玫瑰茄水提物抗氧化及抑菌活性研究

歐小勇，潘文章，楊通蓮，歐工華

（貴州省從江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 從江 557400）

2020 年，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194 號(hào)文件指出，為維護(hù)我國(guó)動(dòng)物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，決定停止生產(chǎn)、進(jìn)口、經(jīng)營(yíng)、使用部分藥物飼料添加劑。隨著該公告的頒布，多種促生長(zhǎng)的藥物添加劑及抗生素不得在飼料中使用。因此，尋找富含生物活性物質(zhì)、毒副作用小且殘留性低的植物提取物添加劑迫在眉睫[1-2]。玫瑰茄（Hibiscus sabdariffaL.）屬錦葵科木槿屬藥食同源類(lèi)植物，其花萼色彩鮮艷、色質(zhì)好，富含有機(jī)酸、花色苷、多酚、多糖及黃酮等活性成分，具有抗氧化、抗癌及降血糖等功效[3-5]，廣泛用于食品、化妝品等領(lǐng)域[6]。除此之外，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究還發(fā)現(xiàn)，玫瑰茄還具有防治心血管疾病和殺菌驅(qū)蟲(chóng)等功效[4-5]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)玫瑰茄的研究集中在其醇提花色苷的抗氧化和抗腫瘤作用等方面。劉小琳等[5]發(fā)現(xiàn)，玫瑰茄醇提花色苷具有較強(qiáng)的抗氧化能力，清除羥自由基的IC50值為169.1 μg/mL，優(yōu)于VC 的448.5 μg/mL。Malacrida 等[7]和Lin 等[8]研究表明，玫瑰茄花色苷對(duì)乳腺癌和胃癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用。而關(guān)于玫瑰茄水提物的抗氧化及抑菌活性鮮有報(bào)到。基于此，筆者以玫瑰茄水提物為研究對(duì)象，探索玫瑰茄作為飼用抗氧化劑及抑菌防腐劑時(shí)的綜合利用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的玫瑰茄購(gòu)買(mǎi)于云南省武定縣，生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為Q/LAKX0009S，其他試劑還有1,1–二苯基–2–三硝基苯肼（DPPH，梯希愛(ài)上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司），F(xiàn)RAP、ABTS 總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），抗壞血酸（VC，阿拉丁公司），鹽酸金霉素（中國(guó)食品藥品檢定研究院），胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉等（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。供試的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及腸炎沙門(mén)氏菌均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。主要儀器設(shè)備有全波段酶標(biāo)儀（帝肯InfiniteM 200PRO 型）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海舜宇恒平UV 2400 型）。

1.2 玫瑰茄水提物（HWE）的制備

將玫瑰茄花萼置于粉碎機(jī)中粉碎，以料液比1 ∶25 的配比將玫瑰茄花萼粉末加入蒸餾水中進(jìn)行超聲提取，提取液真空抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至黏稠狀，移入低溫真空冷凍干燥箱，干燥后碾壓成粉末狀，裝入密封袋于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

參考楊麗華等[9]的方法，準(zhǔn)確配制1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 和0.1 mg/mL 的HWE 乙 醇 溶 液 及2.0×10-4mol/L 的DPPH 乙醇溶液。吸取DPPH 乙醇溶液3 mL，加入無(wú)水乙醇3 mL，標(biāo)記為A0；分別取不同濃度的HWE 乙醇溶液3 mL，加入DPPH 溶液3 mL，標(biāo)記為A1；分別取不同濃度的HWE 乙醇溶液3 mL，加入無(wú)水乙醇3 mL，標(biāo)記為A2；所有溶液避光反應(yīng)30 min，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定517 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次取其平均值，以VC 為對(duì)照。用公式（1）計(jì)算HWE 的DPPH 自由基清除率（Y）。

1.4 FRAP 及ABTS 總抗氧化能力測(cè)定

準(zhǔn)確配制1、2、4、6、8 和10 mg/mL 的HWE乙醇溶液。采用FRAP 及ABTS 總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒測(cè)定HWE 乙醇溶液的FRAP 及ABTS 總抗氧化能力，具體操作參照說(shuō)明書(shū)及文獻(xiàn)[10-12]的方法進(jìn)行。圖1 為FRAP 及ABTS 總抗氧化能力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系均表現(xiàn)良好。

