金釵石斛原球莖誘導(dǎo)試管開花研究

摘 要：以金釵石斛原球莖為原材料，在培養(yǎng)基中添加BA、TDZ和ABA誘導(dǎo)花芽發(fā)生，探討了金釵石斛的試管開花過程，優(yōu)化了其提早開花體系。結(jié)果表明：單獨添加BA（0.2～2.0 mg/L）和低濃度的TDZ（0.02～0.10 mg/L）處理不能形成花芽。TDZ濃度提高到0.20 mg/L，開始有花芽形成，且花芽誘導(dǎo)率隨TDZ濃度的升高而升高，2.0 mg/L TDZ處理達(dá)到最大值26.7%。添加ABA預(yù)處理可以顯著提高花芽誘導(dǎo)率，1 mg/L ABA對花芽誘導(dǎo)效果更好。ABA預(yù)處理15 d后轉(zhuǎn)入TDZ誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，花芽誘導(dǎo)率隨TDZ濃度的提高而提高， 2 mg/L TDZ處理達(dá)到最高值76.7%。試管中開花植株莖葉不發(fā)達(dá)，花芽長度和開花直徑均顯著小于正常花，有少部分能夠正常開放，花期持續(xù)2～3周。試驗中金釵石斛從種子萌發(fā)到試管開花歷時5個月，營養(yǎng)生長所用的時間縮短至正常生長的1/6。

關(guān)鍵詞：金釵石斛；原球莖；試管開花；TDZ

中圖分類號：Q943.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2023）06-0034-04

Abstract：In this study， in vitro flowering of Dendrobium nobile from protocorm-like bodies induced by BA or TDZ and ABA was explored， and the early flowering system was optimized. The results were as follows： BA alone couldn't induce floral buds formation in the test range （0.2-2.0 mg/L） among 4 months， and a small dose （0.02-0.10 mg/L） of TDZ couldn't either. When TDZ concentration was increased to 0.20 mg/L， floral buds began to form， meanwhile the initiation rate of floral buds increased with the increasing of TDZ concentration， reaching the maximum （26.7%） at 2.0 mg/L of TDZ. On the other hand， a remarkable promoting effect of ABA pretreatment on floral bud induction was observed， especially 1 mg/L of ABA led to a higher induction rate. When the protocorms were first cultured on ABA-containing （1 mg/L） medium for 15 d and then transferred onto TDZ （2 mg/L） medium， it obtained the highest rate of flower formation （76.7 %）. Growth of these in vitro miniature plants was restricted so that most of their stems and leaves were undeveloped， and their floral bud length and flower diameter were significantly smaller than those of normal flowers， of which a small part could flower normally. The flowering period could last 2-3 weeks. We use protocorms as starting materials， in vitro floral buds were observed about five months after seed germination. The time taken for vegetative growth in vitro was shorten to 1/6 of that in greenhouse， providing theoretical reference for the induction of Dendrobium in vitro flowering and the breeding of new varieties.

Key words： Dendrobium nobile; protocorm; in vitro flowering; TDZ

花的形成是高等植物所特有的一種生理現(xiàn)象，開花啟動的整個生理學(xué)過程是十分復(fù)雜的，因此至今整個開花過程的機制仍不十分明確。許多內(nèi)在和環(huán)境的因子都會影響開花過程，但在很大程度上，這些因子都是通過影響到植物的內(nèi)源激素水平而調(diào)節(jié)花的發(fā)端和發(fā)育的[1]。在自然條件下，蘭花對生長環(huán)境要求苛刻，而且從種子到開花需要很久的時間，這主要是由于蘭花的幼年期比較長，達(dá)30個月[2]，幼年期不能進行開花結(jié)果。利用組織培養(yǎng)的方法，縮短營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的年限，這樣一個體系的建立不僅為研究蘭花的開花啟動和發(fā)育提供了一個模式系統(tǒng)，同時也使得人們可以對蘭花的開花性狀進行早期鑒定，縮短育種周期，減少工作量。

在過去的幾十年間，蘭花的試管開花研究工作取得了一定的進展。大量的研究表明，許多外在條件包括培養(yǎng)基營養(yǎng)成分[3-8]，激素成份和濃度[9-14]，植株成熟度[8-9，14]，培養(yǎng)溫度[3，7-9]等條件，對蘭花的試管開花起著重要的作用。筆者用原球莖進行誘導(dǎo)，相對幼苗誘導(dǎo)進一步縮短營養(yǎng)生長時間，用ABA預(yù)處理結(jié)合TDZ處理，得到較高的花芽誘導(dǎo)率，為石斛蘭試管花誘導(dǎo)和新品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

取當(dāng)年成熟且未開裂的蒴果進行無菌播種，一個月后種子轉(zhuǎn)綠萌發(fā)并長成原球莖，取剛剛分化出頂芽的原球莖進行試管開花的誘導(dǎo)處理。用改良的1/2MS培養(yǎng)基（1/4氮、2.5倍磷）作為基本培養(yǎng)基，提高蔗糖濃度至4%，瓊脂0.7%，添加椰汁15%，pH值5.6。

