氨磺靈誘導(dǎo)人參果“圓果”多倍體初探?

摘 要：為探尋高效的人參果多倍體誘導(dǎo)條件，以“圓果”為供試品種，以0.02%的氨磺靈溶液為誘變劑，考察不同處理時間（3、6、9、12 h）對人參果組培苗死亡率和變異情況的影響，以變異植株的形態(tài)指標(biāo)、葉片氣孔狀態(tài)和染色體倍性為指標(biāo)確定最佳處理時間。結(jié)果表明：當(dāng)氨磺靈濃度為0.02%時，隨著處理時間的延長，人參果組培苗的死亡率逐漸增加，而變異率逐漸降低；以處理3 h的組培苗死亡率最低，為20%，變異率最高，為58.33%；經(jīng)計算，0.02%的氨磺靈溶液對人參果“圓果”組培苗的半致死時間為19.40 h；在試驗(yàn)設(shè)置的處理時間（3～12 h）內(nèi)，獲得的變異植株呈現(xiàn)出植株矮小、莖段增粗、節(jié)間縮短、葉片大且增厚、顏色較深、根增粗、出現(xiàn)變形葉、氣孔較二倍體大、單位面積上氣孔數(shù)量變少等特征；經(jīng)流式細(xì)胞儀分析初步判定變異植株為多倍體。綜合結(jié)果表明，在0.02%氨磺靈溶液中浸泡3 h，誘導(dǎo)人參果“圓果”組培苗產(chǎn)生多倍體新種質(zhì)的效果最好。

關(guān)鍵詞：人參果；氨磺靈；誘變；變異率；半致死時間

中圖分類號：S722.35 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2023）06-0001-06

Abstract：This study aims to explore the conditions for oryzalin efficiently inducing polyploidy of Solanum muricatum Aiton. The tissue culture seedlings of S. muricatum 'Yuanguo' were soaked in 0.02% oryzalin solution for 3 h， 6 h， 9 h and 12 h， respectively. The mortality and variation rate were counted， and the morphological indicators， leaf stomata status and chromosome ploidy of the mutant plants were detected so as to determine the optimal soaking time. The results showed that when the concentration of oryzalin was 0.02%， with the prolongation of soaking time， the mortality of the tissue culture seedlings gradually increased， but the variation rate gradually decreased. The highest variation rate of 58.33% and the lowest mortality of 20% were achieved after soaking for 3 h. The half-lethal time （LT50） of the mutants induced by 0.02% oryzalin was 19.40 h. Within the set treatment time periods （3-12 h）， the obtained mutants were mainly characterized by short plants， thicker stems， shorter internodes， larger and thicker leaves， darker color， thicker roots， deformed leaves， larger stomata， and fewer stomata per unit area compared with the diploids'. The mutant strains were identified as polyploid by flow cytometry. In sum， soaking the stem with buds in 0.02% oryzalin solution for 3 h had the best effect on inducing the polyploidy of S. muricatum 'Yuanguo'.

Key words：Solanum muricatum Aiton; oryzalin; mutagenesis; variation rate; half-lethal time

人參果（Solanum muricatum Aiton）原名香瓜茄、香艷梨、香艷茄等[1]，原產(chǎn)南美洲，為茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum）多年生雙子葉草本植物，成熟果實(shí)為金黃色或乳色并帶有紫色斑紋，花冠為白色或淡紫色，根系比較發(fā)達(dá)[2-3]。人參果果實(shí)低糖、低脂肪、高蛋白，果肉清爽多汁，含有多種維生素和微量元素，被譽(yù)為“綠色保健品”，有很大的發(fā)展?jié)摿?，廣受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛[4-5]。但目前人參果品種單一，缺乏優(yōu)良新品種，且品種退化嚴(yán)重，植株抗性差，病蟲害較嚴(yán)重，易感染疫病，尤其是在高溫多雨季節(jié)病害高發(fā)[6-7]。研究表明，多倍體植物有較強(qiáng)的抗逆性及抗病性[8]。于是近年來關(guān)于人參果多倍體的育種研究成為熱點(diǎn)。這對于人參果產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的意義。

