千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)分析

摘要：TALE轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)發(fā)揮著重要作用。本研究在千穗谷（Amaranthus hypochondriacus）基因組中共鑒定出11個(gè)TALE基因。系統(tǒng)發(fā)育分析將千穗谷TALE家族蛋白分為BELL和KNOX兩個(gè)亞家族，同一亞家族中的AhTALEs基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)，編碼蛋白也具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)域。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析都表明AhTALEs蛋白由螺旋-角-螺旋的結(jié)構(gòu)構(gòu)成。此外，對(duì)千穗谷與其他物種的TALE基因共線性關(guān)系、組織表達(dá)特性和AhTALEs基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，不同AhTALEs亞家族在各組織中的表達(dá)模式不同，并且發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)包含大量非生物脅迫和激素響應(yīng)元件，這為AhTALE家族的進(jìn)化分析提供了依據(jù)。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)AhTALEs基因在低溫和干旱脅迫下的表達(dá)水平有不同程度的變化，表明AhTALEs基因能夠響應(yīng)低溫和干旱脅迫應(yīng)答。本研究為開(kāi)展千穗谷中TALE轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中的生物學(xué)功能研究提供了重要參考。

關(guān)鍵詞：千穗谷；TALE；基因家族；低溫；干旱

中圖分類(lèi)號(hào)：S344.13文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-0435（2023）03-0676-12

Bioinformatics Analysis of the TALE Transcription Factor

Family in Amaranthus hypochondriacus

ZHOU Min1，2， ZHOU Tao1，2， XU Qian1，2， LU Rui1，2，

LIU Ming-xi1，2*， HU Long-xing1，2*

（1. Department of Pratacultural Science， College of Agronomy， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan

Province 410128， China; 2. Hunan Grassland Research Center， Changsha， Hunan Province 410128， China）

Abstract：TALE transcription factors widely present in plants and play an important role in plant growth and organ development and response to the environment. In this study，11 TALE genes were identified in the genome of Amaranthus hypochondriacus. By the phylogenetic analysis，the AhTALEs family was divided into BELL and KNOX subfamilies. The AhTALEs genes have a similar genetic structure in the same subfamily，and the encoding protein also has similar domains. The secondary structure and tertiary structure analysis of the AhTALEs family protein showed that it was composed of helical-angular-helical structure. In addition，the syntenic relations of the four species were analyzed，which provided the basis for the evolution of the AhTALE family. Analysis of tissue expression characteristics showed that the expression patterns of different AhTALE subfamilies were different in different tissues. Analysis of cis-acting elements in the promoter region of AhTALEs gene revealed a large number of elements in response to abiotic stresses and hormones existed. Subsequently，the qRT-PCR analysis showed that the expression level of AhTALEs gene changed in different degrees under low temperature and drought stress，indicating that AhTALEs gene could take a response to low temperature and drought stress. This study provided an important reference for the biological function of TALE transcription factor in A. hypochondriacus in response to abiotic stresses.

Key words：Amaranthus hypochondriacus;TALE;Gene family;Low temperature;Drought

三胺酸環(huán)延伸（Three-amino acid loop extension，TALE）轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)以及對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)中均發(fā)揮著重要作用。TALE轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)特殊的同源異型盒基因（Homeobox gene），最早于果蠅的基因組中被發(fā)現(xiàn)［1］，后來(lái)陸續(xù)在多種生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)其同源基因［2-4］。目前TALE轉(zhuǎn)錄因子已在多種植物中被鑒定，小麥（Triticum aestivum）中有70個(gè)［5］，大豆（Glycine max）中有68個(gè)［6］，番茄（Solanum lycopersicum）中有24個(gè)［7］，楊樹(shù)（Populus simonii）中有35個(gè)［8］，蘿卜（Raphanus sativus）中有33個(gè)［9］。典型的同源異型盒保守結(jié)構(gòu)域由60個(gè)氨基酸組成并形成3個(gè)螺旋區(qū)域，第一和第二螺旋形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，第二和第三螺旋形成螺旋-角-螺旋的結(jié)構(gòu)［10］。TALE轉(zhuǎn)錄因子編碼1個(gè)由63個(gè)氨基酸組成的非典型同源結(jié)構(gòu)域，額外的3個(gè)氨基酸（P、Y、P）殘基存在于第一螺旋區(qū)域和第二螺旋區(qū)域之間［11-13］。

