴａｓｅ 及其甲基化修飾系統(tǒng)極其復(fù)雜，其表觀調(diào)控模式和機(jī)制不僅存在多樣化的現(xiàn)象還兼具物種的特異性，有關(guān)ＭＴａｓｅ 及其甲基化修飾的研究仍較為有限． 因此，通過第三代ＤＮＡ 測(cè)序技術(shù)獲得甲基化組，聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組／ 蛋白組和表型分析等多技術(shù)手段，能夠快速鑒定甲基化表觀調(diào)控的基因集，進(jìn)而明確甲基化修飾的生物學(xué)功能和分子機(jī)制，并從新的視角應(yīng)對(duì)諸如細(xì)菌致病性、耐藥性以及進(jìn)化適應(yīng)等原核生物研究的重要挑戰(zhàn)，也為解析原核甲基化修飾表觀遺傳作用提供了新的方法［１３，３２，８９］．