秸稈焚燒對(duì)白葉枯病稻田中致病菌和抗生素抗性基因的影響

王彬浩，陳彥博，劉榮杰，王冬群，董作珍，狄蕊，王笑，吳愉萍

（1.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.浙江大學(xué)杭州國(guó)際科創(chuàng)中心，浙江 杭州 311200；3.寧海縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，浙江 寧波315600；4.慈溪市農(nóng)業(yè)監(jiān)測(cè)中心，浙江 寧波 315300；5.寧波市海曙區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)管理服務(wù)站，浙江 寧波 315012；6.寧波市鎮(zhèn)海區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 寧波 315200；7.寧波市江北區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)站，浙江 寧波 315033；8.寧波市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綠色發(fā)展中心，浙江 寧波315012）

作物秸稈是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的一種生物質(zhì)資源。作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，我國(guó)2021年農(nóng)作物秸稈總量為8.65億t，其中秸稈直接還田量為4.02億t，有力推動(dòng)了秸稈的綠色利用[1]。然而，由于在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，秸稈直接還田在還田量、還田方式、還田配套農(nóng)藝措施等方面仍存在許多問(wèn)題，對(duì)后茬作物的產(chǎn)量和病害暴發(fā)存在負(fù)面影響[2]，因此，部分農(nóng)戶(hù)仍然采用焚燒方式處理秸稈，以期避免后茬作物發(fā)病。

水稻白葉枯病是由水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）侵染引起的一種細(xì)菌性病害，是水稻三大病害之一[3]。水稻感染白葉枯病后，通常減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)50%以上[4]。此外，由于稻田通常是常年連作，這種方式不僅會(huì)加劇致病菌富集，而且有利于抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes,ARGs）的富集，并通過(guò)移動(dòng)基因元件（mobile genetic elements, MGEs）加速病菌的水平傳播，最終導(dǎo)致耐藥性致病菌（生物復(fù)合污染）的比例不斷升高。例如，隨著單一作物的連續(xù)種植，土傳植物致病菌會(huì)不斷積累，從而導(dǎo)致枯萎病、青枯病等土傳病害的暴發(fā)[5]。棉花、黃瓜、馬鈴薯及香草等作物的農(nóng)業(yè)系統(tǒng)均易受連作效應(yīng)的影響，隨連作時(shí)間的延長(zhǎng)，其土壤中土傳植物致病菌豐度增高[6-8]。已有的研究表明，秸稈焚燒會(huì)造成土壤微生物數(shù)量和活性的顯著下降[9-10]，這對(duì)于揭示田間秸稈焚燒抑制白葉枯病的潛在機(jī)制提供了一定的依據(jù)。然而，目前關(guān)于秸稈焚燒的影響研究多集中在大氣和土壤理化環(huán)境變化方面，針對(duì)秸稈焚燒前后稻田土壤中致病菌或ARGs的變化情況少見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以暴發(fā)白葉枯病的稻田土壤和稻茬為研究對(duì)象，對(duì)比焚燒前后土壤理化特性、微生物致病菌、ARGs、MGEs的變化情況，探討稻田致病菌群落和ARGs 組成與土壤含水量、有機(jī)質(zhì)含量、速效養(yǎng)分含量的相關(guān)性，以期為綜合解析和客觀評(píng)價(jià)秸稈焚燒對(duì)土壤生物復(fù)合污染的影響提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