TALE轉(zhuǎn)錄因子可分為兩類(lèi)：BELL亞家族和KNOX亞家族。BELL亞家族成員包含POX和Homeodomain兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其主要功能是調(diào)控分生組織和花的發(fā)育［14］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtBEL1可以調(diào)控胚囊中心皮組織和胚珠之間的轉(zhuǎn)換［15］，AtBEL1基因功能的缺失則會(huì)阻礙珠被的發(fā)育［16］。在玉米（Zea mays）中，ZmBLH12與ZmBLH14能夠同時(shí)與ZmKN1互作，blh12/14的雙突變體不能維持腋生分生組織表型，且blh12/14雙突變體還表現(xiàn)出雄穗分枝異常以及過(guò)早的節(jié)間分化，導(dǎo)致植株矮化，葉脈減少［17］。BELL家族成員還能促進(jìn)次生細(xì)胞壁形成和果實(shí)成熟。比如，番茄中的SlBL4參與了果實(shí)成熟過(guò)程中的細(xì)胞壁代謝和類(lèi)胡蘿卜素的積累［18］。水稻（Oryza sativa）中的OsBLH6參與了次生細(xì)胞壁的形成［19］。

KNOX亞家族成員主要包括KNOX1，KONX2、ELK以及Homeodomain四個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。KNOX類(lèi)基因在被子植物的根、莖、葉和花中均有表達(dá)，主要參與調(diào)節(jié)植物器官的分化［20-22］。擬南芥中KNAT1和STM基因的表達(dá)產(chǎn)生amp1突變體的表型，表現(xiàn)為葉片裂生頻率更高、分枝增加和開(kāi)花時(shí)間提前等［23-25］。在番茄中，TKN2和TKN4在果實(shí)中表達(dá)并調(diào)控果實(shí)中葉綠素的合成及分布［26］。蒺藜苜蓿MtKNAT3/4/5-like可以激活MtEFD/MtRR4的表達(dá)，限制細(xì)胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻止根瘤菌進(jìn)一步侵染，從而控制根瘤的邊界和形狀［27］。棉花GhKNAT7可以與一些GhBEL1成員相互作用形成異二聚體，影響棉花中纖維SCW的生物合成網(wǎng)絡(luò)［28］。目前，關(guān)于TALE基因在植物功能上的研究大多集中于植物生長(zhǎng)和發(fā)育上，但是TALE基因在植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用。例如，大豆GmBHL4蛋白與GmSBH1蛋白可以形成異二聚體，進(jìn)而調(diào)節(jié)大豆對(duì)干旱、高溫和濕度脅迫的響應(yīng)［29］。小麥中TaKNOX11-A基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)，可以提高在干旱和鹽脅迫下擬南芥的萌發(fā)率和存活率［5］。

千穗谷（Amaranthus hypochondriacus）是莧科莧屬一年生，糧、飼、觀賞、生態(tài)修復(fù)兼用型草本植物，具有適口性好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、抗旱能力強(qiáng)等特點(diǎn)［30-32］。千穗谷最適生長(zhǎng)溫度為21℃～29℃，當(dāng)溫度低于10℃就會(huì)停止生長(zhǎng)，低于0℃會(huì)發(fā)生凍害死亡［33-34］。千穗谷最新基因組于2017年發(fā)布［35］，但關(guān)于千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子的鑒定暫未報(bào)道。本研究以千穗谷為實(shí)驗(yàn)材料，在全基因組范圍內(nèi)鑒定TALE基因家族成員，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、染色體定位、啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件、組織表達(dá)特征以及對(duì)干旱和低溫的響應(yīng)等方面進(jìn)行分析，為千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子的功能和調(diào)控機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