1.2 細(xì)胞分裂素對試管開花的影響

原球莖放在不同濃度的BA和TDZ培養(yǎng)基中誘導(dǎo)花芽。BA設(shè)置濃度梯度：0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L；TDZ低濃度：0.02、0.05、0.10 mg/L；TDZ高濃度：0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L。

試驗材料培養(yǎng)在盛有33 mL培養(yǎng)基的玻璃瓶中，每瓶5株，每個處理設(shè)8瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度50～60 μmol/m2·s，光照時間 12 h/d。每月更換培養(yǎng)基，每周記錄花芽誘導(dǎo)情況。

1.3 TDZ結(jié)合ABA對試管開花的影響

用不同濃度的ABA處理剛剛開始萌發(fā)的原球莖，ABA濃度梯度設(shè)置為0.5、1.0、2.0 mg/L。分別處理15、30、45 d后，轉(zhuǎn)入不同濃度的TDZ誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，TDZ濃度梯度為0.5、1.0 、2.0 mg/L。預(yù)處理過程中記錄原球莖生長情況。TDZ誘導(dǎo)開花時，每月更換培養(yǎng)基，每周記錄花芽誘導(dǎo)情況。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每處理8瓶，每瓶5株，重復(fù)3次。4個月后統(tǒng)計花芽誘導(dǎo)率（花芽數(shù)占處理植株數(shù)的百分比），花序誘導(dǎo)率（花序數(shù)占誘導(dǎo)花芽數(shù)的百分比），及開花率（開花的花芽占誘導(dǎo)花芽數(shù)的百分比）。用Excel和SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著性分析用的是Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞分裂素對試管開花的影響

單獨的BA處理，在所試范圍BA（0.2～2.0 mg/L）內(nèi)，誘導(dǎo)4個月后，仍無花芽形成。低濃度的TDZ（0.02～0.1 mg/L）處理，誘導(dǎo)4個月后，仍無花芽形成（表1、圖1A）。從表1可以看出，當(dāng)TDZ濃度提高到0.2 mg/L時，開始有花芽形成，且花芽誘導(dǎo)率隨著TDZ濃度的升高而升高，當(dāng)TDZ濃度為2.0 mg/L時達(dá)到最大值26.7%。而TDZ濃度繼續(xù)升高到4.0 mg/L時，花芽誘導(dǎo)率下降至15.0%。

TDZ濃度達(dá)到1.0 mg/L時，開始有花序形成，即一支花序梗上有2～3個花芽，花序誘導(dǎo)率隨著TDZ濃度的升高而升高，當(dāng)TDZ濃度達(dá)到4.0 mg/L時，在發(fā)生花原基誘導(dǎo)的植株中，91.7%形成了花序。形成的花芽中，只有少部分能夠正常開放，TDZ濃度越高，開花率越低。TDZ濃度高于1.0 mg/L時，形成的花芽大部分未能正常開放就枯萎凋謝了。

2.2 TDZ結(jié)合ABA對試管開花的影響

從表1及圖1可以看出，單獨的細(xì)胞分裂素處理，花芽的誘導(dǎo)率不高，所以添加ABA預(yù)處理，即先將原球莖在含有ABA的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)15、30 d后，再轉(zhuǎn)入TDZ誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，結(jié)果見表2。

在ABA預(yù)處理培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，再轉(zhuǎn)入TDZ誘導(dǎo)培養(yǎng)基，2個月后，幼苗的高度僅為0.2 cm 左右，且植株瘦弱，顏色發(fā)黃；同條件下預(yù)處理15 d的苗則生長較好，高度達(dá)到1 cm 左右，葉色鮮綠。因此，ABA預(yù)處理時間的加長，會明顯阻礙原球莖的發(fā)育和幼苗的生長，生長不良的植株很難進一步誘導(dǎo)花芽；預(yù)處理時間為15 d，對苗生長的不利影響較小，在后續(xù)試驗中也發(fā)現(xiàn)，15 d的ABA預(yù)處理，能夠?qū)ㄑ康男纬僧a(chǎn)生促進作用。

不同的ABA濃度，預(yù)處理效果不同。在所試范圍內(nèi)，ABA濃度為1.0 mg/L時，誘導(dǎo)效果更好?？赡軡舛容^低（0.5 mg/L）時，達(dá)不到誘導(dǎo)效果；而濃度過高（2.0 mg/L）又對苗的生長產(chǎn)生不利影響。

從表2可以看出，將原球莖用ABA進行預(yù)處理后再用TDZ進行花芽誘導(dǎo)，比單獨的TDZ誘導(dǎo)效果更加顯著。經(jīng)ABA預(yù)處理后轉(zhuǎn)入不同濃度的TDZ誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在所試驗范圍內(nèi)，花芽誘導(dǎo)率隨TDZ濃度的增加而增加，用1.0 mg/L ABA進行預(yù)處理后轉(zhuǎn)入TDZ濃度為2.0 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中時，獲得最高花芽誘導(dǎo)率76.7%。

