基于超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜非靶向篩查分析烤牛肉在不同溫度下的差異標(biāo)記物

李波,孫世琨,蘇阿龍,禹潔,師希雄

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅省食品檢驗(yàn)研究院,甘肅 蘭州,730000)

國(guó)際相關(guān)調(diào)查和移民研究表示,飲食與結(jié)直腸息肉密切相關(guān)。有研究表明息肉組患者食用紅肉頻次相對(duì)較高且經(jīng)常吃紅肉的人患結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)更高,還可能增加患乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、食道癌和膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。但是,因?yàn)榧庸し绞健⑻砑拥恼{(diào)料等復(fù)雜的飲食因素,并沒(méi)有足夠的證據(jù)直接證明食用未經(jīng)加工的紅肉和致癌之間存在顯著關(guān)聯(lián),但可以明確的是,烹飪加工提高了肉類的消化率和適口性的同時(shí),也會(huì)產(chǎn)生致癌物質(zhì),并且多存在于煎炸、燒烤或干制的高溫烹飪方式過(guò)程中[4]。

牛肉及牦牛肉的加工制品,是甘肅省的特色肉品加工業(yè),它們的肉質(zhì)和滋味都得到了國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的一致認(rèn)可,但如果加工過(guò)程不規(guī)范或者控制條件不嚴(yán)格,會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品可能會(huì)含有對(duì)人體產(chǎn)生危害的組分,比如極高的加工溫度可導(dǎo)致致癌和致突變化合物的形成,包括已知的雜環(huán)胺、多環(huán)芳烴化合物、亞硝胺、脂質(zhì)過(guò)氧化物和自由基[5-7]。TENG等[8]采用高效液相色譜并熒光檢測(cè)器對(duì)豬肉烹飪過(guò)程中的雜環(huán)胺進(jìn)行檢測(cè),鐘華珍[9]采用高效液相色譜并紫外檢測(cè)器對(duì)3種畜禽肉中的多環(huán)芳烴進(jìn)行了測(cè)定,YAN等[10]采用超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-exactive-mass-spectrometry,UPLC-Q-Exactive-MS)研究了不同溫度下烤豬肉的代謝物差異以選擇指示肉類加熱終點(diǎn)溫度的標(biāo)記物。其中UPLC-Q-Exactive-MS利用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索方便,不需要使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定性就可采集全面的目標(biāo)物信息,因此在食品非靶向篩查中應(yīng)用十分廣泛[11]。然而,非靶向篩選技術(shù)的瓶頸是會(huì)產(chǎn)生大量過(guò)于復(fù)雜和難以管理的數(shù)據(jù)集,無(wú)法進(jìn)行人工分析,因此需要化學(xué)計(jì)量學(xué)的幫助。趙萍等[12]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用非靶向代謝組學(xué)方法對(duì)冷藏大鯢肉進(jìn)行研究,并利用偏最小二乘法判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)模型篩選共得到125種差異代謝物,獲得了7種潛在的生物標(biāo)志物。孫斌等[13]利用GC-MS研究了延邊黃牛臀肉與眼肉組織的代謝物,并用主成分分析(principal components analysis, PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)等統(tǒng)計(jì)方式對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,揭示出油酸等差異代謝物作為風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)。結(jié)合先進(jìn)的儀器,化學(xué)計(jì)量學(xué)能夠增強(qiáng)研究者對(duì)復(fù)雜系統(tǒng)的理解,并可以從海量數(shù)據(jù)中提取有價(jià)值的信息。該方法已用于區(qū)域分析、類型分類和食品鑒定中[14-15]。

目前,UPLC-Q-Exactive-MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)多數(shù)應(yīng)用在醫(yī)藥學(xué)研究中。在食品領(lǐng)域,其主要應(yīng)用于食品中的非法添加、外源性添加劑篩查、農(nóng)獸藥殘留及內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化[16-20],鮮少有研究追蹤食品在加工過(guò)程中產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)代謝組分。本研究以甘肅省甘南地區(qū)牛肉為研究對(duì)象,采用UPLC-Q-Exactive-MS技術(shù),結(jié)合PCA、PLS-DA、OPLS-DA及層次聚類分析(hierarchical clustering analysis, HCA)等多元統(tǒng)計(jì)方法,挖掘了在不同高溫條件下烤制牛肉的化學(xué)差異,篩查其風(fēng)險(xiǎn)與標(biāo)志組分的內(nèi)在關(guān)聯(lián)規(guī)律,轉(zhuǎn)變被動(dòng)過(guò)程追溯為主動(dòng)識(shí)別,能夠快速精準(zhǔn)地識(shí)別潛在風(fēng)險(xiǎn)以期為烤牛肉制品加工生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)條件進(jìn)行一定意義上的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑

