柱花草葉肉原生質(zhì)體提取與瞬時表達體系構建

摘要：柱花草（Stylosanthes guianensis）是一種重要的熱區(qū)豆科牧草，為利用原生質(zhì)體瞬時表達體系開展柱花草基因功能研究，以20 d齡期‘熱研5號’柱花草子葉為試驗材料，通過正交試驗考察不同因素對原生質(zhì)體分離及轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明：采用1.5%纖維素酶、1.25%離析酶、0.5 mol·L-1甘露醇和4 mmol·L-1MES酶解液組合，酶解時間為16 h時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性均達到最佳，分別為（4.567×106）個·g-1和92.271%；原生質(zhì)體濃度為（6×105）個·mL-1、質(zhì)粒濃度為0.6 μg·μL-1，PEG-4000濃度為50%、轉(zhuǎn)化時間為5 min時，轉(zhuǎn)化效率最高，可達52.524%。構建了目標蛋白SgRKL1表達載體pA7-BIUTNT：：SgRKL1-GFP，利用PEG介導法將其轉(zhuǎn)入柱花草原生質(zhì)體，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示SgRKL1蛋白定位于細胞膜上，說明所建立的柱花草葉肉原生質(zhì)體瞬時表達體系可應用于目標基因的瞬時表達和亞細胞定位研究。

關鍵詞：柱花草；葉肉原生質(zhì)體；酶解；PEG介導；瞬時表達

中圖分類號：Q943.2文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）03-0893-10

Establishment of Isolation and Transient Expression System of Mesophyll

Protoplast of Stylosanthes guianensis

GAO Jing， YANG Li-yun， ZHANG Shi-zi， JIANG Ling-yan*

（College of Tropical Crops， Hainan University/Hainan Key Laboratory of Sustainable Utilization of Tropical Biological Resources，

Haikou， Hainan Province 570228， China）

Abstract：Stylosanthes guianensis is an important leguminous forage in tropical area. In order to carry out gene function studies using the transient expression system of protoplasts，the cotyledons of 20-day-old seedlings of S. guianensis were used as the experimental material，and the influences of different factors on protoplast separation and the efficiency of transformation into plasmid were investigated by orthogonal experiments. The results showed that the optimal emzymolysis condition was 1.5% Cellulase R-10，1.25% Macerozyme R-10，0.5 mol·L-1 mannitol，4 mmol·L-1MES，and 16 h digestion time，which obtained the yield of （4.567×106） per·g-1protoplasts with 92.271% activity. The optimal transformation condition was （6×105） per·mL-1 protoplast，0.6 μg·μL-1 plasmid，50% PEG-4000 and 5 min transformation time，which gave up to 52.524% transformation efficiency. The expression vector of pA7-BIUTNT：：SgRKL1-GFP was constructed and transferred into mesophyll protoplasts by PEG-mediated method. The detection of confocal microscopy showed that SgRKL1 protein was localized on the plasma membrane，indicating that the transient expression system of S. guianensis mesophyll protoplasts could be applied to the transient expression of target genes and the studies on the subcellular localization of S. guianensis.

Key words：Stylosanthes guianensis;Protoplast;Enzymolysis;PEG method;Transient expression

植物原生質(zhì)體指脫去細胞壁的細胞，易被外源性大分子轉(zhuǎn)染，可作為植物生理、生物化學、分子生物學等領域研究的重要原材料［1］。例如，在基因瞬時表達研究中，利用原生質(zhì)體可避免現(xiàn)行異源表達造成的結(jié)果差異［2］；在擬南芥（Arabidopsis thaliana）原生質(zhì)體瞬時表達體系基礎上，可篩選鑒定植物免疫激發(fā)子［3］；利用水稻（Oryza sativa L.）原生質(zhì)體體系，可研究矮縮病毒在侵染水稻原生質(zhì)體后的表達［4］。

