鰱魚(yú)重組cystatin C的抑菌活性及抑菌機(jī)理初探

徐小烽,李樹(shù)紅,錢(qián)鄧帆,郭淇羽,李冉,李龍飛,岑永好,段志豪,韓學(xué)艷,米辰

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安,625014)

我國(guó)水產(chǎn)資源豐富,水產(chǎn)品肉鮮味美、營(yíng)養(yǎng)豐富,深受消費(fèi)者喜愛(ài)。但水產(chǎn)品內(nèi)源酶活性高,且攜帶多種來(lái)自水體的微生物,易腐敗變質(zhì),因此冷藏是水產(chǎn)品重要的貯藏方式。此外高效、低毒的生物防腐劑也常用于食品保鮮。GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》僅允許抑制革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)的生物防腐劑即乳酸鏈球菌素應(yīng)用于水產(chǎn)食品保鮮,但其在偏中性的環(huán)境下穩(wěn)定性較差,也易被酶水解[1]。而在冷藏水產(chǎn)品中,除了存在部分G+葡萄球菌屬[2]、芽孢桿菌屬[3]等腐敗微生物,革蘭氏陰性菌(G-)氣單胞菌屬、假單胞菌屬、希瓦氏菌屬微生物是貨架期終點(diǎn)最常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[4-6]。水產(chǎn)品加工廢棄物本身富含天然的抗菌蛋白,若將其應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮,既能提高食品安全性,又充分利用了水產(chǎn)資源。

cystatins屬于一類半胱氨酸蛋白酶抑制因子,具有專一性抑制半胱氨酸蛋白酶的活性,包含cystatin C、cystatin D、cystatin E/M等形式,是一類低分子質(zhì)量(約13 kDa)蛋白質(zhì)。在水產(chǎn)品加工廢棄物魚(yú)卵、魚(yú)皮、魚(yú)肝臟等組織,均發(fā)現(xiàn)了cystatins活性。目前已發(fā)現(xiàn)陸生動(dòng)植物源cystatins具有抑菌活性[7-8],而對(duì)魚(yú)源cystatins抑菌研究有限。本團(tuán)隊(duì)首先發(fā)現(xiàn)了鰱魚(yú)卵cystatin C能抑制冷藏鰱魚(yú)肉片中的G-假單胞菌J-4[9],之后發(fā)現(xiàn)其對(duì)G-銅綠假單胞菌[10]、草莓假單胞菌和熒光假單胞菌也有抑菌效果[11]。此外,僅YU等[12]報(bào)道了牙鲆重組cystatin C對(duì)魚(yú)病相關(guān)的G-病原菌,以及G+金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑制作用。魚(yú)源cystatin C作為一種對(duì)部分G-及G+有抑菌活性的天然抗菌蛋白,在pH 4～9穩(wěn)定性好[13],且能抵抗半胱氨酸蛋白酶的水解,有望被開(kāi)發(fā)為水產(chǎn)食品生物防腐劑。因此闡明魚(yú)源cystatin C的抑菌活性及作用機(jī)制,具有一定的理論和現(xiàn)實(shí)意義。一般認(rèn)為小分子的抗菌蛋白或抗菌肽,主要與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用,從而導(dǎo)致菌體裂解死亡[14]。目前僅BLANCA等[15]從形態(tài)學(xué)上觀察了重組人唾液cystatin C對(duì)G+糞腸球菌和變形鏈球菌的抑制作用。而魚(yú)源cystatins抑制G+及G-的相關(guān)機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。