乙腈、己烷、乙酸乙酯、乙酸銨,色譜純;氫氧化鈉、鹽酸,分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T25 d勻漿機(jī)、Vorex 3渦旋混合器,艾卡公司;SiO-6512均質(zhì)離心機(jī),本立科技公司;P300H超聲波清洗器,德國(guó)艾爾瑪公司;UNIVERSAL320R高速離心機(jī),德國(guó)海蒂詩(shī)公司;mv5氮吹儀,北京萊伯泰科公司;ME403T千分之一電子天平,梅特勒-托利多公司;Simplicity uv超純水機(jī),默克公司;含Compound Discoverer(CD)分析軟件Q-Exactive-MS四極桿軌道阱質(zhì)譜、Ultimate 3000高效液相色譜系統(tǒng),賽默飛世爾科技公司;Kinetex C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm粒徑)色譜柱,美國(guó)Phenomenex公司;KWS2060LQ-D1N電烤箱,格蘭仕公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本收集

從本地批發(fā)具有代表性的地理區(qū)域(甘南)的鮮瘦牛肉。進(jìn)行市場(chǎng)調(diào)查,以避免與牛肉來(lái)源相關(guān)的潛在關(guān)鍵標(biāo)記的差異。牛肉貯藏在-20 ℃條件下。

1.3.2 樣本制備

同一來(lái)源的牛肉,使用電烤箱在130、160、200、220 ℃下烘烤牛肉片[4 cm×4 cm×3 mm,(5±0.1) g],雙面各涂抹大豆油2 mL分別烘烤5 min,不添加鹽和香料?？竞玫呐Ｈ庠谑覝叵吕鋮s,然后切成小塊后勻漿。分析前,將處理好的牛肉末置于-20 ℃保藏。

1.3.3 代謝物提取

樣品代謝物的提取參考文獻(xiàn)[10]并做修改。采用連續(xù)兩步法從烤牛肉中提取盡可能多不同理化性質(zhì)的化合物。將勻漿后的烤牛肉放入50 mL的Eppendorf試管中,加入5 mL 1 mol/L NaOH和7 mL乙酸乙酯,將上清液在室溫下以6 000 r/min均質(zhì)1 min,然后渦旋振蕩2 min后置于超聲波清洗器中提取30 min。隨后,將提取液在4 ℃、9 000 r/min離心10 min,收集上清液。在剩余的組織中加入10 mL 1 mol/L HCl和5 mL己烷,然后按如上步驟所述進(jìn)行同樣的處理,并保留上清液。將兩步的上清液合并在40 ℃的氮?dú)饬飨抡舸抵两?用1 mL乙腈溶解,在4 ℃下13 000 r/min離心10 min,上清液通過(guò)0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾,待測(cè)。

1.3.4 空白和質(zhì)量控制(quality control,QC)樣品

混合所有樣品的等量上清液制備QC樣品。根據(jù)質(zhì)控樣品的重疊總離子流圖(total ion flow diagram,TIC)評(píng)估數(shù)據(jù)的重復(fù)性和儀器的穩(wěn)定性;用空白樣品的TIC圖測(cè)定儀器和色譜柱的清潔度。

1.3.5 色譜參數(shù)

使用Kinetex C18 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm粒徑)色譜柱;色譜柱溫度:40 ℃;進(jìn)樣量為5 μL;流動(dòng)相:10 mmol/L的乙酸銨溶液(A)、乙腈(B);流動(dòng)相流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0～1 min(0～30% B),1～9 min(30%～65% B),9～10 min(65%～95% B),10～17 min(95%～95% B),17～19 min(95%～30% B),19～20 min(30～30% B)。

1.3.6 高分辨質(zhì)譜參數(shù)

1.3.6.1 離子源參數(shù)

離子源:加熱電噴霧電離源;樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式;全掃描采集范圍:m/z100～1 000;分辨率:全掃描70 000FWHM、對(duì)窄范圍母離子碎裂17 500 FWHM;電噴霧電壓:+3.6 kV的HESI+和-3.6 kV的HESI-;加熱器溫度:320 ℃;毛細(xì)管溫度:350 ℃;鞘氣流速:40;輔助氣流速:10;離子傳輸透鏡電壓:55 V。