在牧草原生質(zhì)體的制備及應用方面，國內(nèi)外開展了廣泛研究。近年來，建立了黑麥草（Lolium perenne L.）和短柄草（Brachypodium distachyon）原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化體系［5-6］，并結(jié)合CRISPR/Cas9技術，測試了gRNA效率［6］；通過PEG介導將嵌合基因?qū)敫哐蛎‵estuca arundinacea）、紅羊茅（Festuca rubra L.）等牧草原生質(zhì)體，經(jīng)篩選獲得抗性愈傷組織，并從中再生出轉(zhuǎn)基因植株［7］；在紫花苜蓿（Medicago sativa L.）中，通過酶解法游離出表皮條中的保衛(wèi)細胞原生質(zhì)體［8］；在羊草（Zornia glochidiata）中，以葉片為材料分離原生質(zhì)體，利用其原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系確定了基因LcZNE1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［9］；在黑麥草中，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術構建載體，將其轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中瞬時表達，驗證了突變位點［10］。

柱花草（Stylosanthes guianensis）是重要的熱帶豆科牧草，我國自上世紀60年代引種以來，已在南方熱區(qū)大面積推廣種植，形成了“北有苜蓿，南有柱花草”的草業(yè)發(fā)展格局。目前，柱花草原生質(zhì)體方面的研究很少，尚未見到柱花草原生質(zhì)體瞬時表達體系方面的公開報道。早期，Szabados等通過酶解法采用高濃度纖維素酶分離獲得了柱花草原生質(zhì)體，但未對原生質(zhì)體提取的數(shù)量及活性進行檢測，且使用的纖維素酶濃度較高，易使原生質(zhì)體發(fā)生自發(fā)融合［11］。本文以柱花草‘熱研5號’無菌苗子葉為外植體，通過研究不同酶解條件對柱花草原生質(zhì)體制備的影響，確定了分離純化的最佳條件；以原生質(zhì)體作為受體，運用聚乙二醇介導法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，比較不同轉(zhuǎn)化條件和表達載體對轉(zhuǎn)化效率的影響，建立了基于Pro-BIUTNT啟動子的柱花草原生質(zhì)體瞬時表達體系，為柱花草原生質(zhì)體應用研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

植物材料：齡期為20 d的‘熱研5號’柱花草（Stylosanthes guianensis ‘Reyan No.5’）無菌苗子葉。

試劑：Cellulase R-10（Yakult，Japan），MacerozymeR-10（Yakult，Japan），甘露醇（Solarbio，China），MES（Sigma，America），PEG4000（Solarbio，China），F(xiàn)DA（Solarbio，China），質(zhì)粒提取試劑盒（Vazyme，China）。

載體材料：pA7-35S質(zhì)粒［12］，由本實驗室保存，攜帶GFP標簽，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后表達綠色熒光蛋白。

1.2試驗方法

1.2.1無菌苗的培育柱花草種子磨去種皮后于超凈工作臺進行滅菌處理：75%酒精消毒3 min，無菌水清洗3遍后充分浸泡于10%次氯酸鈉溶液中，處理12 min后再用無菌水沖洗5遍。將滅菌好的柱花草種子平鋪于MS培養(yǎng)基（3%蔗糖，0.3%植物凝膠），在黑暗環(huán)境下培養(yǎng)3 d，萌芽后置于組培室中培養(yǎng)（光照強度2 000 lx，光照時間12 h·d-1，溫度26℃）。

1.2.2原生質(zhì)體的分離及正交試驗將裝有纖維素酶、離析酶、MES、甘露醇混合液的離心管（溶液總體積5 mL）于55℃水浴鍋中水浴10 min后置于冰上冷卻至室溫，加入10 mmol·L-1CaCl2和0.1% BSA；用刀片將生長20 d的柱花草無菌苗子葉切下，稱取0.3 g，用鑷子夾至0.6 mol·L-1甘露醇中浸泡30 min進行預處理，使細胞發(fā)生質(zhì)壁分離；再用平頭鑷子將其平鋪于平板上，用刀片劃成0.1～0.5 mm長度的細絲，浸沒于提前配置好的已過濾除菌的酶解液中；用錫箔紙將裝有酶解液的培養(yǎng)皿包裹住，抽真空30 min，置于26℃培養(yǎng)箱中45 r·min-1搖晃14～17 h。