擬南芥和水稻的TALE轉(zhuǎn)錄因子分別來(lái)自于Tair數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org/）和植物因子轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫(kù)（PlantTFDB，http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/），千穗谷的全基因組序列從Phytozome V13（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）下載獲得。利用TBtools軟件提取千穗谷全基因組的CDS序列并轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，使用TBtools軟件的Blast Several Sequences to Big Database功能將擬南芥的TALE氨基酸序列在千穗谷的所有蛋白序列中進(jìn)行blast，將得到E值小于1E-5的蛋白序列。利用NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）的Batch-CD-search工具復(fù)篩含有完整BELL、KNOX結(jié)構(gòu)域的千穗谷TALE家族蛋白序列。

1.2TALE轉(zhuǎn)錄因子的染色體定位和蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

根據(jù)鑒定出的千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子家族成員信息和千穗谷基因組注釋文件，利用TBtools的gene location visualize from GTF/GFF功能進(jìn)行TALE基因家族的染色體定位。千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子的蛋白長(zhǎng)度、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)由ExPASy網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)；親水性由在線工具Protein GRAVY（http：//www.detaibio.com/sms2/protein_gravy.html）進(jìn)行預(yù)測(cè)；亞細(xì)胞定位由在線工具wolf psort（https：//wolfpsort.hgc.jp/）完成。

1.3千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子家族的進(jìn)化分析

將千穗谷的TALE氨基酸序列和擬南芥、水稻的TALE氨基酸序列在MATTF網(wǎng)站（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/server/）進(jìn)行多序列比對(duì)，獲得aln格式的比對(duì)結(jié)果。將比對(duì)結(jié)果以MAGE7構(gòu)建千穗谷、擬南芥和水稻的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，使用在線工具Evolview（http：//www.evolgenius.info/evolview/#/login）美化進(jìn)化樹(shù)。

1.4千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子家族序列結(jié)構(gòu)分析

使用TBtools軟件的Gene Structure View （advanced）功能對(duì)鑒定得到的TALE基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)和氨基酸序列進(jìn)行可視化。

1.5千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用網(wǎng)站SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）、SOMPA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對(duì)千穗谷11條TALE轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列分別進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析。

1.6千穗谷TALE基因家族同源性分析

結(jié)合千穗谷、擬南芥、水稻、藜麥（Chenopodium quinoa）和番茄的基因結(jié)構(gòu)注釋信息文件及基因組文件，使用TBtools中One step MCScanX功能得到千穗谷與4種植物的直系同源基因信息，分別以“At-N”、“Os-N”、“Sl-N”、“Cq-N”表示擬南芥、水稻、番茄和藜麥的染色體號(hào)，N為染色體編號(hào)，以RN表示千穗谷染色體號(hào)，N為染色體編號(hào)（去掉了不含TALE同源關(guān)系基因的染色體）。使用TBtool軟件的dual systeny plot功能繪制千穗谷與4種植物的直系同源基因圖。

1.7千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子家族啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

通過(guò)Plant CARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）的search for care工具對(duì)千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子上游2 000 bp的基因序列進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)，最后利用TBtools軟件的Simple BioSequence Viewer功能進(jìn)行可視化分析。

1.8千穗谷不同組織及在低溫、干旱脅迫條件下TALE基因表達(dá)量分析

從Phytozome V13數(shù)據(jù)庫(kù)獲取千穗谷TALE基因在不同發(fā)育時(shí)期不同組織器官的表達(dá)情況，表達(dá)量經(jīng)過(guò)log2（RPKM） 標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過(guò)TBtools的HeatMap功能繪制熱圖。