取樣調(diào)查地點(diǎn)位于浙江省寧波市，分別為慈溪市龍山鎮(zhèn)海甸戎村、海曙區(qū)洞橋鎮(zhèn)宣裴村和集士港鎮(zhèn)朱浪漕村、寧?？h茶院鄉(xiāng)下徐塘村、鎮(zhèn)海區(qū)蟹浦鎮(zhèn)覺(jué)渡村和駱駝街道清湖村，包括了該市主要的水稻種植區(qū)域（表1）。于2021 年11—12 月在暴發(fā)白葉枯病的稻田中對(duì)秸稈焚燒前后的土壤和稻茬分別取樣，各采集16 個(gè)混合樣品。土壤樣品：除去土壤表面的灰分和秸稈，用內(nèi)徑為5 cm的土鉆在各小區(qū)取0～5 cm表層的土樣，去除石礫和根系，每個(gè)樣品均由3 點(diǎn)土樣混合而成（約0.5 kg），并分成兩份，一份保存在－20 ℃冰箱中，用于微生物的測(cè)定，另一份于室內(nèi)風(fēng)干，用于土壤含水量、有機(jī)質(zhì)含量、速效養(yǎng)分含量等理化因子的測(cè)定。稻茬樣品：收集留茬秸稈樣品（取3茬，每茬取2根），保存在－20 ℃冰箱中，用于微生物的測(cè)定。

表1 研究區(qū)域和樣品采集Table 1 Study area and sample collection

1.2 土壤理化因子測(cè)定

將土壤在105～110 ℃烘箱中烘干，稱(chēng)量其烘干前后的質(zhì)量，獲得土壤含水量。稱(chēng)量5.0 g 土壤于50 mL 離心管中，加入20.0 mL 去離子水，振蕩30 min，離心后用pH 計(jì)測(cè)定上清液的pH 值。利用元素分析儀測(cè)定土壤中的總有機(jī)碳（total organic carbon, TOC）和總氮（total nitrogen, TN）含量。在過(guò)2 mm篩的土壤風(fēng)干樣中加入去離子水，水土體積質(zhì)量比為5∶1，連續(xù)振蕩4 h 后過(guò)濾，測(cè)定土壤溶解有機(jī)碳（dissolved organic carbon, DOC）含量[10]。用1 mol/L 中性乙酸銨溶液浸提土壤，采用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定土壤浸出液中的速效鉀（available potassium, AK）含量[11]?；凇锻寥擂r(nóng)化分析》[12]中的方法，分別測(cè)定土壤有效磷（available phosphorus,AP）、硝態(tài)氮（NO-3-N）和銨態(tài)氮（NH+4-N）含量。

1.3 土壤和稻茬樣品的DNA提取及宏基因組測(cè)序

DNA 提取和宏基因組測(cè)序由上海凌恩生物科技有限公司完成。具體方法為：利用土壤DNA提取試劑盒（美國(guó)Omega Bio-Tek公司）進(jìn)行土壤和稻茬樣品的DNA提取和純化，然后用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行定量。每個(gè)樣品取1 μg DNA，用Covaris S220超聲波破碎儀（美國(guó)Woburn公司）隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度約為450 bp 的片段，依次通過(guò)修復(fù)DNA 片段末端、添加多（poly）A尾、添加測(cè)序接頭、純化DNA片段、擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）片段等步驟來(lái)完成整個(gè)文庫(kù)制備。使用Qubit 3.0熒光定量?jī)x對(duì)文庫(kù)進(jìn)行初步定量，然后稀釋文庫(kù)至2 ng/μL，并用定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative PCR, qPCR）對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。所有樣品采用Illumina NovaSeq 2000系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序，讀長(zhǎng)模式為雙端配對(duì)150 bp。每個(gè)樣品的原始下機(jī)數(shù)據(jù)不小于20 Gb，并已上傳至國(guó)家生物信息中心組學(xué)原始數(shù)據(jù)歸檔庫(kù)（Genome Sequence Archive，https://bigd.big.ac.cn/gsa/），項(xiàng)目號(hào)為PRJCA015029。

