冬蟲夏草對(duì)糖尿病腎病大鼠腎小管細(xì)胞中AMPK/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的影響*

徐喆，趙凱，李志軍

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.天津市南開(kāi)醫(yī)院 心內(nèi)一科，天津 300100；3.天津市第一中心醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合科，天津 300192）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）又稱糖尿病腎小球硬化癥，是常見(jiàn)的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥，近年來(lái)其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)[1-2]。糖尿病腎病的主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)引起腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的病理改變，最終導(dǎo)致腎功能衰竭[2-3]。其中，腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化是損傷的腎細(xì)胞轉(zhuǎn)變成纖維細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)生腎纖維化的引發(fā)糖尿病腎病的關(guān)鍵[3-4]。研究表明，細(xì)胞自噬可以通過(guò)與細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖，存活和死亡相關(guān)的多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)和加速腎小管上皮細(xì)胞的損傷和死亡。LC3作為自噬激活的主要細(xì)胞學(xué)標(biāo)志，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，主要由AMPK/mTOR信號(hào)通路調(diào)控。LC3主要分為L(zhǎng)C3-I和LC3-Ⅱ 2個(gè)亞型，其中LC3-Ⅱ共價(jià)結(jié)合在磷脂酰乙醇胺的羧基端，并且更加牢固地結(jié)合在自噬體膜上，因此，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的含量變化，可以方便地判斷細(xì)胞狀態(tài)，LC3-II是細(xì)胞自噬泡膜的通用標(biāo)記物。AMPK是一種重要的受體，有助于細(xì)胞識(shí)別能量調(diào)節(jié)的變化，mTOR激酶是自噬的主要調(diào)節(jié)劑和關(guān)鍵信號(hào)分子，該自噬途徑啟動(dòng)受觸發(fā)因素影響，如營(yíng)養(yǎng)剝奪、胰島素和其他生長(zhǎng)因子，該因素可以與酪氨酸激酶受體結(jié)合而導(dǎo)致相關(guān)受體和磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/AMP依賴的蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate AMP-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路的激活，最終激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），而mTOR的激活可直接抑制自噬的啟動(dòng)，通過(guò)調(diào)控自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ阻斷自噬通路。因此，對(duì)于探尋有效的方法阻止和緩解腎小管上皮細(xì)胞的損傷，合理的控制和緩解細(xì)胞自噬造成的細(xì)胞損傷是DN研究的重點(diǎn)。本探討傳統(tǒng)中藥冬蟲夏草對(duì)DN腎小管上皮細(xì)胞增殖和分化的作用，及冬蟲夏草對(duì)糖尿病腎病的治療和防護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

60只成年雄性Wistar大鼠（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。大鼠飼養(yǎng)在無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照，溫度為（22±2）℃。冬蟲夏草（商品名：百令膠囊），規(guī)格：0.5 g每粒，批號(hào)：110826（杭州中美華東制藥有限公司）。一抗兔抗多克隆抗體p-AMPK、p-mTOR、LC-II和ACTB（美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)有限公司），二抗堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試驗(yàn)盒（上海碧云天生物工程有限公司），SDS-PAGE電泳設(shè)備及轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-rad公司）。

1.2 大鼠糖尿病模型復(fù)制

大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組20只。參照文獻(xiàn)[5]。模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠給予腹腔內(nèi)1次注射鏈脲佐菌素（STZ）55 mg/kg誘導(dǎo)糖尿病模型。3 d后大鼠尾靜脈取血，監(jiān)測(cè)大鼠血糖在16.7～27.0 mmol/L，視為糖尿病造模成功。1周后對(duì)大鼠進(jìn)行尿蛋白測(cè)定，若蛋白含量均＜30 mg/24 h，則為糖尿病大鼠的成功模型。模型成功后第2天給予實(shí)驗(yàn)組大鼠冬蟲夏草灌胃[2.5 g/（kg·d）]，對(duì)照組和模型組給予同劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃8周后處死大鼠。常規(guī)測(cè)定尿蛋白量和血肌酐；HE法檢測(cè)腎臟病理改變；TUNEL檢測(cè)腎小管細(xì)胞凋亡；采用Western blot檢測(cè)AMPK、mTOR和LC-Ⅱ的蛋白表達(dá)。