原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性是檢驗原生質(zhì)體制備結(jié)果好壞的重要依據(jù)，原生質(zhì)體分離純化效果主要受纖維素酶、離析酶、甘露醇、MES濃度和酶解時間等因素的影響［13］。本試驗經(jīng)初步摸索設計了5因素4水平正交試驗，如表1所示。根據(jù)正交試驗結(jié)果，選擇柱花草原生質(zhì)體分離的最優(yōu)條件進行后續(xù)相關試驗。

1.2.3原生質(zhì)體的計數(shù)及活力檢測柱花草子葉過夜酶解后，在培養(yǎng)皿中加入與酶解液等體積的W5（154 mmol·L-1 NaCl；125 mmol·L-1 CaCl2；5 mmol·L-1 KCl；2 mmol·L-1 MES，pH5.7）來終止酶解。輕搖培養(yǎng)皿，用W5試劑潤洗過的100目不銹鋼細胞過濾篩過濾酶解液中的殘渣至50 mL離心管中，100 g離心3 min；用1 mL移液槍小心吸去上清，再加入2 mL W5，輕搖離心管，使沉底的柱花草葉肉原生質(zhì)體均勻懸浮在W5試劑中；吸取10 μL從蓋有載玻片的血球計數(shù)板的一側(cè)邊緣輕輕打入，于光學顯微鏡下計數(shù)，重復計數(shù)4次。

柱花草原生質(zhì)體產(chǎn)量（個·g-1） =

25個大方格中柱花草原生質(zhì)體數(shù)×懸浮液總體積×10 000葉片總質(zhì)量

從純化后的原生質(zhì)體懸浮液中吸取95 μL至1.5 mL離心管中，加入5 μL 0.2% FDA染液，避光孵育3 min；在熒光生物學顯微鏡下統(tǒng)計視野中原生質(zhì)體總數(shù)及發(fā)熒光數(shù)，計算原生質(zhì)體活力，每個試驗設置5個重復。

柱花草葉肉原生質(zhì)體活力=

發(fā)熒光數(shù)視野中原生質(zhì)體總數(shù)×100%

1.2.4載體構建及大提質(zhì)粒目標蛋白SgRKL1表達載體構建：以擬南芥DNA為模板，通過PCR擴增獲得擬南芥泛素基因啟動子Pro-BIUTNT［14］；采用內(nèi)切酶Hind III-HF（NEB）與XhoI（NEB）酶切pA7-35S質(zhì)粒，以及一步克隆試劑盒ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（Vazyme），用Pro-BIUTNT替換pA7-35S中的啟動子CaMV 35S，構建pA7-BIUTNT重組質(zhì)粒。以柱花草cDNA為模板，通過PCR擴增（F：ATGGTGGCCATTAGCATTGTG，R：TAACTCTACAAGATCATGTTGTTGGG） 獲得目的基因SgRKL1片段；通過XhoI（NEB）與SpeI（NEB）酶切位點將目的基因SgRKL1克隆進pA7-BIUTNT，構建表達載體pA7-BIUTNT：：SgRKL1-GFP。

質(zhì)粒提取：在相關抗性瓊脂平板上劃線活化含有表達載體的菌株；挑取單克隆菌落放入兩個裝有100 mL LB（加入相應抗生素）的錐形瓶中搖晃，過夜；把菌液分裝至20個2 mL EP管，分批離心10 000 r·min-1 1 min，依據(jù)諾唯贊小提質(zhì)粒試劑盒說明書進行質(zhì)粒提??；最終分別加入40 μL ddH2O至10個吸附柱中洗脫DNA。