為此,本文在團(tuán)隊(duì)前期研究基礎(chǔ)上,通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑(diameter of inhibition zone,DIZ)、最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC),評(píng)價(jià)鰱魚(yú)(Hypophthalmichthysmolitrix)重組cystatin C(HmCystatin C)對(duì)從冷藏水產(chǎn)品中分離的腐敗希瓦氏菌、中間氣單胞菌、熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的抑菌活性;分析了HmCystatin C對(duì)兩株敏感受試菌生長(zhǎng)曲線的影響,并從HmCystatin C與菌體及其細(xì)胞壁成分的結(jié)合、對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜通透性影響方面,初步探究HmCystatin C的抑菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HmCystatin C根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期確定的方法制備[16],由轉(zhuǎn)入鰱魚(yú)cystatin-pet-30a的工程菌大腸桿菌(EsherichiacoliBL(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)、純化,微濾除菌后保存。純度為95%,比活性為1 428.57 unit/mg。

G-:腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)以及G+:腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院水產(chǎn)品科學(xué)研究室分離并保存。

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(來(lái)源于銅綠假單胞菌ATCC 27316,純度≥98%),北京索萊寶科技有限公司;肽聚糖(peptidoglycan, PGN)(來(lái)源于金黃色葡萄球菌,BR級(jí)),上海源葉生物科技有限公司;Anti-His tag Antibody,武漢博士德生物工程有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L),碧云天生物技術(shù)有限公司;EL-TMB顯色試劑盒、N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, NPN),生工生物工程(上海)股份有限公司;重組鼠硫氧還原蛋白(Trx-His-tag),上海鈺博生物科技有限公司;堿性磷酸酶試劑盒,南京建成生物科技有限公司;NB、NA培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-98AB恒溫振蕩培養(yǎng)箱、LRH-250生化培養(yǎng)箱,一恒科學(xué)儀器(上海)有限公司;TGL-18M高速冷凍離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Varioskan Flash熒光酶標(biāo)儀,美國(guó)賽默飛世爾科技公司;DDS-307電導(dǎo)率儀,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;DYCN-40G轉(zhuǎn)印電泳儀,北京六一生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 受試菌的活化及菌懸液的制備

將受試菌接種于NA培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng),挑取單菌落接種至NB培養(yǎng)基,擴(kuò)大培養(yǎng)24 h(37 ℃,150 r/min),以1%接種量接種至新鮮NB培養(yǎng)基,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用平板計(jì)數(shù)法確定菌液濃度后,適當(dāng)稀釋備用。

1.3.2 DIZ的測(cè)定

濾紙片擴(kuò)散法[17]測(cè)定HmCystatin C對(duì)6株受試菌的DIZ。HmCystatin C用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)溶解至3.75 mg/mL,取40 μL 滴加在含菌培養(yǎng)皿表面的濾紙片上,3個(gè)平行。以無(wú)菌PBS做陰性對(duì)照,測(cè)定DIZ值。并選擇抑制效果突出的受試菌,滴加40 μL不同質(zhì)量濃度(0.937 5、1.875、3.75、7.5 mg/mL)的HmCystatin C溶液,以確定劑量依賴關(guān)系。

1.3.3 MIC和MBC的測(cè)定

采用二倍稀釋法[18]測(cè)定HmCystatin C對(duì)6株受試菌的MIC和MBC。將14 mg/mL的HmCystatin C分別稀釋至7、3.5、1.75、0.875 mg/mL。酶標(biāo)孔中加HmCystatin C溶液和菌懸液各100 μL,各孔加入20 μL 的0.01%刃天青溶液(藍(lán)色)顯色。以空白培養(yǎng)基為陰性對(duì)照,不含HmCystatin C的菌液作為陽(yáng)性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h后,以不變色的藍(lán)色微孔中樣品的最小質(zhì)量濃度為MIC。在各試驗(yàn)組中取藍(lán)色微孔中菌液100 μL,平板涂布后培養(yǎng)并觀察,以無(wú)菌生長(zhǎng)的HmCystatin C最小質(zhì)量濃度為MBC。