1.3 采樣與指標(biāo)檢測(cè)

成模后第8周末將大鼠放入代謝籠中，收集排泄24 h的尿液，大鼠血糖用血糖儀測(cè)定。10%水合氯醛（300 mg/kg）將大鼠腹腔注射麻醉，雙縮脲法測(cè)定大鼠尿蛋白含量；心臟穿刺采血，終點(diǎn)酶法測(cè)血清肌酐含量。

處死大鼠后，分離兩腎，取左腎測(cè)定左腎體重比（LKW/BWT），置于液氮中備用；取右腎稱重后，用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、透明及浸蠟包埋，連續(xù)石蠟切片6張（5 μm/張），切片用于HE染色和TUNEL原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)。

1.4 TUNEL檢測(cè)原位凋亡細(xì)胞

切片加入標(biāo)記液37℃孵育2 h后，加入生物素37℃孵育30 min。37℃恒溫孵育SABC試劑30 min，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色。切片用×20、×40物鏡顯微鏡進(jìn)行觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者即為凋亡細(xì)胞。每張切片選擇6個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行計(jì)數(shù)（×400），平均值即為切片凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取大鼠腎組織冰上裂解2 h，離心后用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，將各組蛋白濃度總量調(diào)整為30 μg/μl。將各組蛋白樣品加入到10% SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后按1∶500的稀釋比例加入多克隆抗體p-AMPK、p-mTOR、LC-II、ACTB和二抗。ECL顯色劑顯色，用Bio-Pro凝膠成像分析儀成像以及用Quantity-one軟件對(duì)各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描得出相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較做單因素方差分析，兩兩比較用Bonferroni's Multiple Comparison Test檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠物理及生化指標(biāo)

與對(duì)照組比較，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.310，P=0.000）；模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠尿蛋白含量增加，差異有統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（F=156.500，P=0.000）； 模 型 組和實(shí)驗(yàn)組大鼠血清肌酐含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（F=33.900，P=0.000）； 模 型 組 和 實(shí) 驗(yàn) 組大鼠LKW/BWT增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=436.600，P=0.000）。

與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.950，P=0.000）；尿蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.141，P=0.000）；血清肌酐含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.130，P=0.000）；LKW/BWT降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.270，P=0.000）。見(jiàn)附表。

附表 3組大鼠物理及生化指標(biāo)的比較 （n =20，±s）

附表 3組大鼠物理及生化指標(biāo)的比較 （n =20，±s）

組別 血糖/（mmol/L） 尿蛋白/（mg/24 h） 血肌酐/（μmol/L） LKW/BWT/%對(duì)照組 8.21±0.92 4.52±1.22 40.55±7.28 0.32±0.02模型組 26.37±3.82 52.77±11.41 58.84±7.17 0.61±0.04實(shí)驗(yàn)組 20.74±3.51 43.68±10.97 47.32±6.85 0.45±0.03 F值 47.310 156.500 33.900 436.600 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 HE染色結(jié)果

對(duì)照組大鼠的腎組織形態(tài)未見(jiàn)明顯異常，腎間質(zhì)、腎小球和腎小管的結(jié)構(gòu)基本正常。模型組大鼠可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量的空泡變性，上皮細(xì)胞出現(xiàn)變形、脫落和部分壞死；腎小管出現(xiàn)管腔擴(kuò)張、纖維化或萎縮，出現(xiàn)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；腎小球基底膜增厚，腎小球出現(xiàn)部分硬化，腎間質(zhì)出現(xiàn)明顯的纖維組織增生。實(shí)驗(yàn)組癥狀改善，腎間質(zhì)腎小管結(jié)構(gòu)破壞并不明顯，損傷有所改善。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠的腎組織形態(tài) （HE×400）