1.4 致病菌、ARGs 和MGEs 注釋

從病原體-寄主互作數(shù)據(jù)庫(kù)[Pathogen-Host Interaction Database（PHI-base），http://www.phi-base.org]下載原核和真核致病菌物種基因數(shù)據(jù)，構(gòu)建本地致病菌基因參考數(shù)據(jù)庫(kù)（總共270種）；此外，本研究還下載了ARGs-OAP v2.0 數(shù)據(jù)集（https://smile.hku.hk/SARGs）和MGEs數(shù)據(jù)集（https://github.com/KatariinaParnanen/MobileGeneticElementDatabase），分別構(gòu)建本地ARGs 和MGEs參考數(shù)據(jù)庫(kù)。針對(duì)土壤樣品，先利用Trimmomatic軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，獲得高質(zhì)量讀長(zhǎng)（clean reads）[13]，然后用CLARK 軟件[14]（默認(rèn)參數(shù)）將高質(zhì)量讀長(zhǎng)比對(duì)到參考序列上，注釋得到致病菌類(lèi)群，最后用DIAMOND軟件對(duì)ARGs 類(lèi)型進(jìn)行注釋[e值＜1×10－10，一致性（identity）值＞0.8][15]，用BLAST軟件對(duì)MGEs進(jìn)行注釋?zhuān)╡值＜1×10－8）[16]。針對(duì)稻茬樣品，在對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)質(zhì)控后，還使用Bowtie2 軟件去除水稻寄主基因組序列，最終獲得有效微生物測(cè)序數(shù)據(jù)，其致病菌、ARGs和MGEs的注釋方法同土壤樣品。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有參數(shù)在秸稈焚燒前后樣品間的差異通過(guò)雙樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過(guò)R語(yǔ)言的picante包得到香農(nóng)（Shannon）指數(shù)，以表征致病菌群落的α多樣性?；诮M間群落的Bray-Curtis距離，采用主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis, PCoA）計(jì)算致病菌群落的β多樣性，并用置換多元方差分析（ADONIS）檢驗(yàn)其顯著性。篩選超過(guò)70%的樣品都存在的致病菌和ARGs組成信息，利用SparCC法構(gòu)建致病菌和ARGs 的共存網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)可視化通過(guò)Gephi v0.9.2 軟件完成。分別用R 語(yǔ)言的linkET 和ecodist包進(jìn)行曼特爾（Mantel）檢驗(yàn)和多元線性回歸分析，以確定環(huán)境參數(shù)對(duì)致病菌群落結(jié)構(gòu)和ARGs組成的影響程度。除了共存網(wǎng)絡(luò)，其他圖像的可視化均在R 4.1.3軟件中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈焚燒對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

土壤含水量、有機(jī)質(zhì)含量和微量元素含量是土壤重要理化特性之一，直接或間接地與土壤肥力/質(zhì)量相關(guān)。由圖1可知，秸稈焚燒后，稻田表土的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量及含水量有所下降，而有效磷、溶解有機(jī)碳、速效鉀、總氮和總有機(jī)碳含量上升，其中秸稈焚燒前后速效鉀含量變化顯著。

圖1 秸稈焚燒前后土壤理化性質(zhì)的變化Fig.1 Changes in soil physicochemical properties before and after straw burning

2.2 秸稈焚燒對(duì)土壤和稻茬中致病菌的影響

通過(guò)對(duì)浙江省寧波地區(qū)出現(xiàn)水稻白葉枯病的稻田土壤和稻茬樣品進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到土壤和稻茬中致病菌（包括原核和真核致病菌）的總相對(duì)豐度。如圖2 所示：土壤樣品中致病菌豐度占總微生物豐度的1%；然而，稻茬樣品中致病菌豐度占總微生物豐度的18%，遠(yuǎn)高于土壤樣品。其中，黃單胞菌屬（Xanthomonas）、泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）是稻茬內(nèi)主要的細(xì)菌致病菌屬，鐮刀菌屬（Fusarium）是稻茬內(nèi)主要的真菌致病菌屬。針對(duì)出現(xiàn)白葉枯病的稻茬樣品進(jìn)一步進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)黃單胞菌占據(jù)主導(dǎo)地位，且其相對(duì)豐度在秸稈焚燒后顯著降低（圖3）。

圖2 秸稈焚燒前后土壤（A、B）和稻茬（C、D）致病菌豐度占比及主要致病菌屬的相對(duì)豐度Fig.2 Proportions of pathogen abundances and the relative abundances of major pathogen genera in the soil (A, B) and the rice stubble (C, D) before and after straw burning

圖3 秸稈焚燒前后黃單胞菌的相對(duì)豐度變化Fig.3 Changes in relative abundances of Xanthomonas and X.oryzae before and after straw burning