目前，獲得多倍體的方式有2種，即自然誘導(dǎo)和人工誘導(dǎo)[9]。在植物多倍體育種中自然誘導(dǎo)存在隨機(jī)性且頻率較低，因此在研究中多采用人工誘導(dǎo)方式進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)。人工誘導(dǎo)多倍體常用的方法有生物誘導(dǎo)、物理誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)等[10]。在園藝植物多倍體育種中主要依靠秋水仙素（colchicine）和氨磺靈（oryzalin）來完成誘變。秋水仙素的毒性比氨磺靈強(qiáng)且使用濃度較高，其誘變原理主要是阻礙有絲分裂中紡錘體的形成和功能，導(dǎo)致染色體不分離進(jìn)行多倍體育種；而氨磺靈具有與植物蛋白親和力高、與動物蛋白親和力低的特點(diǎn)，在進(jìn)行植物多倍體誘導(dǎo)時效率高、污染小，使用濃度低，成本較低[11-12]，其誘變原理是通過抑制細(xì)胞有絲分裂達(dá)到低濃度、高效率誘導(dǎo)細(xì)胞染色體加倍。目前，秋水仙素已在曼陀羅[13]、蘋果[14]、桃[15]、梨[16]、核桃[17]、半枝蓮[18]、西瓜[19]等園藝植物應(yīng)用，并成功誘導(dǎo)出多倍體；而氨磺靈在雜交蘭“黃金小神童”[20]、四倍體蘿卜[21]、彩色馬蹄蓮[22]、半枝蓮[23]等植物誘變育種中得到應(yīng)用，并獲得了新種質(zhì)資源。相關(guān)研究表明，秋水仙素可以誘導(dǎo)人參果多倍體[24]，但尚無氨磺靈誘導(dǎo)人參果多倍體的報道。筆者以人參果“圓果”為材料，以氨磺靈為誘變劑，考察不同處理時間對人參果植株死亡率和變異情況的影響，以變異植株的形態(tài)指標(biāo)、葉片氣孔狀態(tài)和染色體倍性為指標(biāo)確定最佳處理時間，以期探尋高效的人參果多倍體誘導(dǎo)條件，為人參果種質(zhì)創(chuàng)新和育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年7月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院花卉研究室進(jìn)行。供試材料人參果“圓果”組培苗由園林園藝學(xué)院花卉研究室提供。供試氨磺靈購于美博科技有限公司，純度95%。供試培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+40 g/L香蕉+40 g/L土豆+30 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂，pH值為5.8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 氨磺靈處理方法 配制濃度為0.02%的氨磺靈溶液，在無菌組培室中，將健壯無病毒人參果組培苗去除葉片之后保留莖，并將其剪至1～2 cm長的小段，設(shè)置5個處理，其中X1、X2、X3、X4處理是在避光條件下將剪好的莖段置于氨磺靈溶液中分別浸泡3、6、9和12 h，以不做任何處理的莖段作空白對照；處理結(jié)束后將人參果莖段接種到MS培養(yǎng)基上，在pH值5.8、相對濕度[RH（75±5）%]、溫度（22±2）℃、14 h/d的光照周期、光照強(qiáng)度 1 800～2 500 lx的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每個處理10個莖段，重復(fù)3次。