1.3.6.2 掃描參數(shù)

自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù):1e6,最大注入時(shí)間:100 ms。歸一化碰撞能量:40、50、60的階梯式碰撞能量。為了提高精密度和準(zhǔn)確度,在分析前分別用正負(fù)標(biāo)定溶液對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)使用Compound Discoverer軟件(3.3.1)進(jìn)行峰檢測(cè)、保留時(shí)間對(duì)齊等預(yù)處理。在Excel 2010中將數(shù)據(jù)整理為二維矩陣形式,保留了包含m/z值、保留時(shí)間、分子式、峰面積等信息,導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件(Umetrics, Sweden)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用PCA初步觀察樣品根據(jù)烤制溫度不同各組分間存在差異的情況。采用PLS-DA進(jìn)一步進(jìn)行分類并評(píng)價(jià)模型有效率,進(jìn)行置換檢驗(yàn)。在Compound Discoverer軟件中進(jìn)行熱圖聚類分析并根據(jù)P值和單變量分析差異倍數(shù)FC值(fold-change)過(guò)濾掉統(tǒng)計(jì)上不顯著的特征。將化合物的峰面積定義為變量,序號(hào)作為觀測(cè)ID,采用OPLS-DA對(duì)130 ℃和220 ℃下處理過(guò)的牛肉樣品進(jìn)行分析,根據(jù)變量投影重要度(variable importance in projection, VIP)(VIP>1),將實(shí)驗(yàn)圖譜、化學(xué)式等與mzCloud、ChemSpider等線上數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)尋找樣品潛在的特征化合物。

采用Excel 2010和Origin(8 Pro)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 QC和空白

基于正離子模式和負(fù)離子模式得到TIC圖,結(jié)果如圖1-a、圖1-b所示。圖中不同的顏色表示5個(gè)質(zhì)控樣品重疊的總離子流圖。橫坐標(biāo)表示保留時(shí)間,重疊峰表明代謝產(chǎn)物的提取和檢測(cè)具有良好的重復(fù)性和檢測(cè)系統(tǒng)的高穩(wěn)定性[21]。分析空白樣品的正負(fù)離子TIC圖,如圖1-c、圖1-d所示,沒(méi)有檢測(cè)到明顯的峰,說(shuō)明樣品中沒(méi)有殘留物質(zhì)或交叉污染。

a-5個(gè)質(zhì)控樣品正離子模式TIC圖;b-5個(gè)質(zhì)控樣品負(fù)離子模式TIC圖;c-空白樣品正離子模式TIC圖;d-空白樣品負(fù)離子模式TIC圖圖1 總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram

2.2 基于溫度變化的牛肉代謝產(chǎn)物分析

2.2.1 PCA和聚類熱圖分析

本研究使用Compound Discoverer軟件從Q-Exactive-MS正離子模式和負(fù)離子模式的總離子色譜圖中共提取了7 068個(gè)化合物。

利用代謝組學(xué)方法對(duì)牛肉在高溫過(guò)程中的分子代謝物進(jìn)行表征,可以更好地控制、評(píng)價(jià)和理解肉類的品質(zhì)。本研究的目的是利用UPLC-Q-Exactive-MS非靶向代謝組學(xué)方法分析不同的高溫加工溫度對(duì)牛肉代謝的影響。如圖2所示,不同烤制溫度的樣品具有明顯的層次聚類。采用PCA方法對(duì)不同溫度下烘烤的牛肉樣品進(jìn)行分析,由圖3-a和圖3-b可見(jiàn),生成的PCA得分圖顯示出明顯的分離。

a-正離子模式聚類熱圖;b-負(fù)離子模式聚類熱圖圖2 不同溫度牛肉樣品間顯著性差異離子層次聚類分析Fig.2 Hierarchical clustering significant differentially metabolites among different varieties of samples of beef

a-正離子模式PCA得分圖;b-負(fù)離子模式PCA得分圖圖3 PCA得分散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of PCA