質(zhì)粒濃縮：加入1/10體積NaOAc（3 mol·L-1 NaOAc，pH4.8），3倍體積95%乙醇與質(zhì)粒溶液混合，于-20℃過夜；第二天，最大轉(zhuǎn)速離心2 min，倒掉上清，75%乙醇洗一次，用10 μL槍頭吸離心管里剩余的水；室溫晾干10～15 min，直至DNA剛晾干，加入適當體積的水溶解。

1.2.5原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化及正交試驗將分離純化后的柱花草原生質(zhì)體懸浮于7～8 mL的W5試劑中，置于冰上冷卻30 min左右，盡量吸盡上清，加入適量MMG溶液（0.4 mol·L-1甘露醇；15 mmol·L-1 MgCl2；4 mmol·L-1 MES，pH5.7），調(diào)整原生質(zhì)體最終濃度。于2 mL EP管中先加入2～10 μg的質(zhì)粒，然后加入100 μL MMG懸浮的柱花草原生質(zhì)體，再加入110 μL PEG溶液（0.2 mol·L-1甘露醇；100 mmol·L-1 CaCl2；30%～50%PEG-4000），輕彈管壁混勻。室溫靜置一段時間后加入500 μL W5終止反應，上下輕柔顛倒4次，100 g離心3 min。用移液槍小心吸盡上清，再用1 mL W5溶液重懸柱花草原生質(zhì)體。用1 mL移液槍轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)皿中（經(jīng)1% BSA孵育30 min以上），用錫箔紙包裹，在24℃培養(yǎng)箱中過夜孵育。孵育結(jié)束后，100 g離心3 min，除去上清，加入100 μL W5后重懸柱花草原生質(zhì)體，吸取20 μL原生質(zhì)體置于圓底載玻片中，在熒光生物學顯微鏡及共聚焦顯微鏡下觀察并統(tǒng)計。

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率主要受原生質(zhì)體濃度、質(zhì)粒濃度、轉(zhuǎn)化時間及PEG-4000濃度等因素的影響［15］。本試驗設計了4因素3水平正交試驗，如表2所示。根據(jù)正交試驗結(jié)果，選擇柱花草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件進行后續(xù)相關試驗。

1.2.6數(shù)據(jù)處理使用Oligo 7進行引物設計；使用SPSS 27.0進行正交試驗設計；使用Office 2022軟件作圖作表并且進行正交試驗結(jié)果方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1酶解條件對柱花草原生質(zhì)體產(chǎn)量及活性的影響

按表1正交試驗設計，研究了不同酶解條件下所分離原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活性，試驗結(jié)果如表3所示，方差分析如表4所示，分離過程如圖1所示。

表3結(jié)果表明：序號8的原生質(zhì)體產(chǎn)量（4.567×106個·g-1）最多，活性（92.271%）最高；各因素對柱花草原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性的影響程度不同。對于原生質(zhì)體產(chǎn)量，離析酶濃度極差Rk值（1.471）最高，酶解時間Rk值（1.417）與其相近，即兩者均為主要影響因素；MES濃度（Rk=1.171）與纖維素酶濃度（Rk=1.088）也有較大影響，而甘露醇濃度（Rk=0.800）的影響最小。對于原生質(zhì)體活性，纖維素酶濃度極差Rl值（30.160）最高，即影響最大；甘露醇濃度（Rl=17.162）、MES濃度（Rl=11.159）與離析酶濃度（Rl=10.500）的影響次之，而酶解時間（Rl=4.916）的影響較小。

表4方差分析結(jié)果表明：各因素對柱花草原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響均達到極顯著水平；對于柱花草原生質(zhì)體活性，纖維素酶、甘露醇、MES濃度的影響都達到極顯著水平，離析酶濃度達到顯著水平，而酶解時間的影響不顯著。