1.2.2 測量指標(biāo)及方法 （1）形態(tài)鑒定：當(dāng)變異植株生長45 d后進(jìn)行測量。測量葉長、葉寬、葉片數(shù)、株高和莖粗，根據(jù)形態(tài)觀察法，確定變異植株，計算變異率。（2）氣孔觀察：取植株明顯變異的葉片，用膠帶撕取葉片下表皮制片，在40倍顯微鏡下觀察單位面積上葉片的氣孔大小和密度。（3）染色體倍性鑒定：采用德國Partec公司生產(chǎn)的簡潔式流式細(xì)胞儀（CyFlow? PA）檢測植株葉片細(xì)胞核內(nèi)DNA的相對含量，比較其與對照植株（二倍體）的差異，并以此判斷變異材料的數(shù)量，并計算變異率。變異率=變異數(shù)/總處理數(shù)×100%。（4）半致死時間（LT50）計算：根據(jù)各濃度氨磺靈處理的植株死亡（植株出現(xiàn)褐化）數(shù)據(jù)獲得散點(diǎn)圖，通過SPSS軟件擬合成線性回歸方程，代入方程計算出半致死時間。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016軟件整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行方差分析，利用最小顯著性差異法（LSD）進(jìn)行單因素顯著性分析，P＜0.05即為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨磺靈處理不同時間對人參果死亡率和變異率的影響

由表1可得，在濃度為0.02%的氨磺靈溶液中浸泡不同時間，人參果“圓果”組培苗的死亡率和變異率有所差異。CK的死亡率和變異率都為0，X1處理下人參果組培苗的死亡率為20.00%，分別比X2、X3、X4處理低3.33、10.00和16.67個百分點(diǎn)，各處理死亡率大小按順序排列依次為X4＞X3＞X2＞X1＞CK，表明浸泡時間與組培苗死亡率成正比，即浸泡時間越長，死亡率越高；同時X1處理下變異率為58.33%，分別比X2、X3、X4處理高1.81、15.47和21.49個百分點(diǎn)，各處理變異率大小按順序排列依次為X1＞X2＞X3＞X4＞CK，表明浸泡時間與變異率成反比，即處理時間越長，變異率越低。以上結(jié)果表明，人參果“圓果”在氨磺靈濃度為 0.02%、浸泡3 h的條件下，植株變異率最高，達(dá)58.33%。

2.2 氨磺靈處理不同時間對人參果半致死時間的影響

由圖1可知，處理時間和死亡率呈正比，即處理時間越長，死亡率越高，其線性回歸方程為y=1.889 3x+13.33，R2=0.979 6，該回歸方程預(yù)測可靠程度為96.90%，預(yù)測程度高。根據(jù)線性回歸方程，可計算出半致死時間為19.40 h。

2.3 氨磺靈處理不同時間對變異植株形態(tài)指標(biāo)的影響

由表2可知，在濃度為0.02%的氨磺靈溶液中處理不同時間，人參果組培苗的形態(tài)差異顯著。X1處理下葉長最長，為1.46 cm，分別比X3、X4、X2、CK處理長0.28、0.34、0.40和0.73 cm；各處理葉長按長短順序排列依次為X1＞X3＞X4＞X2＞CK；其中，CK、X2、X3、X4與X1處理的差異顯著，而X2、X3、X4處理間差異不顯著但與CK 差異顯著。X1處理下葉寬最寬，為0.90 cm，分別比X3、X2、X4、CK處理寬0.23、0.32、0.34和0.44 cm，差異均達(dá)顯著水平；各處理葉寬按寬窄順序排列依次為X1＞X3＞X2＞X4＞CK；其中，X2、X3、X1與CK處理的顯著差異，而X2、X3、X4處理間差異不顯著，同時X4與CK處理的差異不顯著。X1處理下葉片數(shù)最多，為13片，分別比X2、CK、X3、X4處理多0.80、1.34、2.33和2.33片；各處理間葉片數(shù)按多少順序排列依次為X1＞X2＞CK＞X3＞X4；其中，X3、X4與X1處理的差異顯著，其他處理間差異不顯著。CK處理下株高最高，為8.40 cm，分別比X4、X3、X2、X1處理高3.34、3.58、4.52和4.58 cm，差異均達(dá)顯著水平；各處理間株高按高矮順序排列依次為CK＞X4＞X3＞X2＞X1；其中，X1與X2、X3與X4的差異不顯著，但X1、X2與X3、X4的差異顯著。X1處理下莖粗最粗，為1.75 cm，分別比X2、X4、X3、CK處理粗0.57、0.59、0.73和0.85 cm，差異均達(dá)顯著水平；各處理莖粗按粗細(xì)順序排列依次為X1＞X2＞X4＞X3＞CK；其中，X2、X4與CK差異顯著。