2.2.2 PLS-DA

使用SIMCA軟件進(jìn)行PLS-DA,可以處理PCA無(wú)法忽略的組內(nèi)誤差和隨機(jī)誤差[22],并對(duì)該模型參數(shù)R2和Q2進(jìn)行200次置換檢驗(yàn),判別模型是否發(fā)生過(guò)度擬合。如圖4所示,各組是明顯分開(kāi)的,說(shuō)明各組的代謝物具有顯著性差異。同時(shí),本次分析中正離子模式下自變量擬合指數(shù)(R2X)為0.699,因變量擬合指數(shù)(R2Y)為0.967,模型預(yù)測(cè)指數(shù)(Q2)為0.525,負(fù)離子模式下自變量擬合指數(shù)(R2X)為0.56,因變量擬合指數(shù)(R2Y)為0.998,模型預(yù)測(cè)指數(shù)(Q2)為0.807,表明當(dāng)前PLS-DA模型穩(wěn)定可靠,具有良好的預(yù)測(cè)性。經(jīng)過(guò)200次置換檢驗(yàn),Q2點(diǎn)的藍(lán)色回歸線與縱軸相交于負(fù)坐標(biāo)軸,所有左側(cè)的藍(lán)色Q2值都低于右側(cè)的原始點(diǎn),說(shuō)明模型不存在過(guò)擬合,模型驗(yàn)證有效,認(rèn)為該結(jié)果可用于牛肉樣品的溫度差異分析。

a-正離子模式PLS-DA得分散點(diǎn)圖;b-正離子模式200個(gè)排列模型驗(yàn)證;c-負(fù)離子模式PLS-DA得分散點(diǎn)圖;d-負(fù)離子模式200個(gè)排列模型驗(yàn)證圖4 PLS-DA得分散點(diǎn)圖和200個(gè)排列模型驗(yàn)證Fig.4 Scatter plot of PLS-DA and 200 permutation test model validation plot

2.3 潛在的標(biāo)志物

2.3.1 OPLS-DA

由于共檢測(cè)到7 068個(gè)化合物,因此有必要降低數(shù)據(jù)維數(shù)。首先應(yīng)注意在高溫烤制過(guò)程中,代謝產(chǎn)物含量的增加或減少是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用方差分析(analysis of variance,ANOVA)的P值和FC值對(duì)從原始數(shù)據(jù)中提取的化合物在Compound Discoverer軟件中進(jìn)行過(guò)濾。以log2(FC)>1或<-1;P值<0.05篩選化合物構(gòu)建OPLS-DA模型以便快速定位潛在標(biāo)記物,共篩選出正離子模式下差異上調(diào)化合物16個(gè),差異下調(diào)化合物2 669個(gè);負(fù)離子模式下差異上調(diào)化合物4個(gè),差異下調(diào)化合物22個(gè)。OPLS-DA是建立在通過(guò)驗(yàn)證的PLS模型的基礎(chǔ)上尋找差異化學(xué)物質(zhì)的有監(jiān)督的分析方法[23]。如圖5所示,正負(fù)離子模式下130 ℃和220 ℃處理的烤牛肉代謝產(chǎn)物顯著分開(kāi)。在本研究中,正離子模式下OPLS-DA模型數(shù)值為R2X為0.905,R2Y為1,Q2為0.999,負(fù)離子模式下,R2X為0.899,R2Y為1,Q2為0.99,R2Y和Q2的高值表明模型解釋Y的高變化和OPLS-DA模型的預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)。

a-正離子模式OPLS-DA得分圖;b-負(fù)離子模式OPLS-DA得分圖圖5 OPLS-DA得分散點(diǎn)圖Fig.5 Scatter plot of OPLS-DA

2.3.2 差異化合物的鑒定

利用OPLS-DA模型生成的VIP值來(lái)選擇差異性表達(dá)代謝物。在本研究中,VIP>1的化合物被定義為潛在候選差異標(biāo)記物,在正離子模式下共篩選出1 447個(gè)化合物,負(fù)離子模式下篩選出14個(gè)化合物。然而,這些化合物是由Compound Discoverer軟件自動(dòng)從原始文件中提取的,需要進(jìn)一步的人工檢查,去除同位素、等價(jià)物、重復(fù)物并且需要一個(gè)可接受的峰形以確保這些化合物的真實(shí)性。更重要的是檢查這些化合物是否是在130～220 ℃的牛肉加工過(guò)程中影響牛肉品質(zhì)的重要因素,最后在正離子模式下篩選出4個(gè)潛在標(biāo)記物,用Compound Discoverer軟件對(duì)這4種物質(zhì)進(jìn)行了化學(xué)方程式假設(shè)。化學(xué)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)基于同位素模式和ChemSpider數(shù)據(jù)庫(kù),在m/zCloud數(shù)據(jù)庫(kù)的幫助下,對(duì)理論碎片和檢測(cè)到的碎片進(jìn)行了比較。經(jīng)過(guò)這個(gè)過(guò)程后,化合物被確定。上述4個(gè)選定標(biāo)志物的參數(shù)如表1所示。