由表3序號8，結(jié)合表3中各因素不同水平的活細胞數(shù)及原生質(zhì)體產(chǎn)量平均數(shù)（k）與原生質(zhì)體活性平均數(shù)（l）值的乘積可知：纖維素酶濃度最佳水平為1.5%（水平2），離析酶為1.25%（水平4），甘露醇為0.5 mol·L-1（水平3），MES為4 mmol·L-1（水平1），酶解時間為16 h（水平3），各因素最佳水平組合產(chǎn)量可達（4.567×106）個·g-1，活性為92.271%。圖2給出了最佳條件下分離獲得的原生質(zhì)體及FDA活力檢測結(jié)果。

2.2不同處理組合對柱花草原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響

按表2正交試驗設計，利用PEG介導法，分別將pA7-35S質(zhì)粒及pA7-BIUTNT質(zhì)粒轉(zhuǎn)入柱花草原生質(zhì)體中，研究了不同轉(zhuǎn)化條件下的轉(zhuǎn)化效率，正交試驗結(jié)果如表5和表6所示，方差分析如表7所示。

表5及表6結(jié)果表明：表5序號5的pA7-BIUTNT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率最高，為52.524%；表6序號3的pA7-35S質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率最高，為19.000%，圖3分別給出了其轉(zhuǎn)化柱花草原生質(zhì)體效果；各因素對柱花草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響程度不同。pA7-BIUTNT質(zhì)粒和pA7-35S質(zhì)粒均是PEG-4000濃度極差值最高（R1=22.642，R2=9.554），原生質(zhì)體濃度R值（R1=19.742，R2=8.705）與其相近，即兩者是主要影響因素；質(zhì)粒濃度（R1=17.006，R2=3.256）也有較大影響，而轉(zhuǎn)化時間（R1=13.122，R2=2.254）的影響較小。

表7方差分析結(jié)果表明：對于質(zhì)粒pA7-35S，原生質(zhì)體及PEG-4000濃度對柱花草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響達到顯著水平，而質(zhì)粒濃度與轉(zhuǎn)化時間的影響不顯著；對于質(zhì)粒pA7-BIUTNT，各因素的影響都達到極顯著水平。

綜上，采用pA7-BIUTNT質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率可達52.524%，明顯高于采用pA7-35S質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率（19.000%），各因素（水平）的最佳組合（表5序號5）為：原生質(zhì)體濃度（6×105）個·mL-1（水平2），質(zhì)粒濃度0.6 μg·μL-1（水平2），轉(zhuǎn)化時間5 min（水平1），PEG-4000濃度50%（水平3）。

2.3基因瞬時表達體系的驗證

SgRKL1（Receptor-like kinase 1）是經(jīng)柱花草質(zhì)膜蛋白組學所鑒定的蛋白，經(jīng)Cell-PLoc 2.0網(wǎng)站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/.）預測，其亞細胞定位于質(zhì)膜。為驗證本文所建立的柱花草原生質(zhì)體瞬時表達體系可用于基因瞬時表達和亞細胞定位研究，采用表5柱花草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化正交試驗中的組合5，將pA7-BIUTNT：：SgRKL1-GFP融合載體轉(zhuǎn)化至柱花草原生質(zhì)體中，W5培養(yǎng)16 h后，在共聚焦顯微鏡下觀察其亞細胞定位結(jié)果，如圖4所示。亞細胞定位結(jié)果說明：SgRKL1蛋白定位于細胞膜上，本文所建立的柱花草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系可應用于目標基因瞬時表達和亞細胞定位研究。