1.3.4 HmCystatin C對(duì)典型受試菌生長(zhǎng)曲線的影響

選擇HmCystatin C抑制效果最好的G-和G+各一株作為典型受試菌。菌懸液(OD600=0.6)中加入HmCystatin C至終濃度為1× MIC,以僅含受試菌組為對(duì)照,每2 h取樣測(cè)定24 h內(nèi)600 nm處吸光度。

1.3.5 HmCystatin C與典型受試菌的結(jié)合

參考CHEN等[19]方法,測(cè)定HmCystatin C與G-和G+典型受試菌的結(jié)合情況。菌懸液離心(3 500×g,5 min)后收集菌體沉淀,用無(wú)菌PBS洗滌并重懸至OD600=0.8,加入HmCystatin C至終濃度為1× MIC,室溫孵育1 h后離心,并用適量無(wú)菌PBS洗滌菌體沉淀,3次重復(fù)后收集菌體沉淀和最后一次的菌體洗滌液。陽(yáng)性對(duì)照為HmCystatin C組,陰性對(duì)照以Trx-His-tag替代HmCystatin C,進(jìn)行SDS-PAGE以及Western blot檢測(cè)HmCystatin C與細(xì)菌的結(jié)合情況。

1.3.6 HmCystatin C與LPS及PGN結(jié)合

采用ELISA法[19]測(cè)定HmCystatin C與LPS和PGN的結(jié)合情況。酶標(biāo)板中加入適量LPS和PGN溶液過(guò)夜包被,再加入終濃度分別為0,0.5×MIC,1×MIC,1.5×MIC,2× MIC的HmCystatin C。先后經(jīng)小鼠抗His-tag抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (H+L)孵育并洗滌,用TMB試劑顯色后于450 nm處檢測(cè)吸光度。以等量無(wú)菌PBS溶液替代LPS或PGN溶液作陰性對(duì)照。

1.3.7 HmCystatin C對(duì)典型受試菌細(xì)胞完整性影響

1.3.7.1 典型受試菌G-細(xì)胞外膜滲透性測(cè)定

參考HELANDER等[20]方法,評(píng)估HmCystatin C對(duì)典型受試菌G-銅綠假單胞菌細(xì)胞外膜的破壞程度。將各濃度(0,0.5×MIC,1×MIC,1.5×MIC,2×MIC)的HmCystatin C分別與受試菌混合,以等量BSA代替HmCystatin C為對(duì)照組,加入20 μL的0.25 mmol/L NPN溶液,用熒光酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(zhǎng)350 nm、發(fā)射波長(zhǎng)420 nm下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.3.7.2 典型受試菌G+細(xì)胞壁滲透性測(cè)定

取典型受試菌G+腐生葡萄球菌測(cè)定其堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)含量。在受試菌中加入HmCystatin C使其終濃度分別為0.5× MIC和1× MIC,37 ℃,150 r/min培養(yǎng),以僅含菌懸液組作為對(duì)照,5 h內(nèi)定時(shí)取樣,離心后取上清液參考試劑盒方法測(cè)定AKP含量。

1.3.7.3 HmCystatin C對(duì)典型受試菌細(xì)胞內(nèi)膜通透性影響

參考HELANDER等[20]方法,測(cè)定胞內(nèi)泄露物β-半乳糖苷酶含量變化,反映HmCystatin C對(duì)典型受試菌(G-及G+)細(xì)胞內(nèi)膜通透性影響。受試菌懸液中加入等體積的鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(2-nitrophenyl β-D-galactopyranoside,ONPG)溶液及HmCystatin C(0.5× MIC、1× MIC),陰性對(duì)照組以等量0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl溶液代替HmCystatin C。于酶標(biāo)儀420 nm處測(cè)定100 min內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的吸光值。