稻田致病菌多樣性變化結(jié)果如圖4 所示。由圖4A、C可知，秸稈焚燒后土壤樣品中香農(nóng)指數(shù)有所下降，而稻茬樣品中香農(nóng)指數(shù)有所上升，但差異均不顯著（P＞0.05）。由圖4B可知，主坐標(biāo)1（PCoA 1）的貢獻(xiàn)率為74.88%，主坐標(biāo)2（PCoA 2）的貢獻(xiàn)率為15.01%，秸稈焚燒前后土壤中致病菌群落組成未發(fā)生明顯分離（R2=0.05，p=0.5）。由圖4D可知，主坐標(biāo)1（PCoA 1）的貢獻(xiàn)率為31.25%，主坐標(biāo)2（PCoA 2）的貢獻(xiàn)率為22.88%，秸稈焚燒前后稻茬內(nèi)致病菌群落組成存在差異但不顯著（R2=0.12，p=0.09）。

圖4 秸稈焚燒前后致病菌群落組成差異Fig.4 Differences of pathogen community compositions before and after straw burning

2.3 秸稈焚燒對(duì)ARGs 和MGEs 豐度的影響

圖5A～B、D～E 展示了土壤和稻茬內(nèi)ARGs 種類(lèi)和相對(duì)豐度的總體特征。ARGs在土壤和稻茬內(nèi)的分布情況與致病菌的分布特征相似，即稻茬樣品中ARGs的相對(duì)豐度高于土壤樣品。秸稈焚燒后土壤中ARGs 豐度（單位細(xì)胞內(nèi)ARGs 的拷貝數(shù)）為0.15，而稻茬內(nèi)為2.7，主要包括多藥、桿菌肽、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)-林可酰胺類(lèi)-鏈陽(yáng)性菌素類(lèi)等ARGs 類(lèi)型。同樣地，ARGs 的相對(duì)豐度（每百萬(wàn)序列中的讀長(zhǎng)數(shù)）也得到類(lèi)似的結(jié)果：秸稈焚燒后土壤中ARGs相對(duì)豐度為86，而稻茬內(nèi)為702。此外，MGEs 在稻茬內(nèi)富集，秸稈焚燒后土壤中MGEs相對(duì)豐度（每百萬(wàn)序列中的讀長(zhǎng)數(shù)）為34（圖5C），而稻茬內(nèi)為436（圖5F）。在秸稈焚燒前后，土壤和稻茬中的ARGs相對(duì)豐度變化不顯著，而秸稈焚燒后MGEs 的相對(duì)豐度在稻茬內(nèi)顯著降低。相關(guān)性分析結(jié)果（圖6）表明，致病菌相對(duì)豐度與ARGs、MGEs 相對(duì)豐度呈正相關(guān)，且在土壤中致病菌和ARGs 的相對(duì)豐度表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.65，p＜0.01），而在稻茬內(nèi)致病菌和MGEs的相對(duì)豐度表現(xiàn)出高度顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.95，p＜0.001）。

圖5 秸稈焚燒前后土壤（A～C）和稻茬（D～F）內(nèi)抗生素抗性基因總體特征及其相對(duì)豐度變化和移動(dòng)基因元件相對(duì)豐度變化Fig.5 Profiles of antibiotic resistance genes (ARGs), changes in relative abundances of ARGs and mobile genetic elements(MGEs) in the soil (A-C) and the rice stubble (D-F) before and after straw burning

圖6 秸稈焚燒前后ARGs、MGEs相對(duì)豐度與致病菌相對(duì)豐度的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis on the relative abundances of ARGs and MGEs with the relative abundances of pathogens before and after straw burning