以千穗谷品種‘Plainsman’為材料，將種子播種在沙土和草炭土1∶1混合均勻的育苗盆中，在26℃、光照14 h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。選取30 d苗齡的植株進(jìn)行脅迫處理，干旱脅迫處理組用20%的PEG-6000 澆濕土壤進(jìn)行模擬干旱脅迫［36］，低溫脅迫處理組于4℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行，以正常生長(zhǎng)條件下的為對(duì)照，處理設(shè)三次生物學(xué)重復(fù)，在處理1，3，8和24 h時(shí)分別取樣用于表達(dá)分析。使用試劑盒提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)primer-blast工具設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）引物（引物序列見(jiàn)附表），熒光定量PCR使用諾唯贊的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒，通過(guò)ABI（Applied Biosystems）公司的ABI7500 PCR系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量反應(yīng)。熒光定量結(jié)果采用公式：Y=10ΔCt/3×100%（ΔCt=CtAtACP- CtAtTALE）［37］，相對(duì)表達(dá)量為YAtTALE/YCK，用Origin 2021作圖。

2結(jié)果與分析

2.1千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和理化性質(zhì)分析

通過(guò)同源序列比對(duì)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析最終在千穗谷中鑒定得到11個(gè)TALE基因，其中5個(gè)為KNOX亞族，6個(gè)為BELL亞族。為方便后續(xù)研究，將11個(gè)TALE基因重命名為AhTALE1-AhTALE11，AhTALEs基因，編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)詳見(jiàn)表1。AhTALE2編碼蛋白最長(zhǎng)，為658個(gè)氨基酸，分子量可達(dá)72 951.25Da，AhTALE3編碼的蛋白最短，為269個(gè)氨基酸，分子量最小為31 066.85 Da；除了AhTALE10蛋白等電點(diǎn)大于7屬于堿性蛋白質(zhì)外，其他的10個(gè)AhTALEs蛋白等電點(diǎn)均小于7，屬于酸性蛋白質(zhì)；所有蛋白的平均親水性均小于0，說(shuō)明都是親水性蛋白；蛋白亞細(xì)胞地位預(yù)測(cè)分析表明AhTALEs蛋白均定位于細(xì)胞核。

2.2千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究將千穗谷、擬南芥和水稻的TALE轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，并按照擬南芥TALE轉(zhuǎn)錄因子的分類(lèi)方式進(jìn)行分類(lèi)［38］，3個(gè)物種的TALE基因被分為KNOX亞家族和BELL亞家族（圖1）。KNOX亞家族成員可進(jìn)一步分為3類(lèi)：KNOX CLASSⅠ、KNOX CLASSⅡ和KNOX CLASSⅢ。其中KNOX CLASSⅠ有2個(gè)AhTALEs成員，KNOX CLASSⅡ有3個(gè)AhTALEs成員，而KNOX CLASSⅢ僅包含1個(gè)AtKNATM基因。

2.3千穗谷TALE基因染色體定位及物種間共線性分析

千穗谷共16對(duì)染色體，TALE家族成員不均勻的分布在其中的9條染色體（圖2）。其中，1號(hào)、2號(hào)、7號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)和12號(hào)染色體上各有1個(gè)AhTALE基因，在5號(hào)染色體和16號(hào)染色體上均有2個(gè)AhTALEs基因。AhTALE2和AhTALE5兩個(gè)基因位于Chr5的端粒區(qū)，二者距離僅約9 kb。

為進(jìn)一步研究千穗谷TALE基因與其他物種同源基因的進(jìn)化關(guān)系，試驗(yàn)采用3種雙子葉植物（擬南芥、番茄和藜麥）和1種單子葉植物（水稻）進(jìn)行了基因家族共線性分析，分別鑒定出3個(gè)（水稻）、12個(gè)（擬南芥）、8個(gè)（番茄）、18個(gè)（藜麥）AhTALEs同源基因，其中有兩個(gè)AhTALEs基因（AhTALE10和AhTALE11）在4個(gè)物種中都存在同源基因?qū)Γ▓D3）。

2.4千穗谷TALE基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

TALE家族的基因序列長(zhǎng)度和外顯子分布差異很大（圖4）。其中，AhTALE3序列最長(zhǎng)，長(zhǎng)度為20 139 bp；AhTALE5序列最短，長(zhǎng)度為2 145 bp。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果可以看出（圖4A、4B），不同亞家族的外顯子個(gè)數(shù)也存在很大的差異：BELL亞家族均有4個(gè)外顯子，而KNOX亞家族含有的外顯子數(shù)量在4～8個(gè)不等。