1.3.7.4 典型受試菌菌液電導(dǎo)率的測(cè)定

參考TAO等[21]方法。離心收集G-及G+典型受試菌菌體沉淀,PBS洗滌后重懸至1×106CFU/mL,加入HmCystatin C使終濃度分別為0.5×MIC,1×MIC。37 ℃,150 r/min培養(yǎng),5 h內(nèi)定時(shí)取樣,離心后取上清液測(cè)定電導(dǎo)率。以僅含菌懸液作為對(duì)照組。以各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)與0 h點(diǎn)對(duì)應(yīng)的電導(dǎo)率值之差表示電導(dǎo)率增值。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖,SPSS Statistics 27進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取測(cè)定結(jié)果的平均值,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HmCystatin C對(duì)受試菌DIZ、MIC和MBC的測(cè)定

HmCystatin C對(duì)6株受試菌的DIZ、MIC和MBC如表1及圖1所示。除G+枯草芽孢桿菌外,HmCystatin C對(duì)G-腐敗希瓦氏菌、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、中間氣單胞菌以及G+腐生葡萄球菌均有抑制效果。對(duì)腐生葡萄球菌的DIZ[(15.4±0.02) mm]最大,其次是銅綠假單胞菌[(12.7±0.04) mm],而對(duì)腐敗希瓦氏菌的DIZ[(10.3±0.1) mm]最小。且腐生葡萄球菌、銅綠假單胞菌、中間氣單胞菌和熒光假單胞菌對(duì)HmCystatin C有相似的敏感性,MIC均為3.5 mg/mL。結(jié)合腐生葡萄球菌、銅綠假單胞菌、中間氣單胞菌MBC值(3.5 mg/mL)可知,HmCystatin C對(duì)這3株菌的抑制效果最好;對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑菌效果較弱,其MIC和MBC均為7 mg/mL。該結(jié)果與抑菌圈直徑的趨勢(shì)符合。腐敗希瓦氏菌是有氧冷藏海水魚(yú)中特定的腐敗微生物[6],因此淡水鰱魚(yú)來(lái)源的cystatin C可能對(duì)其抑菌效果有限。從HmCystatin C劑量依賴實(shí)驗(yàn)(表2、圖2)可知,隨著HmCystatin C濃度增加,銅綠假單胞菌、中間氣單胞菌及腐生葡萄球菌的DIZ依次增加。尤其腐生葡萄球菌在HmCystatin C質(zhì)量濃度為1.875 mg/mL時(shí)仍呈現(xiàn)明顯的抑菌圈。冷藏水產(chǎn)品中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌,如假單胞菌屬、氣單胞菌屬和希瓦氏菌屬,產(chǎn)尸胺和腐胺的能力強(qiáng)[4-5],G+腐生葡萄球菌也是水產(chǎn)品中典型產(chǎn)組胺的優(yōu)勢(shì)菌[2],嚴(yán)重影響水產(chǎn)品品質(zhì);HmCystatin C對(duì)除G+枯草芽孢桿菌外的受試G-和G+腐敗菌均有明顯抑制作用,因此其作為水產(chǎn)品保鮮劑具有潛在優(yōu)勢(shì)。

表1 HmCystatin C對(duì)6株受試菌的DIZ、MIC及MBCTable 1 DIZ, MIC, and MBC of HmCystatin C against six tested bacteria

a-銅綠假單胞菌;b-中間氣單胞菌;c-熒光假單胞菌; d-腐敗希瓦氏菌;e-腐生葡萄球菌;f-枯草芽孢桿菌圖1 HmCystatin C對(duì)6株受試菌的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of HmCystatin C against six tested bacteria

表2 不同濃度HmCystatin C對(duì)3株受試菌DIZ的影響 單位:mm

1-0.937 5 mg/mL;2-1.87 5 mg/mL;3-3.75 mg/mL; 4-7.5 mg/mL;5-PBS a-銅綠假單胞菌;b-中間氣單胞菌;c-腐生葡萄球菌圖2 不同濃度HmCystatin C對(duì)3株受試菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of different concentrations of HmCystatin C on three tested bacteria