表1 四個(gè)選定差異標(biāo)記物的化合物信息Table 1 Components identified with significant differences from the four selected markers

2.3.3 差異化合物的相對(duì)含量分析

查閱文獻(xiàn)可知,在高溫?zé)峒庸み^(guò)程中,雜環(huán)胺的形成與肌酸、肌酐等前體物質(zhì)密不可分[24]。3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶[4,3-b]吲哚(3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indol, Trp-P-1)是γ-咔啉類熱裂解雜環(huán)胺,為2B級(jí)潛在致癌物,可通過(guò)180 ℃的加熱條件下在含氨基酸、肌酸、還原糖的混合體系下生成[25-26];2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶(2-amino-1-methyl-phenylimidazo[4,3-b]pyridine, PhIP)為熱生成型雜環(huán)胺,由前體物葡萄糖、氨基酸、肌酸等物質(zhì)在熱反應(yīng)環(huán)境中最終反應(yīng)生成[27-28]。因此有必要探究烤牛肉中肌酸和肌酐在不同烤制溫度下的相對(duì)含量變化規(guī)律,以進(jìn)一步了解前體物質(zhì)與雜環(huán)胺生成的關(guān)系。肌酸是一種非蛋白質(zhì)性氨基酸,存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)為機(jī)體提供能量,肌酸酐是在熱處理過(guò)程中形成的,它是一種生理惰性的肌酸酐環(huán)化產(chǎn)物[29]。圖6結(jié)果表明,在牛肉烤制過(guò)程中,隨著加熱溫度升高,雜環(huán)胺的含量越來(lái)越高,轉(zhuǎn)化為肌酐的肌酸越多,且極性雜環(huán)胺相對(duì)含量高于非極性雜環(huán)胺。此外,氨基酸的相對(duì)含量變化并不顯著,差異化合物鑒定研究中未篩查到,原因可能與脂肪流失、水解有關(guān)[30]。在Compound Discoverer軟件中共人工篩查到賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、異亮氨酸、色氨酸等9種氨基酸,本研究不進(jìn)行進(jìn)一步分析。

a-Trp-P-1和PhIP的含量變化趨勢(shì); b-肌酐和肌酸的含量變化趨勢(shì)圖6 130～220 ℃下牛肉選定標(biāo)記物的含量變化趨勢(shì)Fig.6 Trend of selected marker abundance in beef treated with temperature from 130 ℃ to 220 ℃

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用了基于UPLC-Q-Exactive-MS的非靶向代謝組學(xué)方法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)優(yōu)秀的分析能力,為牛肉熱加工過(guò)程中標(biāo)記物的選擇和探索產(chǎn)生的有毒物質(zhì)變化規(guī)律提供了有效的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同溫度熱加工下的牛肉樣品中化學(xué)成分存在明顯差異。PCA可以在得分圖中顯示不同的分離組,所建PLS-DA模型具有良好的預(yù)測(cè)能力。用P值和FC值來(lái)篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的化合物,根據(jù)OPLS-DA模型,結(jié)合Compound Discoverer等分析軟件、線上數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)來(lái)選擇對(duì)分類有顯著貢獻(xiàn)的特征化合物,結(jié)果在正、負(fù)離子模式下分別找到1 447個(gè)和14個(gè)差異化學(xué)成分,最終篩選出了4個(gè)特征標(biāo)記。熱裂解雜環(huán)胺通常在高于300 ℃的加工條件下熱解產(chǎn)生,而其中的Trp-P-1卻可在180 ℃的加熱條件下生成,本研究驗(yàn)證了這一點(diǎn)。由于本研究樣本數(shù)量較多,顯然需要進(jìn)一步的實(shí)證工作來(lái)驗(yàn)證此標(biāo)記的有效性,但是研究強(qiáng)調(diào)了方法提供標(biāo)記的潛力,可用于有針對(duì)性的分析以確證有害物質(zhì)含量的變化規(guī)律。

高分辨質(zhì)譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合可以用來(lái)研究在食品加工、貯存和運(yùn)輸過(guò)程中復(fù)雜體系的樣品分析和差異代謝物的鑒定。本研究的方法在很大程度上依賴于在線數(shù)據(jù)庫(kù),并且高分辨質(zhì)譜價(jià)格昂貴也是阻礙該方法廣泛應(yīng)用的重要原因。