密植條件下雜交油菜種子田間純度與真實(shí)值的差異研究?

摘 要：為分析密植條件下雜交油菜種子田間純度與真實(shí)值存在差異的原因，在40.5萬株/hm2種植密度下研究5個(gè)品種、6個(gè)純度樣品的田間純度變化規(guī)律，并結(jié)合表型調(diào)查和SSR基因分型技術(shù)探究其原因。結(jié)果表明：品種、真實(shí)純度及兩者的交互作用均對(duì)田間純度與真實(shí)純度的偏差有顯著影響。參試材料中田間純度與真實(shí)純度差異最大的是豐油730、最小的是灃油737；其4葉期后群體的死亡率達(dá)14.33%～21.33%，其中雜交種的成活率均顯著高于母本；70%純度下，豐油730的雜交種與母本的相對(duì)成活率顯著高于灃油737。試驗(yàn)結(jié)果表明，4葉期后的自疏現(xiàn)象和雜交種的空間競爭優(yōu)勢會(huì)影響田間純度表現(xiàn)，品種間雜交種與母本的相對(duì)競爭能力差異是影響田間純度的主要原因。

關(guān)鍵詞：雜交油菜；密植；種子；田間純度

中圖分類號(hào)：S565.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2023）05-0024-05

Abstract：In order to explain the difference between the field purity and the true purity of hybrid rape seed under close planting conditions， 5 varieties with 6 purity samples each were selected to study the change regularity of their field purity under the planting density of 405 000 plants/hm2 and explore the reasons by phenotype investigation and SSR genotyping. The results showed that： variety， true purity and their interaction all had significant effects on the difference between field purity and true purity. Fengyou 730 had the biggest difference between field purity and true purity， while Fengyou 737 had the smallest difference， their mortality reached 14.33%-21.33% after 4-leaf stage， and the survival rates of their hybrids were significantly higher than those of their female parents. Under 70% purity， the relative survival rates of hybrid and female parent of Fengyou 730 were significantly higher than those of Fengyou 737. To sum up， the self-thinning phenomenon after 4-leaf stage and the spatial competitive advantage of hybrid could affect the field purity performance， however， the main factor affecting field purity was the difference of relative competitive ability between hybrid and female parent.

Key words：hybrid rape; close planting; seed; field purity

品種純度是指品種在特征特性方面典型一致的程度，是農(nóng)作物種子最重要的質(zhì)量指標(biāo)之一[1]。種子純度低不僅會(huì)影響田間的一致性，還會(huì)嚴(yán)重影響品種產(chǎn)量和品質(zhì)優(yōu)勢的發(fā)揮[2-3]。因此，種子應(yīng)用于生產(chǎn)之前必須進(jìn)行嚴(yán)格的種子純度鑒定。種子純度鑒定的方法有很多種[4-10]，其中應(yīng)用最廣泛的主要是田間種植鑒定和SSR分子標(biāo)記。田間種植鑒定一般要求保證適宜的株距[11-12]，SSR分子標(biāo)記要求在適宜條件下培養(yǎng)幼苗，以盡量反映種子的真實(shí)純度。