圖1 FRAP（左）及ABTS（右）總抗氧化能力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1.5 抑菌活性測(cè)定

1.5.1 LB 液體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基的配制 參考羅飛亞[13]的方法配制LB 液體培養(yǎng)基和LB 固體培養(yǎng)基。LB 液體培養(yǎng)基中各成分比例為酵母粉（g）∶胰蛋白胨（g）∶氯化鈉（g）∶無(wú)菌水（mL）＝1 ∶2 ∶2 ∶200，LB 固體培養(yǎng)基中各成分比例為酵母粉（g）∶胰蛋白胨（g）∶氯化鈉（g）∶瓊脂粉（g）∶無(wú)菌水（mL）＝1 ∶2 ∶2 ∶3 ∶250，培養(yǎng)基配好后用封口膜密封，于立體式高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20 min，待冷卻到室溫后，放于4℃冰箱備用。

1.5.2 菌種的復(fù)蘇與純化 參照菌種使用說(shuō)明書(shū)及何濤[14]的方法，在超凈工作臺(tái)里取出新購(gòu)菌種，分別接種到裝有適量LB 液體培養(yǎng)基的離心管中，置于臺(tái)式恒溫振蕩器中37℃培養(yǎng)12 h；然后在超凈工作臺(tái)中將培養(yǎng)液接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，一般至少傳3 代后再用接種環(huán)挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h 待用；純化后的菌液用之后60%甘油制成甘油菌，具體比例為0.8 mL 菌液+0.4 mL60%甘油，置于－80℃冰箱冷藏保存。

1.5.3 紙片抑菌法活性評(píng)價(jià) 參照文獻(xiàn)[15-16]的方法，將HWE 用20%DMSO 水溶液溶解并過(guò)0.22 μm 濾膜，然后將HWE 濃度依次稀釋成200、100、50 和25 mg/mL，以相同溶劑配制10 mg/mL 的鹽酸金霉素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，在配制好的藥液中加入無(wú)菌紙片（d=6 mm）浸泡12 h。吸取200 μL 菌懸液（濃度為1×105～2×105CFU/mL）于培養(yǎng)基的表面，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布；將已浸泡過(guò)藥劑并瀝干的無(wú)菌濾紙片用無(wú)菌鑷子夾取貼在固體平板上，每個(gè)培養(yǎng)皿貼6 片，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中下培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法[17]測(cè)定抑菌圈大小，取3 組平均值。

1.5.4 MIC 與MBC 評(píng)價(jià) 參照文獻(xiàn)[18-19]中的二倍稀釋法，用20%DMSO 水溶液將HWE 配制成100 mg/mL 的藥液，過(guò)0.22 μm 濾膜，用LB 液體培養(yǎng)基稀釋至50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 和0.78 mg/mL，將各濃度藥液取100 μL 依次加入96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板的前8 個(gè)孔中，然后每孔均加入100 μL 已經(jīng)稀釋好的菌液，第9 孔加100 μL 培養(yǎng)基和100 μL菌液，第10 孔加200 μL 培養(yǎng)基，設(shè)3 個(gè)重復(fù)。將孔板混勻蓋好，放37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h 后觀察孔內(nèi)無(wú)彌散狀渾濁或孔底無(wú)沉淀的最低藥物濃度即為該測(cè)試菌株對(duì)HWE 的MIC。取無(wú)菌生長(zhǎng)孔的液體培養(yǎng)物100 μL 涂布于LB 瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，以無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MBC。同時(shí)設(shè)立以母液為10 mg/mL 的鹽酸金霉素作為陽(yáng)性藥物代替HWE 按照上述步驟同步測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 HWE 的抗氧化活性

2.1.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 由圖2 可知，當(dāng)2 種溶液濃度為0.1～0.6 mg/mL 時(shí)，VC 的DPPH自由基清除率大于HWE，當(dāng)樣品溶液濃度大于0.6 mg/mL 時(shí)，HWE 的DPPH 自由基清除率明顯高于VC，當(dāng)HWE 的濃度達(dá)到0.8 mg/mL 時(shí)，其DPPH清除率達(dá)到最高，為98%，而VC 在1 mg/mL 時(shí)DPPH 自由基清除率最高，為88.69%。