2.4 秸稈焚燒對(duì)致病菌和ARGs 共存的影響

進(jìn)一步通過(guò)生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析秸稈焚燒對(duì)致病菌和ARGs 共存特征的影響，結(jié)果如圖7 所示。稻田土壤和稻茬內(nèi)高頻共存著上百種致病菌和ARGs（圖7A～B、D～E）。基于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和拓?fù)涮卣靼l(fā)現(xiàn)，秸稈焚燒前后土壤中致病菌和ARGs 的共存網(wǎng)絡(luò)分別具有1 012個(gè)和1 454個(gè)連接，而稻茬中分別具有4 155個(gè)和7 029個(gè)連接。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，秸稈焚燒前后稻茬內(nèi)致病菌和ARGs 的正相關(guān)（正向）連接數(shù)占比分別為41.8%和41.5%。這些結(jié)果表明，致病菌和ARGs 雖然存在緊密關(guān)聯(lián)，但主要以負(fù)相關(guān)為主，且秸稈焚燒減弱了致病菌與ARGs的正相關(guān)關(guān)系（如共生關(guān)系）。此外，秸稈焚燒后水稻黃單胞菌（X.oryzae）所在網(wǎng)絡(luò)模塊的拓?fù)涮卣饕舶l(fā)生了變化（正相關(guān)連接數(shù)占比減少），表明秸稈焚燒會(huì)對(duì)水稻白葉枯病病原菌和ARGs的共存網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與致病菌共存的主要類(lèi)型是耐多藥ARGs。通過(guò)曼特爾（Mantel）分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)土壤中致病菌和ARGs 共存影響較大的理化參數(shù)是含水量、pH值和總氮含量（圖7C），而對(duì)稻茬內(nèi)致病菌和ARGs共存影響較大的是速效鉀和有效磷含量（圖7F）。

圖7 秸稈焚燒前后土壤（A～C）和稻茬（D～F）內(nèi)致病菌和ARGs共存分析及其共存網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髋c土壤理化因子的相關(guān)性分析Fig.7 Coexistence analysis of pathogens-ARGs and correlation analysis between co-occurrence network topology features and environmental factors in the soil (A-C) and the rice stubble (D-F) before and after straw burning

2.5 稻田生物復(fù)合污染的重要驅(qū)動(dòng)因子

曼特爾（Mantel）檢驗(yàn)結(jié)果揭示了土壤理化因子與致病菌群落結(jié)構(gòu)和ARGs 組成的關(guān)系（圖8）。在土壤中，土壤理化因子對(duì)致病菌群落結(jié)構(gòu)變化的影響較小，而對(duì)ARGs組成的影響較大。其中，含水量（r=0.642，p＜0.01）、pH 值（r=0.582，p＜0.05）、總有機(jī)碳含量（r=0.325，p＜0.05）、總氮含量（r=0.570，p＜0.01）和有效磷含量（r=0.311，p＜0.05）與ARGs組成密切相關(guān)。在稻茬中，溶解有機(jī)碳含量（r=0.201，p＜0.05）顯著影響致病菌群落結(jié)構(gòu)，且溶解有機(jī)碳含量（r=0.275，p＜0.05）和速效鉀含量（r=0.312，p＜0.05）與ARGs 組成密切相關(guān)。多元線性回歸模型分析結(jié)果總體上與曼特爾檢驗(yàn)結(jié)果一致，土壤理化因子對(duì)土壤中致病菌群落結(jié)構(gòu)和ARGs組成具有顯著貢獻(xiàn)（r2=0.451，p=0.006；r2=0.527，p=0.002），而對(duì)稻茬內(nèi)致病菌群落結(jié)構(gòu)和ARGs組成的影響不顯著（r2=0.090，p=0.61；r2=0.189，p=0.14）。

圖8 土壤和稻茬內(nèi)致病菌群落結(jié)構(gòu)（A）和ARGs組成（B）與土壤理化因子的相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis of pathogen community structures (A) and ARG subtypes (B) in the soil and rice stubble with the soil physicochemical factors