從圖2可以看出，與對照相比，氨磺靈處理下的人參果組培苗植株矮小，莖段增粗，顏色加深，節(jié)間縮短；葉片大且厚，同一植株上的葉片大小差異顯著，并出現(xiàn)變形葉；根增粗，植株整體多毛。這表明氨磺靈處理對人參果“圓果”植株的外部形態(tài)有一定增壯作用。

2.4 氨磺靈處理不同時間對人參果變異植株氣孔發(fā)育的影響

利用植株葉片單位面積上氣孔大小及密度來鑒定植株倍性是一種便捷準(zhǔn)確的方法。如圖3所示，人參果“圓果”組培苗經(jīng)過氨磺靈處理后，其變異植株（VP）葉片下表皮的氣孔體積和密度發(fā)生了一定的變化，與對照植株（二倍體）的氣孔相比，變異植株的氣孔明顯變大，單位面積上氣孔數(shù)量明顯比對照植株少。由此表明，氨磺靈處理讓人參果“圓果”組培苗發(fā)生了變異。

2.5 氨磺靈處理后人參果植株的倍性分析

如圖4所示，采用流式細(xì)胞儀測定處理后組培苗葉片中細(xì)胞核的DNA含量，根據(jù)峰值圖判斷植株倍性。圖4A在相對熒光強(qiáng)度102處出現(xiàn)2個高峰，由于高峰橫坐標(biāo)位置相對于圖4E明顯右移，所以初步判斷VP1為多倍體。圖4B和圖4C與圖4E對比，在相對熒光強(qiáng)度101處出現(xiàn)2個高峰，第二高峰橫坐標(biāo)位置發(fā)生右移，因此認(rèn)為VP2和VP3是嵌合體。圖4D與圖4E相比，只出現(xiàn)一個高峰，高峰橫坐標(biāo)位置相對于圖4E明顯右移，因此判斷VP4為多倍體。

3 結(jié)論與討論

氨磺靈和秋水仙素作為誘導(dǎo)植物多倍體的常用化學(xué)誘變劑，其處理濃度和處理時間是關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)[12]。楊玉雙等[25]研究表明，用氨磺靈和秋水仙素誘導(dǎo)橡膠草四倍體時，氨磺靈處理的存活率和變異率均高于秋水仙素；李映樂等[24]以人參果“圓果”為材料，秋水仙素處理濃度為0.2%，處理時間為18 h，人參果“圓果”多倍體誘導(dǎo)率最高為53.33%。何建等[26]利用胺磺靈（Oryzalin）誘導(dǎo)椪柑四倍體的研究表明，氨磺靈濃度為40 mg/L，處理時間2 d，變異率最高為13.3%。張錫慶等[22]利用Oryzalin誘導(dǎo)彩色馬蹄蓮多倍體的研究表明，Oryzalin濃度為0.0016%、處理時間為36 h時效果最好，變異率為34%。筆者在進(jìn)行濃度梯度預(yù)試驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，0.02%的氨磺靈誘導(dǎo)效果明顯，因此，該研究以0.02%的氨磺靈作為誘導(dǎo)多倍體的濃度。試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)氨磺靈濃度為0.02%、處理時間為3 h時，人參果“圓果”的多倍體誘導(dǎo)率最高，達(dá)58.33%。目前，石林縣人參果主要以“圓果2號”為主，該品種果實(shí)為圓形，成熟的果實(shí)為金黃色或淡黃色并帶有紫色條紋，表面比較光滑，含糖量較高，口感好、品質(zhì)佳[6]。但多年種植下來，品種逐漸退化，病蟲害也日趨嚴(yán)重，因此以人參果“圓果”為材料進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)具有一定的優(yōu)勢，從中獲取優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的可能性較大。