根據(jù)千穗谷TALE家族成員的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)（圖4C），11條TALE轉(zhuǎn)錄因子都包含一個(gè)典型的Homeobox-KN結(jié)構(gòu)域。其中，6個(gè)屬于BELL亞家族的TALE轉(zhuǎn)錄因子含有POX結(jié)構(gòu)域，5個(gè)屬于KNOX亞家族的TALE轉(zhuǎn)錄因子含有KNOX1結(jié)構(gòu)域（圖4D）；AhTALE3和AhTALE6含有ELK結(jié)構(gòu)域，AhTALE6/7/11含有KNOX2結(jié)構(gòu)域，AhTALE9含有KNOX2 superfamily結(jié)構(gòu)域。

對(duì)千穗谷TALE部分蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)（圖4），發(fā)現(xiàn)BELL亞家族中的Homeobox結(jié)構(gòu)域保守性比KNOX亞家族更強(qiáng)，BELL亞家族中POX結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列差異較大，KNOX1結(jié)構(gòu)域的保守性比KNOX2結(jié)構(gòu)域的保守性更好。與水稻KNOX亞家族類(lèi)似，千穗谷KNOX亞家族的Homeobox結(jié)構(gòu)域也含有保守氨基酸序列WW，PYP，WF，這些氨基酸可以與目標(biāo)DNA相互作用。

2.5千穗谷TALE家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用SOPMA在線網(wǎng)站對(duì)千穗谷TALE家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)千穗谷TALE蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，并且都含有多個(gè)β-折疊。每個(gè)TALE蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和β-折疊都是交互排列形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)（圖5）。利用SWISS-MODEL對(duì)千穗谷TALE家族蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，11個(gè)千穗谷TALE家族成員均匹配到匹配度高于30%的蛋白模型。通過(guò)構(gòu)建的模型可以觀察到，不同的千穗谷TALE家族蛋白結(jié)構(gòu)存在差異，但是都具有α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊等空間結(jié)構(gòu)，且均存在3個(gè)左右的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)（圖6）。

2.6千穗谷TALE家族成員啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)

利用PlantCARE在線分析軟件對(duì)千穗谷TALE基因上游2000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域序列的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，AhTALEs基因啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)逆境響應(yīng)和激素響應(yīng)相關(guān)元件，如光反應(yīng)元件、厭氧反應(yīng)元件、防御和應(yīng)激反應(yīng)元件、低溫反應(yīng)元件、以及茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件等（圖7）。AhTALE4/7/11基因啟動(dòng)子區(qū)含有低溫響應(yīng)元件，AhTALE1、AhTALE5、AhTALE7等含有響應(yīng)防御與應(yīng)激反應(yīng)元件。在激素響應(yīng)方面，有7個(gè)AhTALE家族成員（AhTALE2、AhTALE4等）存在赤霉素響應(yīng)元件，8個(gè)成員（AhTALE1、AhTALE2等）存在脫落酸響應(yīng)元件，9個(gè)成員（AhTALE3、AhTALE6等）含有水楊酸響應(yīng)元件，AhTALE2/4/11包含生長(zhǎng)素響應(yīng)元件，AhTALE1/4/6包含茉莉酸甲酯響應(yīng)元件。除此之外，AhTALE基因啟動(dòng)子上還存在著少量與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的元件，比如AhTALE2基因啟動(dòng)子區(qū)包含與分生組織有關(guān)的元件，AhTALE1基因啟動(dòng)子區(qū)包含與葉肉柵欄組織的分化有關(guān)的元件，AhTALE1/5/9啟動(dòng)子區(qū)包含與胚乳表達(dá)有關(guān)的響應(yīng)元件。