3討論

3.1柱花草葉肉原生質(zhì)體的制備

對試驗材料進行預處理可提高原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力［16］，常見的預處理方法有低溫預處理、黑暗預處理［17］和甘露醇預處理［18］等。酶液成分及酶解時間也是影響原生質(zhì)體分離的重要因素。不同植物的細胞壁組分有所差異，因此針對不同植物需要調(diào)整酶的種類及濃度［19］。在分離油棕（Elaeis guineensis）葉肉細胞原生質(zhì)體時，采用30 g·L-1纖維素酶、8 g·L-1離析酶混合酶解3.5 h分離效果最好［20］；而分離紫薇（Lagerstroemia indica L.）葉肉原生質(zhì)體的最佳酶解混合液為10 g·L-1纖維素酶、5 g·L-1離析酶、4 g·L-1果膠酶和0.6 mol·L-1甘露醇混合液［21］。酶解時間過長，易對原生質(zhì)體產(chǎn)生傷害，影響其活力；而酶解時間過短，可能導致酶解不充分，從而降低原生質(zhì)體產(chǎn)量［22］。本文研究表明：對于柱花草子葉原生質(zhì)體產(chǎn)量，纖維素酶、離析酶濃度及酶解時間的影響都達到極顯著水平；對于原生質(zhì)體活性，纖維素酶的影響達到極顯著水平，離析酶濃度達到顯著水平，而酶解時間的影響不顯著。

3.2柱花草葉肉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系將外源基因?qū)朐|(zhì)體的主要方法有PEG介導轉(zhuǎn)化法、電擊法和顯微注射法［23］。PEG介導的原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化效率受多種因素影響，包括轉(zhuǎn)化時間、質(zhì)粒種類及濃度、PEG-4000濃度、原生質(zhì)體濃度等。關于轉(zhuǎn)化時間，PEG誘導高粱（Sorghum bicolor L. Moench）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的時間為10 min時轉(zhuǎn)化效率最高，與5 min及15 min相比有顯著性差異［24］。關于質(zhì)粒濃度，在水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化中，質(zhì)粒濃度為1.5～2 μg·μL-1時效率較高，而低于1 μg·μL-1時轉(zhuǎn)化效率顯著降低［25］。關于PEG-4000及原生質(zhì)體濃度，黑麥草原生質(zhì)體最佳轉(zhuǎn)化條件研究表明，PEG-4000濃度對轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體效率的影響最大，而原生質(zhì)體濃度的影響不大［9］。本文研究表明：對于柱花草子葉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率，PEG-4000濃度及原生質(zhì)體濃度影響最大，其次是質(zhì)粒濃度，最后是轉(zhuǎn)化時間。

質(zhì)粒類型和啟動子對原生質(zhì)體瞬時表達體系的轉(zhuǎn)化效率也有顯著影響［26］。在蘋果（Malus domestica）原生質(zhì)體瞬時表達系統(tǒng)中，用CaMV 35S啟動子驅(qū)動未檢測到MdERF1的表達，用Western Blot檢測到弱MdERF2信號，而采用擬南芥基因啟動子Pro-BIUTNT時，檢測到一個清晰且具特異性的MdERF1信號和一個強的MdERF2信號［14］。本文研究表明：對于柱花草原生質(zhì)體瞬時表達體系，在最佳轉(zhuǎn)化條件下，采用pA7-BIUTNT質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率明顯高于pA7-35S質(zhì)粒。

4結(jié)論

植物原生質(zhì)體體系廣泛應用于基因功能研究［27］。本研究以生長20 d的‘熱研5號’柱花草為實驗材料，通過正交實驗建立了柱花草原生質(zhì)體分離及瞬時表達體系，結(jié)果表明：最佳分離條件為：1.5%纖維素酶、1.25%離析酶、0.5 mol·L-1甘露醇和4 mmol·L-1 MES酶解液組合，酶解時間16 h；采用質(zhì)粒pA7-BIUTNT的最佳轉(zhuǎn)化條件為：原生質(zhì)體濃度（6×105）個·mL-1、質(zhì)粒濃度0.6 μg·μL-1，PEG-4000濃度50%、轉(zhuǎn)化時間5 min。通過PEG介導法驗證了SgRKL1蛋白定位于細胞膜上，表明原生質(zhì)體可用于柱花草目標基因表達及亞細胞定位研究。

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（責任編輯劉婷婷）