2.3 凋亡細(xì)胞

對(duì)照組僅見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠腎內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，與對(duì)照組大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)量（47.232±5.118）比較，模型組大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)量（184.734±13.610）和實(shí)驗(yàn)組大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)量（136.878±12.433）增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=798.800，P=0.000）。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.700，P=0.000）。見(jiàn)圖 2、3。

圖2 原位凋亡細(xì)胞 （TUNEL×400）

圖3 3組凋亡細(xì)胞比較

2.4 3組蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，模型組和實(shí)驗(yàn)組中p-mTOR蛋白含量（47.234±5.122）降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=272.100，P=0.000）；模型組和實(shí)驗(yàn)組中p-AMPK蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=198.400，P=0.000）；模型組和實(shí)驗(yàn)組中LC-Ⅱ蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=328.100，P=0.000）。

與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組p-mTOR蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.720，P=0.000）；p-AMPK蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.064，P=0.000）；LC-Ⅱ的蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.456，P=0.000）。見(jiàn)圖 4。

圖4 3組mTOR、AMPK和LC-Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

CS是一種名貴的蟲草屬植物類藥用真菌，主要由氨基酸、脂肪酸、多糖、有機(jī)酸和多種微量元素構(gòu)成[6-7]。研究表明，CS可有效降低血尿素氮和尿蛋白，減輕腎臟病理改變，阻止腎小球代償性肥大[8-9]；能夠拮抗氨基糖苷所致的溶酶體損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，保護(hù)和調(diào)節(jié)腎組織表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)腎小管的修復(fù)和再生[9-10]；CS可以抑制腎組織和腎小球硬化，減輕腎小管萎縮和腎間質(zhì)損傷，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)，同時(shí)對(duì)腎間質(zhì)纖維化有明顯的防治作用[11-12]；同時(shí)，冬蟲夏草能夠降低糖尿病動(dòng)物模型中血膽固醇、血肌酐和血Ⅳ型膠原的表達(dá)，抑制和緩解腎組織纖維化，減輕和延緩腎臟病理變化，對(duì)糖尿病腎病所致的大鼠腎損傷起到治療和防護(hù)作用[10-12]。

本研究表明，冬蟲夏草可以緩解糖尿病腎病導(dǎo)致的大鼠血糖含量、尿蛋白含量、血清肌酐含量和LKW/BWT等常規(guī)指標(biāo)增高的狀態(tài)。同時(shí)，CS持續(xù)作用糖尿病腎病大鼠后，大鼠腎臟的腎小管、腎小球和腎基質(zhì)損傷緩解，還可以有效減輕腎小管細(xì)胞的細(xì)胞損傷和壞死。由于mTOR和AMPK已被確定為自噬的主要調(diào)節(jié)劑，AMPK是一種重要的受體，活化的AMPK負(fù)調(diào)節(jié)mTOR，在富含氨基酸和生長(zhǎng)因子的營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)，細(xì)胞中mTOR被激活，用于阻斷自噬通路；而當(dāng)營(yíng)養(yǎng)缺乏，細(xì)胞處于饑餓環(huán)境時(shí)，mTOR的活性受到抑制，促進(jìn)細(xì)胞自噬通路的發(fā)生[13-15]。LC-Ⅱ作為參與mTOR信號(hào)通路的主要細(xì)胞自噬蛋白，在細(xì)胞自噬，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起到主要的調(diào)節(jié)作用[15]。研究表明，冬蟲夏草的腎臟保護(hù)作用可通過(guò)有效調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)通路的表達(dá)，降低LC-3II蛋白的含量，可以有效降低腎小管細(xì)胞自噬的發(fā)生。

綜上所述，本研究表明冬蟲夏草提取物能改善糖尿病腎病大鼠的腎小管細(xì)胞的自噬作用，減輕腎小管細(xì)胞的損傷，延緩大鼠糖尿病腎病的進(jìn)展。冬蟲夏草可能通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)通路的基因表達(dá)，延緩腎小管細(xì)胞的損傷。

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