油菜Pol CMS雜交制種系統(tǒng)存在不育系溫度敏感問題，會(huì)產(chǎn)生母本假雜種，容易造成純度問題。目前，在生產(chǎn)上為適應(yīng)農(nóng)業(yè)輕簡化種植方式的推進(jìn)，油菜種植密度由15.0萬～18.0萬株/hm2提升到37.5萬～45.0萬株/hm2，較高的種植密度容易造成植物對(duì)光、熱等資源的競爭，產(chǎn)生自疏現(xiàn)象，從而導(dǎo)致大田生產(chǎn)中品種的實(shí)際純度與鑒定值存在差異，這在一定程度上增加了種子銷售的風(fēng)險(xiǎn)。鑒于此，筆者在40.5萬株/hm2種植密度下探究不同品種、不同純度樣品的田間純度變化規(guī)律，并在4葉期單株掛牌，結(jié)合表型調(diào)查和SSR基因分型技術(shù)探究密植條件下雜交油菜種子田間純度與真實(shí)值存在差異的原因，以期為甘藍(lán)型油菜雜交種田間純度鑒定研究和應(yīng)用提供新的理論參考和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為pol-CMS系品種灃油737、灃油958、灃油792、豐油730、凱育09。為保證試驗(yàn)材料的可靠性，于2019年對(duì)各父母本進(jìn)行人工授粉得到雜交種，經(jīng)SSR標(biāo)記鑒定純度為100%。選取飽滿度一致性好的雜交種通過加入定量的母本種子，配置純度分別為95%、90%、85%、80%、75%、70%的種子參加試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間純度調(diào)查 試驗(yàn)于湖南省作物研究所試驗(yàn)場進(jìn)行，水旱輪作。各處理取750粒種子播種于小區(qū)，每小區(qū)6行，行長2.0 m，行距0.3 m，均勻播種，3葉一心期定苗，每行27株，在盛花期根據(jù)植株的育性表現(xiàn)調(diào)查純度，根據(jù)公式（1）（2）計(jì)算田間純度和純度偏差。

田間純度=（供檢株數(shù)－母本數(shù)）/供檢株數(shù)× 100%" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（1）

純度偏差=田間純度－真實(shí)純度" " " " " " " " " " （2）

1.2.2 成活率調(diào)查 待供試油菜生長至4～5葉期時(shí)，對(duì)每個(gè)品種真實(shí)純度為90%和70%的鑒定小區(qū)一端順序數(shù)100個(gè)單株進(jìn)行吊牌編號(hào)，并取中間幼嫩葉片2 cm2 左右于2.0 mL離心管中，－20℃保存用于SSR 標(biāo)記檢測。盛花期田間調(diào)查成活單株育性，采用SSR標(biāo)記鑒定死亡單株育性。根據(jù)公式 （3）～（5）計(jì)算群體成活率、母本成活率和雜交種成活率。

群體成活率=成活株數(shù)/100×100%" " " " " " " " （3）

母本成活率=母本成活株數(shù)/（母本成活株數(shù)+母本死亡株數(shù)）×100%" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（4）

雜交種成活率=雜交種成活株數(shù)/（雜交種成活株數(shù)+雜交種死亡株數(shù)）×100%" " " " " " " " " " " " "（5）

1.2.3 SSR標(biāo)記鑒定 DNA提取參照王同華等[13]報(bào)道的簡便方法進(jìn)行，灃油737、豐油730、凱育09進(jìn)行育性鑒定的引物分別均為RFP19，灃油958進(jìn)行育性鑒定的引物為CB10330，灃油792進(jìn)行育性鑒定的引物為CB10373。各引物的有效性均已通過親本和F2代驗(yàn)證。引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。SSR-PCR反應(yīng)體系參照陸光遠(yuǎn)等[14]報(bào)道的方法進(jìn)行，PCR產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳分離，并用紫外成像系統(tǒng)（BIO-RAD Gel DocTM EZ Imager）進(jìn)行觀察讀帶。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、計(jì)算和作圖。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種不同真實(shí)純度下田間純度與真實(shí)純度的偏差分析

分析5個(gè)供試油菜品種在不同真實(shí)純度下的田間純度表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，各品種田間純度與真實(shí)純度存在一定偏差，總體表現(xiàn)為田間純度高于真實(shí)純度。如表1所示，在真實(shí)純度分別為70%、75%、80%、85%、90%和95%時(shí)，各品種田間純度與真實(shí)純度的平均偏差分別為6.80%、6.13%、4.85%、3.65%、2.56%和0.89%?？梢钥闯?，隨著真實(shí)純度的升高，田間純度與真實(shí)純度的偏差整體呈現(xiàn)下降趨勢。不同基因型品種間田間純度與真實(shí)純度的偏差也表現(xiàn)出一定差異，灃油958、灃油792、灃油737、凱育09和豐油730田間純度與真實(shí)純度的平均偏差分別為3.06 %、3.53 %、2.80 %、3.87 %和7.46 %，其中灃油737的最低，豐油730的最高。