3 討論

從2010年全面禁止焚燒秸稈以來(lái)，秸稈還田成為秸稈資源的主要利用模式。盡管這種模式對(duì)環(huán)境保護(hù)起到了重要作用，但不利于作物病害的控制，因?yàn)榉贌斩捘芙档椭虏【谔镩g的接種量，使農(nóng)作物保持低感染率[17]。近年來(lái)，浙江省寧波地區(qū)水稻種植區(qū)出現(xiàn)連片的白葉枯病，且不斷擴(kuò)散蔓延，呈逐年加重態(tài)勢(shì)[4]。因此，亟須就不同秸稈管理方式對(duì)作物的影響進(jìn)行重新評(píng)估。本研究對(duì)比了秸稈焚燒前后稻田致病菌、ARGs 和MGEs 的變化情況，結(jié)果表明，秸稈焚燒對(duì)稻茬內(nèi)致病菌群落結(jié)構(gòu)、ARGs組成及其生態(tài)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生了重要影響，這為客觀評(píng)價(jià)農(nóng)田秸稈焚燒提供了一定的參考。

土壤是多種致病菌的儲(chǔ)存庫(kù)。盡管致病菌在絕大部分時(shí)期具有較低的豐度和活性，但當(dāng)其在土壤中的累積量達(dá)到植物病害發(fā)生的條件時(shí)，則能實(shí)現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)。例如，一旦黃單胞菌成功侵染水稻，該菌種便會(huì)在秸稈內(nèi)大量富集[4]。這也提示收割自白葉枯病暴發(fā)的秸稈需要經(jīng)過(guò)有效的殺菌處理才能進(jìn)行還田利用，否則粗放式的秸稈還田勢(shì)必加劇下茬作物的染病風(fēng)險(xiǎn)。盡管秸稈焚燒能夠顯著降低稻田中黃單胞菌的豐度，但其遏制下茬作物發(fā)病的程度還需要長(zhǎng)期定位試驗(yàn)來(lái)加以驗(yàn)證。由于焚燒效果具有不可預(yù)測(cè)性，焚燒處理可能以休眠形式降低了土壤中病原菌的接種量，然而并未完全根除[18]。同時(shí)，焚燒效果取決于焚燒強(qiáng)度、秸稈數(shù)量和質(zhì)量以及焚燒持續(xù)時(shí)間[19-20]。除了黃單胞菌，菠蘿泛菌（Pantoea ananatis）也能引起類(lèi)似白葉枯病癥狀的水稻病害[21-22]。在本研究中，稻茬內(nèi)菠蘿泛菌的豐度僅次于黃單胞菌，表明近些年國(guó)內(nèi)暴發(fā)的白葉枯病可能同時(shí)受到黃單胞菌和菠蘿泛菌的侵染，從而導(dǎo)致傳統(tǒng)防治藥劑的防控效果較差。因此，開(kāi)展水稻白葉枯病病原菌的鑒定和防治藥劑的篩選等技術(shù)研究刻不容緩。

有效防治植物病害還與致病菌體內(nèi)是否攜帶抗生素抗性基因（ARGs）密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在水稻白葉枯病暴發(fā)時(shí)，稻茬內(nèi)ARGs 相對(duì)豐度較低，而當(dāng)秸稈焚燒后，稻茬內(nèi)ARGs相對(duì)豐度有所升高，進(jìn)而提升了致病菌和ARGs 共存網(wǎng)絡(luò)密度。這與其他秸稈處理方式下ARGs的相對(duì)豐度變化有相似之處。魏華煒[23]指出，在施用秸稈處理的肥料后，小蔥地上部的ARGs豐度上升，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌是促進(jìn)植物體內(nèi)ARGs 傳播的主要驅(qū)動(dòng)因子。有研究表明，秸稈還田能夠?yàn)橥羵髦参镏虏【纳L(zhǎng)、繁殖和積累提供適宜的環(huán)境[24]，例如，小麥秸稈還田會(huì)提高下茬小麥赤霉病病穗率和病情指數(shù)，水稻秸稈還田會(huì)提高下茬水稻稻瘟病、鞘腐病和紋枯病的病情指數(shù)，同時(shí)顯著影響作物體內(nèi)的ARGs 豐度[25]。盡管本研究中稻茬內(nèi)ARGs 與致病菌寄主共存關(guān)系在秸稈焚燒后有所加強(qiáng)，但致病菌和ARGs 共存網(wǎng)絡(luò)的正相關(guān)連接數(shù)占比有所降低，并且與致病菌相對(duì)豐度呈正相關(guān)的移動(dòng)基因元件（MGEs）相對(duì)豐度顯著下降，表明秸稈焚燒將減小基因水平轉(zhuǎn)移的性能，有可能遏制耐藥致病菌的形成，并降低通過(guò)致病菌傳播抗性基因的風(fēng)險(xiǎn)。為了探究土壤和稻茬中可能形成的致病菌和ARGs的生物復(fù)合污染風(fēng)險(xiǎn)，需要分離鑒定潛在的耐藥致病菌，進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)分析的結(jié)果。