在ABA預(yù)處理的情況下，原球莖經(jīng)過極短的營養(yǎng)生長期后，便開始形成花芽，此時整個植株僅1～2 cm高，除了單獨的頂生花，還有部分花序的形成（圖2）， TDZ濃度越高，花序形成的百分比就越高，當(dāng)TDZ為2.0 mg/L時，花序誘導(dǎo)率達(dá)到70.3%以上。

形成的花芽只有一部分能夠正常開放，花芽開放率是隨著TDZ濃度的升高而降低的，當(dāng)TDZ濃度較高（2.0 mg/L）時，只有4%～7%的花芽能夠正常開放。經(jīng)過ABA預(yù)處理后形成的花芽，在低濃度的TDZ中，開花率較高，最高可達(dá)到83.3%。

2.3 親本植株和試管植株在開花特性上的比較

正常培養(yǎng)情況下，金釵石斛營養(yǎng)生長的時間約為30個月，而試驗中，從種子萌發(fā)到試管開花歷時5個月，營養(yǎng)生長所用的時間縮短至正常生長的1/6。試管中的花芽僅長0.2～0.5 cm，顯著小于正?；ㄑ浚▓D3），開放的花花瓣白色加淡紫色，每花序 上有1～3朵花芽，開放的花直徑僅為0.8～1.2cm，這

樣的小植株，營養(yǎng)體的發(fā)育受到限制，莖葉不發(fā)達(dá)。大多數(shù)開放的花芽花器官出現(xiàn)畸形，花的結(jié)構(gòu)不完整，部分或全部萼片（花瓣）很小或缺失（圖3），只有少部分完全花，合蕊柱亦較?。▓D4）。花期可持續(xù)2～3周。

3 討論與結(jié)論

6-BA是組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)蘭花花芽常用的一種細(xì)胞分裂素，它能有效促進多種蘭花的試管開花[5-6，10-15]，但在試驗中，在所試范圍內(nèi)單獨的BA處理未能誘導(dǎo)花芽形成。這與一些對熱帶蘭的研究結(jié)果相悖，如Dendrobium Chao Praya Smile [5]和Dendrobium sonia 17 [6]。對于這些熱帶蘭花，其開花過程是不需要低溫的，而對于溫帶石斛蘭，低溫是其發(fā)生生殖轉(zhuǎn)變的重要因子，從這一點上，可以說金釵石斛的花芽形成過程更復(fù)雜一些。王再花[16]曾用2～3個月的籽幼苗作為起始材料，用含有BA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)了少量植株形成花芽，可能那時的苗比原球莖成熟，本身已經(jīng)積累一些開花物質(zhì)。

有研究表明，添加TDZ會對植株內(nèi)源生長素和其他細(xì)胞分裂素產(chǎn)生影響，認(rèn)為生長素和細(xì)胞分裂素都對試管開花的誘導(dǎo)有影響，因此TDZ可能對花的形成有更直接的作用，此次試驗結(jié)果與之相符。有研究表明石斛的試管開花與內(nèi)源iP和iPA的增加有關(guān)，而另一個研究表明，加入TDZ可以明顯提高iP和iPA的濃度，這也間接印證了TDZ是促進石斛蘭的試管開花的。但單獨的TDZ處理花芽誘導(dǎo)率比較低，因此可能需要更多的因子才能影響春石斛的開花。

進一步用ABA預(yù)處理，之后再轉(zhuǎn)入TDZ誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，花芽誘導(dǎo)率大大提高，形成了大量頂生花芽和花序。說明ABA確實對花芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生了巨大的促進作用。曾艷華等研究也證實了ABA含量對花芽誘導(dǎo)有一定的積極作用[17]。但是單獨的ABA不會對花芽誘導(dǎo)產(chǎn)生很大的影響，而且ABA處理時間過長會對植物生長產(chǎn)生抑制作用。ABA對很多短日照的植物開花都具有促進作用，在促進石斛開花的文獻中也有過報道，王愛華和黎靜用TDZ聯(lián)合NAA進行處理，其花芽誘導(dǎo)率最高達(dá)50%[18]。推測ABA可能作為一種脅迫信號，促進植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變。也可能ABA類似一種春化信號，使植株不必經(jīng)過低溫，就可進入生殖轉(zhuǎn)變。

用金釵石斛原球莖作為起始材料，改良的1/2MS作為基本培養(yǎng)基，原球莖用ABA進行預(yù)處理，然后轉(zhuǎn)入TDZ誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，可得到高的花芽誘導(dǎo)率。試管花的花芽長度和開花直徑均顯著小于正常花，形成的花很多都是畸形花或不完全花，說明花的形成和發(fā)育是一個復(fù)雜的生理過程，還有待進一步的研究。

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（責(zé)任編輯：高國賦）