2.2 品種及真實(shí)純度對(duì)田間純度與真實(shí)純度偏差影響的多因素方差分析

從交互作用方差分析結(jié)果（見表2）可以看出，品種、真實(shí)純度以及二者交互影響檢驗(yàn)的F統(tǒng)計(jì)量相伴概率均為0.000，即在1%的顯著水平上，品種、真實(shí)純度及兩者的交互作用均對(duì)田間純度與真實(shí)純度的偏差有顯著影響。

從圖1中可知，當(dāng)真實(shí)純度為90%～95%時(shí)，品種間田間純度與真實(shí)純度的偏差差異不大；當(dāng)真實(shí)純度低于85%時(shí)，品種田間純度與真實(shí)純度的差別逐步變大。當(dāng)真實(shí)純度為70%時(shí)，品種田間純度與真實(shí)純度的最大。

2.3 相同真實(shí)純度下油菜在不同時(shí)期的田間純度變化

對(duì)田間純度與真實(shí)純度差異最大的品種豐油730和最小的品種灃油737各時(shí)期的田間純度進(jìn)行分析。由圖2可知，在4葉期時(shí)，2個(gè)參試品種的純度與原始純度相比沒有顯著變化，2個(gè)品種之間的田間純度也沒有顯著差異，表明發(fā)生在4葉期之

前的種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率等因素并未造成品種純度的顯著變化。在盛花期時(shí)，當(dāng)參試品種純度為90%時(shí)，灃油737、豐油730的田間純度分別為92.10%、93.57%，品種間差異不顯著。當(dāng)參試品種純度為70%時(shí)，灃油737、豐油730的田間純度分別為74.35%、83.21%，品種間差異達(dá)到顯著水平。表明品種間的田間純度相對(duì)變化發(fā)生于4葉期以后。

2.4 供試材料群體、雜交種與母本成活率表現(xiàn)

從圖3可以看出，供試品種灃油737、豐油730掛牌株在試驗(yàn)純度下群體成活率為78.67%～85.67%，死亡率達(dá)14.33%～21.33%，表明供試油菜在4葉期后的生長過程中，存在明顯的自疏現(xiàn)象，導(dǎo)致部分個(gè)體死亡，從而引起純度變化。

比較在不同真實(shí)純度下雜交種及母本的成活率發(fā)現(xiàn)，供試品種雜交種的成活率均顯著高于母本。在90%的真實(shí)純度下，灃油737、豐油730雜交種的成活率比母本的成活率分別高13.72、15.66個(gè)百分點(diǎn)，差異未達(dá)到顯著水平。在70%的真實(shí)純度下，灃油737、豐油730雜交種的的成活率比母本的成活率分別高4.84、38.04個(gè)百分點(diǎn)。豐油730的雜交種與母本成活率差值顯著高于灃油737。表明在群體生存競爭中，雜交種比母本的存活率更高，因而田間純度高于真實(shí)純度。在低純度下，品種間雜交種與母本的相對(duì)成活率存在顯著差異。

3 結(jié)論與討論

自疏是指因種群密度而引起種群個(gè)體死亡而密度減小的過程。大田密植條件下，母本假雜種和雜交種的競爭力存在差異，自疏會(huì)導(dǎo)致純度變化。研究自疏現(xiàn)象造成的純度變化對(duì)油菜純度鑒定有一定的指導(dǎo)意義。

近年來，分子方法尤其是利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行基因分型的技術(shù)被廣泛應(yīng)用到種子純度鑒定中[15-21]，王同華等[19]、穆建新[20]、王灝等[21]研究發(fā)現(xiàn)，雜交制種樣品SSR鑒定和田間鑒定的單株鑒定結(jié)果吻合率在97%以上，說明其能較好反應(yīng)種子的真實(shí)純度。另外，SSR分子標(biāo)記具有操作簡便、共顯性遺傳、多態(tài)性高、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)[22-23]，既保證了種子純度快速準(zhǔn)確鑒定，也為油菜生長過程中導(dǎo)致的弱勢株、死亡株的育性鑒定提供了技術(shù)支持。