土壤理化性質(zhì)（含水量、pH 值、溫度、有機(jī)質(zhì)含量等）可以顯著影響土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，從而誘導(dǎo)ARGs的傳播和富集[26]。在本研究中，相關(guān)性分析結(jié)果表明，土壤中致病菌的多樣性與土壤理化性質(zhì)關(guān)系密切。秸稈焚燒對(duì)環(huán)境因子的改變?cè)谝欢ǔ潭壬向?qū)動(dòng)了土壤中致病菌群落的生態(tài)演替，降低了黃單胞菌豐度，從而降低下茬病菌的侵染率。秸稈焚燒后土壤中致病菌的多樣性有所下降，與李明等[9]的研究結(jié)果一致。值得注意的是，多個(gè)理化參數(shù)（含水量、pH值及總有機(jī)碳、溶解有機(jī)碳、速效鉀、總氮、有效磷含量）對(duì)ARGs組成具有顯著影響，與已有的相關(guān)研究結(jié)果一致。例如，tet基因的絕對(duì)豐度與土壤有機(jī)質(zhì)含量具有顯著相關(guān)性[27]；土壤pH值和含水量通過(guò)影響?zhàn)B分有效性和微生物活性干擾ARGs 的傳播、富集、去除和持久性[28-29]。這也給未來(lái)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展提出了新的挑戰(zhàn)：在農(nóng)業(yè)實(shí)踐中（如秸稈還田、有機(jī)肥施用等），不僅要防控病害的暴發(fā)，而且要密切關(guān)注抗性基因與致病菌互作的危害，避免耐藥致病菌的形成和富集。

4 結(jié)論

本研究采用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)浙江省寧波地區(qū)白葉枯病暴發(fā)稻田的致病菌群落、ARGs和MGEs在秸稈焚燒前后的組成、豐度、生態(tài)網(wǎng)絡(luò)特征變化進(jìn)行了研究。在染病稻田中稻茬內(nèi)致病菌相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于土壤，其中黃單胞菌、菠蘿泛菌為優(yōu)勢(shì)菌種。秸稈焚燒導(dǎo)致稻茬內(nèi)黃單胞菌的相對(duì)豐度急劇降低。在秸稈焚燒后，盡管土壤和稻茬內(nèi)的ARGs相對(duì)豐度有所提升，但致病菌和ARGs的正相關(guān)共存關(guān)系占比減小，而且MGEs 相對(duì)豐度顯著降低，從而可能降低通過(guò)致病菌傳播抗性基因的風(fēng)險(xiǎn)。土壤中ARGs組成變化與含水量、pH值及總有機(jī)碳、總氮、有效磷含量相關(guān)，而稻茬內(nèi)的致病菌群落結(jié)構(gòu)和ARGs組成變化與溶解有機(jī)碳含量密切相關(guān)。本研究揭示了秸稈焚燒對(duì)白葉枯病病原菌黃單胞菌的抑制作用，為進(jìn)一步研究不同秸稈管理模式對(duì)稻田生物復(fù)合污染的影響提供了參考，對(duì)在實(shí)踐中加強(qiáng)對(duì)水稻白葉枯病的防控具有指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果也提示，未來(lái)針對(duì)作物病原菌的研究不僅要關(guān)注其組成和豐度的變化，而且要進(jìn)一步聚焦于菌種的絕對(duì)豐度、活性及耐藥性的變化。