基于公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)千穗谷TALE基因家族成員在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，不同AhTALEs基因在千穗谷不同組織（根、莖、葉、花、未成熟的種子、干燥的混合組織）中表達(dá)模式存在較大差異（圖8），其中，AhTALE2/6/9在各組織中均高表達(dá)，AhTALE1/3/8在各組織中的表達(dá)量較低；AhTALE6在莖中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，AhTALE10在花中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，AhTALE4在根、莖以及花中表達(dá)均較高，這些結(jié)果表明千穗谷TALE基因家族在不同的組織部位發(fā)揮不同的調(diào)控功能。此外，屬于BELL亞族的AhTALE2/8/5/4/10/1聚為一類(lèi)，屬于KNOX亞族的AhTALE3/6/9/7/11聚為另一類(lèi)。

2.8千穗谷TALE家族成員在低溫和干旱處理下的表達(dá)模式分析

為了進(jìn)一步研究千穗谷TALE家族成員對(duì)逆境的響應(yīng)情況，對(duì)在千穗谷葉中表達(dá)量相對(duì)較高的7個(gè)AhTALEs基因（AhTALE1，AhTALE2，AhTALE5，AhTALE7，AhTALE8，AhTALE9，AhTALE11）在低溫和干旱處理下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，AhTALE基因均能響應(yīng)低溫和干旱脅迫，但不同的基因響應(yīng)程度不同（圖9）。在各個(gè)不同時(shí)間段的低溫脅迫下，AhTALE2的表達(dá)量均受到了誘導(dǎo)；而AhTALE1/7/8/11在低溫脅迫1，3和24 h時(shí)上調(diào)表達(dá)，8 h時(shí)表達(dá)被抑制；AhTALE9和AhTALE5的表達(dá)量先受到低溫處理的抑制，而在低溫處理24 h時(shí)其表達(dá)量受到了誘導(dǎo)（圖9A）。在干旱脅迫下，AhTALE1表達(dá)量在干旱1 h時(shí)受到誘導(dǎo)程度最顯著，而在后續(xù)干旱處理下其表達(dá)水平無(wú)明顯變化；AhTALE2和AhTALE5表達(dá)量都是在干旱處理1 h時(shí)受到了抑制，在干旱處理3 h時(shí)受到了誘導(dǎo)，AhTALE 7/8/9表達(dá)量在干旱脅迫1，3和24 h的均受到了誘導(dǎo)，AhTALE11表達(dá)量?jī)H在干旱處理3 h時(shí)受到誘導(dǎo)，其他時(shí)間的干旱處理下其表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化（圖9B）。

3討論

本研究在千穗谷中共鑒定到了11個(gè)TALE基因家族成員。從理化性質(zhì)來(lái)看，11個(gè)千穗谷TALE基因家族成員的基因長(zhǎng)度、氨基酸大小、分子量差異較大。BELL亞家族成員的氨基酸長(zhǎng)度和分子量均高于KNOX亞家族，這與大豆［6］、楊樹(shù)［8］、棉花［28］的結(jié)論一致；但其等電點(diǎn)、蛋白親水性和亞細(xì)胞定位在不同的成員之間較為保守，所有蛋白均為親水性蛋白且均定位于細(xì)胞核，除了AhTALE10屬于堿性氨基酸外，其余均為酸性氨基酸。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，千穗谷TALE家族成員可分為3類(lèi)（BELL Family、KNOX CLASSⅠ和KNOX CLASSⅡ），BELL Family包含6個(gè)TALE成員，KNOX CLASSⅠ和KNOX CLASSⅡ?qū)儆贙NOX亞家族，共5個(gè)成員。在番茄中，BELL和KNOX亞家族分別有14個(gè)和10個(gè)TALE成員［7］，在辣椒中BELL和KNOX亞家族分別有13個(gè)和7個(gè)TALE成員［39］，與本研究的千穗谷相似，BELL亞族的成員數(shù)量多于KNOX亞族。基因結(jié)構(gòu)分析表明，同一分支的千穗谷TALE成員具有相似的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)。前人研究表明，內(nèi)含子的存在對(duì)于基因家族的進(jìn)化至關(guān)重要［40］。AhTALEs基因均包含內(nèi)含子，數(shù)量在4～7個(gè)不等。BELL亞家族含有3～4個(gè)內(nèi)含子，KNOX亞家族含有3～7個(gè)內(nèi)含子，KNOX亞家族內(nèi)含子的數(shù)量略多于BELL亞家族。