此試驗(yàn)通過手工雜交得到雜交種，通過定量添加母本種子以確定試驗(yàn)材料的真實(shí)純度，消除了取樣誤差、外界花粉串粉等造成的樣品不確定性。試驗(yàn)中6個(gè)材料在6種真實(shí)純度下的田間純度表現(xiàn)均高于真實(shí)值，這與前人研究發(fā)現(xiàn)田間種植鑒定純度總體略高于室內(nèi)鑒定結(jié)果一致，蘇順宗[24]、黃壽輝[25]認(rèn)為這主要與雜交種的雜交優(yōu)勢有關(guān)，雜交種的優(yōu)勢體現(xiàn)在發(fā)芽勢上，有些假雜種在室內(nèi)相對(duì)優(yōu)良的環(huán)境下的發(fā)芽率一般會(huì)大于大田發(fā)芽率，從而導(dǎo)致大田鑒定結(jié)果偏高。王同華等[13]認(rèn)為雜交種單株的雜種優(yōu)勢主要體現(xiàn)在有限的生長空間比假雜種更容易成活，從而造成鑒定結(jié)果偏高。此試驗(yàn)中，在大田密植條件下4葉期后油菜群體的死亡率達(dá)14.33%～21.33%，雜交種的成活率均顯著高于母本。說明在4葉期后，群體競爭中雜交種的競爭優(yōu)勢是導(dǎo)致純度變化的原因。這可能是因?yàn)?葉期后，植株迅速生長，個(gè)體間在水分、養(yǎng)分和空間上存在激烈競爭，其中雜交種單株具有更強(qiáng)的生長競爭優(yōu)勢，較母本更容易存活，導(dǎo)致花期田間純度鑒定的結(jié)果偏高。這與王同華等[13]的推測一致。

試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)品種、真實(shí)純度及兩者的交互作用均對(duì)田間純度與真實(shí)純度的偏差有顯著影響。進(jìn)一步研究了2個(gè)品種高真實(shí)純度和低真實(shí)純度下的田間純度表現(xiàn)的差異，發(fā)現(xiàn)相同真實(shí)值下不同品種的田間純度鑒定值在高純度下田間純度鑒定值接近，而在低純度下田間純度鑒定值相差較大，這可能與雜交種與母本的相對(duì)發(fā)育進(jìn)程有關(guān)。在田間觀察中發(fā)現(xiàn)灃油737的母本比雜交種發(fā)育早，豐油730的母本比雜交種發(fā)育晚。在高純度下，母本占比較小，雜交種的生存優(yōu)勢占主導(dǎo)地位，品種間母本與雜交種的相對(duì)死亡率相差不大，不同品種的田間純度鑒定值接近。隨著純度降低母本占比提高，灃油737的母本因發(fā)育早，縮小了與雜交種的競爭差異；而豐油730的母本因發(fā)育較晚，擴(kuò)大了與雜交種的競爭差異。

試驗(yàn)結(jié)果表明，群體競爭導(dǎo)致的死苗現(xiàn)象和母本生存弱勢是影響田間鑒定純度的重要因素，且不同品種田間純度表現(xiàn)存在差異。因此，在田間種植鑒定中，一方面要適當(dāng)降低種植密度，保證播種均勻度，盡量減少群體競爭對(duì)田間種植鑒定的影響。另一方面要充分考慮各品種雜交種與母本種子的生長特性，通過前期試驗(yàn)確定最適田間密度。

此試驗(yàn)只研究了特定密度下油菜田間種植鑒定與真實(shí)純度的差異，后續(xù)試驗(yàn)將進(jìn)一步研究不同密度下油菜田間種植鑒定的準(zhǔn)確性，以篩選最適油菜田間種植鑒定密度，為優(yōu)化油菜田間種植鑒定技術(shù)提供數(shù)據(jù)支持。

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（責(zé)任編輯：張煥裕）