2.2 HmCystatin C對(duì)典型受試菌生長(zhǎng)曲線的影響

以抑制效果最好的G-銅綠假單胞菌和G+腐生葡萄球?yàn)榈湫褪茉嚲?測(cè)定HmCystatin C對(duì)其生長(zhǎng)曲線的影響(圖3)。相比對(duì)照組典型的細(xì)菌生長(zhǎng)模式,HmCystatin C在1× MIC水平下,對(duì)兩株受試菌的生長(zhǎng)都表現(xiàn)明顯抑制(P<0.01);銅綠假單胞菌培養(yǎng)24 h 內(nèi)無(wú)增殖跡象(圖3-a);腐生葡萄球菌培養(yǎng)6 h后OD600值稍有增加,但增殖速度極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(圖3-b);結(jié)果表明,鰱魚(yú)重組HmCystatin C在1× MIC下能夠抑制受試菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期快速分裂增殖,表現(xiàn)出顯著的生長(zhǎng)抑制效果。

2.3 HmCystatin C與典型受試菌菌體結(jié)合

由圖4可知,陽(yáng)性對(duì)照組及兩實(shí)驗(yàn)組均有明顯的條帶,陰性對(duì)照組和最后一次菌體洗滌液組均未顯色,說(shuō)明HmCystatin C與菌體孵育后,能結(jié)合到G-銅綠假單胞菌和G+腐生葡萄球菌菌體表面。此外銅綠假單胞菌實(shí)驗(yàn)組比腐生葡萄球菌實(shí)驗(yàn)組的條帶更明顯,說(shuō)明HmCystatin C與G-銅綠假單胞菌結(jié)合能力更強(qiáng)。HmCystatin C(Genebank序列號(hào):AGW15355.1)氨基酸序列中富含帶正電荷的Lys,這可能有利于其利用N端帶正電荷的序列與細(xì)菌表面的負(fù)電荷發(fā)生靜電吸引[22]。此外,BROGDEN[23]認(rèn)為抗菌肽能結(jié)合到細(xì)胞表面,主要是與G+細(xì)胞壁中帶負(fù)電荷的磷壁酸質(zhì)相互作用,這種結(jié)合使得抗菌肽能夠通過(guò)細(xì)胞壁(壁磷壁酸和膜磷壁酸)并與細(xì)菌質(zhì)膜相互作用,從而發(fā)揮抑菌作用。盡管目前尚未知HmCystatin C與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合的具體方式和位點(diǎn),但可推測(cè)HmCystatin C能夠結(jié)合到細(xì)菌表面是其進(jìn)一步發(fā)揮抑菌作用的前提。

1-HmCystatin C陽(yáng)性對(duì)照;2-腐生葡萄球菌實(shí)驗(yàn)組; 3-腐生葡萄球菌陰性對(duì)照;4-腐生葡萄球菌最后一次洗滌液; 5-銅綠假單胞菌實(shí)驗(yàn)組;6-銅綠假單胞菌陰性對(duì)照組; 7-銅綠假單胞菌最后一次洗滌液圖4 HmCystatin C與銅綠假單胞菌和腐生葡萄球菌 結(jié)合的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of HmCystatin C binding to P.aeruginosa and S.saprophyticus

2.4 HmCystatin C與LPS和PGN結(jié)合

LPS和PGN分別是G-和G+細(xì)胞壁的主要成分。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HmCystatin C能與LPS和PGN結(jié)合(圖5),其與LPS的親和性強(qiáng)于PGN,并且隨著蛋白濃度增大,與LPS的結(jié)合趨勢(shì)增強(qiáng)。結(jié)合Western blot檢測(cè)結(jié)果,推測(cè)HmCystatin C結(jié)合在菌體表面,很可能涉及與細(xì)胞壁主要成分LPS和PGN的相互作用,是進(jìn)一步突破細(xì)胞壁屏障發(fā)揮抑菌作用的前提。BLANCA等[15]通過(guò)透射電鏡也觀察到,G+糞腸球菌和變形鏈球菌經(jīng)重組人cystatin C在37 ℃處理24 h后,肽聚糖層被破壞,cystatin C穿透細(xì)胞壁。