研究表明，在化學(xué)誘變?nèi)旧w加倍過程中誘變類型、誘變劑濃度、處理時間會影響植物染色體加倍的效果。一般認(rèn)為，誘變劑濃度低可以刺激愈傷組織的再生和植株再生，隨著誘變劑濃度的增加，死亡率會逐漸增加[27-28]。李映樂等[24]在秋水仙素誘導(dǎo)人參果“圓果”多倍體的研究中以及張錫慶等[22]在Oryzalin誘導(dǎo)彩色馬蹄蓮多倍體的研究中均表明，處理材料的存活率和變異率與處理時間呈反比，即處理時間越長，存活率越低。筆者的試驗(yàn)結(jié)果表明，同一處理濃度時，處理時間和存活率成反比，即處理時間越長，存活率越低，與前人的研究結(jié)果一致；但是，同一濃度處理時，處理時間與變異率成反比，即處理時間越長，變異率越低，與前人的研究結(jié)果不一致。這可能與誘變劑的作用原理及供試品種不同有關(guān)，其原因有待進(jìn)一步研究。

與二倍體植株相比，多倍體植株的葉面積變大、葉色變深、根莖增粗、莖干粗壯且葉距變大、單位葉面積氣孔數(shù)目減少，表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性[29]。儲麗紅等[30]以安祖花為材料誘導(dǎo)多倍體時發(fā)現(xiàn)，四倍體植株較二倍體植株有明顯差異；段登文等[31]以苣苔莖尖為材料進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)，變異植株表現(xiàn)出葉大、節(jié)間縮短、葉色加深、氣孔變大、氣孔密度減小等特征。筆者的試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照植株（二倍體）相比，氨磺靈誘導(dǎo)的人參果“圓果”多倍體變異植株表現(xiàn)出植株矮小、根莖粗、植株多毛、葉大且單位面積上氣孔大且密度小的特征，這些多倍體的形態(tài)和細(xì)胞變異特征符合一般多倍體的變異規(guī)律，與前人的研究結(jié)果一致。

該試驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀比較了變異植株與對照植株的細(xì)胞核DNA含量，并依據(jù)結(jié)果初步判斷變異植株為多倍體和嵌合體。岳敏[23]在氨磺靈離體誘導(dǎo)半枝蓮多倍體的研究中指出，出現(xiàn)嵌合體的原因可能是因?yàn)樘幱谕环至哑诘募?xì)胞數(shù)目相對較少，而與多倍體細(xì)胞相比，正常二倍體的細(xì)胞生活力強(qiáng)、分裂快，從而淹沒了多倍體的細(xì)胞，使植株產(chǎn)生了回復(fù)突變。因此，筆者下一步將開展變異植株倍性純化分離的相關(guān)研究，期望獲得多倍體人參果“圓果”的新種質(zhì)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，用濃度為0.02%的氨磺靈溶液浸泡人參果“圓果”組培苗莖段3 h，組培苗的死亡率最低，為20%，變異率最高，為58.33%；經(jīng)計算，0.02%的氨磺靈溶液對人參果“圓果”組培苗的半致死時間為19.40 h；在試驗(yàn)設(shè)置的處理時間（3～12 h）內(nèi)，獲得的變異植株呈現(xiàn)出植株矮小、莖段增粗，節(jié)間縮短、葉片大且增厚、顏色較深、根增粗、出現(xiàn)變形葉、氣孔較二倍體大、單位面積上氣孔數(shù)量變少等特征；經(jīng)流式細(xì)胞儀分析初步判定變異植株為多倍體。綜合結(jié)果表明，在0.02%氨磺靈溶液中浸泡3 h，誘導(dǎo)人參果“圓果”組培苗產(chǎn)生多倍體新種質(zhì)的效果最好。

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