對(duì)千穗谷與雙子葉植物（擬南芥、番茄和藜麥）和單子葉植物（水稻）的TALE基因進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，雙子葉植物中AhTALEs同源基因?qū)h(yuǎn)高于單子葉植物，雙子葉與雙子葉植物間的協(xié)同性更高；且與藜麥的TALE同源基因?qū)ψ疃?，說(shuō)明千穗谷與藜麥協(xié)同性最好。AhTALE10和AhTALE11在雙子葉和單子葉植物中都存在共線基因?qū)?，表明這些同源對(duì)是保守的，可能在祖先分化之前就存在了［6，41］。尋求千穗谷與不同物種間的共線基因有助于研究AhTALE家族的進(jìn)化。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，AhTALEs蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，除此之外還有少量的β-折疊和延伸鏈；三級(jí)結(jié)構(gòu)中都含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，剛好對(duì)應(yīng)了同源異型盒基因的螺旋-角-螺旋結(jié)構(gòu)；兩者共同構(gòu)成了千穗谷TALE家族功能的多樣性。

順式元件存在于基因啟動(dòng)子區(qū)，與轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，直接在植物基因表達(dá)調(diào)控中起作用。順式作用元件分析結(jié)果表明，TALE基因啟動(dòng)子序列包含多個(gè)與激素反應(yīng)和非生物脅迫相關(guān)的順式元件，如脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、生長(zhǎng)素、光、低溫誘導(dǎo)等響應(yīng)元件，表明千穗谷TALE基因與激素響應(yīng)和逆境脅迫調(diào)控有關(guān)。這些結(jié)果與棉花［28］、石榴［42］等研究結(jié)果類(lèi)似，表明TALE基因啟動(dòng)子上的結(jié)合元件具有一定的保守性。

非生物脅迫，如鹽堿、干旱、低溫，會(huì)降低生產(chǎn)力，對(duì)作物產(chǎn)量造成巨大的損失甚至死亡［43-44］。在楊樹(shù)和菠蘿中，相關(guān)的TALE基因曾被報(bào)道與不同的非生物脅迫的響應(yīng)相關(guān)［45-46］。由于AhTALEs基因在各組織中的表達(dá)量在不同的基因間存在較大的差異，研究了7個(gè)在葉中表達(dá)量較高的AhTALEs基因?qū)Ω珊岛偷蜏孛{迫的響應(yīng)，在不同脅迫處理下，這7個(gè)基因?qū)Ω珊岛偷蜏孛{迫響應(yīng)模式不同。有的基因?qū)Ψ巧锩{迫響應(yīng)非常顯著，而有的基因響應(yīng)相對(duì)較弱。AhTALE1在干旱處理1 h時(shí)其表達(dá)量就升高到CK的3.5倍，而其他幾個(gè)AhTALEs基因表達(dá)量最高僅為CK的1.6倍。值得注意的是，除了AhTALE2，在干旱和低溫脅迫下其他6個(gè)基因表達(dá)量在3～8 h之間均呈下調(diào)趨勢(shì)，原因可能是AhTALEs基因啟動(dòng)子上存在大量光響應(yīng)元件。

4結(jié)論

本研究共鑒定出11個(gè)千穗谷TALE轉(zhuǎn)錄因子，其可分為BELL和KNOX兩個(gè)亞家族，它們分別分布在9條染色體上。對(duì)千穗谷和其他幾個(gè)物種間的TALE蛋白的共線性分析為AhTALEs基因的進(jìn)化提供了證據(jù)。同一亞族的AhTALEs成員的基因結(jié)構(gòu)、保守基序和結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出一定的相似性。順式作用元件預(yù)測(cè)、組織特異性表達(dá)和非生物脅迫下的表達(dá)模式顯示AhTALEs成員在千穗谷生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫過(guò)程中起著重要作用。

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（責(zé)任編輯彭露茜）