圖5 HmCystatin C與LPS和PGN的結(jié)合Fig.5 Binding of HmCystatin C to LPS and PGN

2.5 HmCystatin C對(duì)典型受試菌細(xì)胞完整性的影響

2.5.1 HmCystatin C對(duì)典型受試菌細(xì)胞壁通透性的影響

2.5.1.1 HmCystatin C對(duì)G-銅綠假單胞菌細(xì)胞外膜的影響

G-細(xì)胞壁由細(xì)胞外膜和細(xì)胞間質(zhì)層組成。當(dāng)G-細(xì)胞外膜被破壞,NPN可進(jìn)入胞內(nèi)疏水介質(zhì)中,發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。在各濃度的HmCystatin C作用下,銅綠假單胞菌的熒光強(qiáng)度值相比對(duì)照組極顯著增加(P<0.01),尤其在1× MIC的HmCystatin C濃度范圍內(nèi),菌液的熒光強(qiáng)度迅速升高,此后趨緩(圖6)。上述結(jié)果說(shuō)明HmCystatin C破壞了G-銅綠假單胞菌細(xì)胞壁,破壞程度與HmCystatin C濃度呈正相關(guān)。而通常G-細(xì)胞壁的滲透性與其外膜層的LPS密切關(guān)系[24]。這與上述HmCystatin C對(duì)LPS具有較強(qiáng)親和性的結(jié)果一致。推測(cè)HmCystatin C通過(guò)與細(xì)胞壁表面的LPS吸附結(jié)合,可能破壞并穿透銅綠假單胞菌細(xì)胞壁外膜層,繼而發(fā)揮抑菌作用。

2.5.1.2 HmCystatin C對(duì)G+腐生葡萄球菌細(xì)胞壁的影響

AKP存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間,當(dāng)細(xì)胞壁被破壞后,AKP泄露。HmCystatin C對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的影響程度,可通過(guò)AKP含量變化來(lái)衡量。由圖7可知,腐生葡萄球菌對(duì)照組中,在5 h內(nèi)AKP的含量沒(méi)有明顯變化,而在HmCystatin C的兩個(gè)處理組中,AKP有不同程度外泄。隨著HmCystatin C濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),泄露的AKP含量升高。說(shuō)明HmCystatin C對(duì)G+腐生葡萄球菌細(xì)胞壁具有破壞作用。BLANCA等[15]從形態(tài)學(xué)上觀察到,重組人cystatin C也能夠使G+糞腸球菌和變形鏈球菌細(xì)胞壁斷裂。

圖6 HmCystatin C對(duì)銅綠假單胞菌細(xì)胞壁通透性的影響Fig.6 The effect of HmCystatin C on cell wall permeability of P.aeruginosa

圖7 HmCystatin C對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞壁通透性的影響Fig.7 The effect of HmCystatin C on cell wall permeability of S.saprophyticus

2.5.2 HmCystatin C對(duì)典型受試菌細(xì)胞質(zhì)膜通透性的影響

2.5.2.1 HmCystatin C對(duì)典型受試菌細(xì)胞內(nèi)膜的影響

當(dāng)受試菌細(xì)胞內(nèi)膜被破壞,胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶滲出,因此其含量變化反映受試菌細(xì)胞內(nèi)膜通透性的變化[25]。在HmCystatin C作用下,銅綠假單胞菌(圖8-a)和腐生葡萄球菌(圖8-b)OD420值均比對(duì)照組大(P<0.01),且隨著HmCystatin C濃度增加而增大。上述結(jié)果說(shuō)明,經(jīng)HmCystatin C處理后,G-銅綠假單胞菌和G+腐生葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)膜被破壞,影響菌體正常生長(zhǎng)。BLANCA等[15]從形態(tài)學(xué)上也觀察到,重組人cystatin C能夠使G+糞腸球菌和變形鏈球菌細(xì)胞質(zhì)膜斷裂,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物滲出。

2.5.2.2 HmCystatin C對(duì)典型受試菌電導(dǎo)率的影響

當(dāng)抗菌物質(zhì)作用于細(xì)菌,細(xì)胞膜被破壞,胞內(nèi)電解質(zhì)泄露,培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升,因此菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜通透性的變化[26]。

a-銅綠假單胞菌;b-腐生葡萄球菌圖8 HmCystatin C對(duì)銅綠假單胞菌和腐生葡萄球菌 內(nèi)膜通透性的影響Fig.8 The effect of HmCystatin C on the inner membrane permeability of P.aeruginosa and S.saprophyticus

a-銅綠假單胞菌;b-腐生葡萄球菌圖9 HmCystatin C對(duì)銅綠假單胞菌和腐生葡萄球菌 菌液電導(dǎo)率的影響Fig.9 The effect of HmCystatin C on conductivity of P.aeruginosa and S.saprophyticus suspension

經(jīng)HmCystatin C處理后,兩種受試菌的電導(dǎo)率增值均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),且與HmCystatin C濃度呈正相關(guān)(圖9)。這與對(duì)受試菌細(xì)胞壁通透性影響結(jié)果一致,也與抑菌圈表現(xiàn)出HmCystatin C劑量依賴關(guān)系相符。該結(jié)果可進(jìn)一步驗(yàn)證HmCystatin C能夠破壞銅綠假單胞菌和腐生葡萄球菌細(xì)胞質(zhì)膜的完整性,使細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)。

3 結(jié)論

本文研究了HmCystatin C對(duì)水產(chǎn)品腐敗菌的抑菌活性和抑菌機(jī)制。除枯草芽孢桿菌外,HmCystatin C對(duì)其余5株受試菌均有抑菌效果,且腐生葡萄球菌、銅綠假單胞菌、中間氣單胞菌對(duì)HmCystatin C更敏感。1× MIC的HmCystatin C即能抑制銅綠假單胞菌和腐生葡萄球菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期快速分裂增殖,抑菌效果顯著。Western blot結(jié)果表明,HmCystatin C能與G-和G+典型受試菌菌體結(jié)合,且與G-典型受試菌銅綠假單胞菌體結(jié)合能力更強(qiáng)。ELISA分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),HmCystatin C能與G-和 G+細(xì)胞壁成分即LPS和PGN發(fā)生結(jié)合,且與LPS的結(jié)合能力更強(qiáng)。因此HmCystatin C結(jié)合到細(xì)菌表面,可能是其發(fā)揮抑菌作用的必要前提。此外,HmCystatin C作用后,G-和G+典型受試菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性明顯增加,細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)、AKP和β-半乳糖苷酶出現(xiàn)不同程度的泄漏。綜上結(jié)果,我們推測(cè)HmCystatin C可能首先吸附到菌體表面并與細(xì)胞壁成分結(jié)合,進(jìn)而破壞了細(xì)胞完整性,導(dǎo)致細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性增加,細(xì)胞內(nèi)容物外泄,最終造成菌體死亡,但HmCystatin C對(duì)G-和G+的作用方式和機(jī)制可能有所差異,相關(guān)抑菌機(jī)理待進(jìn)一步研究。HmCystatin C對(duì)水產(chǎn)品中常見(jiàn)的G-和G+優(yōu)勢(shì)腐敗菌均表現(xiàn)良好的抑制作用,具有作為高效生物防腐劑的潛在優(yōu)勢(shì),本文研究結(jié)果對(duì)今后魚(yú)源cystatin C應(yīng)用于水產(chǎn)品防腐保鮮具有指導(dǎo)意義。