圖2 HWE 及陽(yáng)性對(duì)照藥VC 的DPPH 自由基清除率

2.1.2 ABTS 及FRAP 抗 氧 化 能 力 測(cè) 定 圖3 為HWE 和VC 分別采用ABTS 法和FRAP 法測(cè)定的總抗氧化能力結(jié)果。由ABTS 法結(jié)果可以看出，HWE和VC 的ABTS 總抗氧化能力值分別為5.44 和6.51 mmol/g，VC 的ABTS 值高于HWE；由FRAP 法結(jié)果可以看出，HWE 和VC 的FRAP 總抗氧化能力值分別為0.79 和1.47 mmol/g，VC 的FRAP 值高于HWE?？傮w來(lái)看，VC 的總抗氧化能力強(qiáng)于HWE。

圖3 HWE 和VC 的FRAP 及ABTS 總抗氧化能力

2.2 HWE 的抑菌活性

2.2.1 紙片抑菌法活性測(cè)定 通過(guò)抑菌圈直徑的大小可將菌種對(duì)藥液的敏感程度分為高度敏感（＞20 mm）、中度敏感（14～20 mm）、低度敏感 （8～14 mm）和不敏感（＜8 mm）[20]。由表1 可知，當(dāng)HWE 濃度為25 mg/mL 時(shí)，對(duì)4 種菌均表現(xiàn)為不敏感；當(dāng)HWE的濃度為50 mg/mL 時(shí)，對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出低敏感；當(dāng)HWE 的濃度為100 mg/mL時(shí)，對(duì)4 種菌均表現(xiàn)出低敏感；當(dāng)HWE 濃度為200 mg/mL 時(shí)，對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色芽孢桿菌表現(xiàn)出中度敏感?？傮w來(lái)看，HWE 對(duì)4 種菌的敏感程度排序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞腸炎沙氏桿菌＞大腸桿菌，較高濃度的HWE 表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果，但效果均差于鹽酸金霉素。

表1 HWE 對(duì)4 種試驗(yàn)菌的抑菌圈直徑

2.2.2 MIC 與MBC 活性測(cè)定 通過(guò)二倍稀釋法可以得出HWE 對(duì)枯草芽孢桿菌、腸炎沙氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC 分別為12.5、6.25、3.12、12.5 mg/mL，MBC 值 分 別 為25、25、12.5、25 mg/mL。同時(shí)可以得出，鹽酸金霉素對(duì)枯草芽孢桿菌、腸炎沙氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC 值均小于0.01 mg/mL，MBC 的值分別為0.04、0.04、0.04、0.02 mg/mL。

3 結(jié)論與討論

玫瑰茄水提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化能力與VC 相當(dāng)，對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑菌活性，雖然抑菌效果不及鹽酸金霉素，但其來(lái)源于天然植物，原材料豐富，且具有廉價(jià)、綠色、健康等優(yōu)勢(shì)，可將其作為飼用抗氧化劑或抑菌防霉劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。

試驗(yàn)所采用的DPPH 法與黃瓊等[21]的研究一致，且結(jié)果也相似，即陽(yáng)性對(duì)照VC 的DPPH 自由基清除率均低于90%，且隨濃度的增加清除率無(wú)明顯增加；而HWE 對(duì)DPPH 的自由基清除率當(dāng)其濃度為0.8 mg/mL 時(shí)達(dá)到最高值98%。試驗(yàn)采用的FRAP 法和ABTS 法與王智勇等[22]和Zhang 等[11]的方法基本一致，其中2 種方法測(cè)定HWE 均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，這也與前人的研究基本一致。例如鄭大恒等[23]發(fā)現(xiàn)玫瑰茄粗多糖對(duì)DPPH、羥基、超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的清除作用，劉雨瀟等[24]發(fā)現(xiàn)玫瑰茄多酚含量與抗氧化能力呈量效關(guān)系。抑菌試驗(yàn)中所采用的微量稀釋法與裴滬榮等[25]和邱亞鐵等[26]的研究一致，樣品均采用DMSO 助溶，其結(jié)果顯示，HWE 在抑制微生物生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出一定活性，抑菌能力與濃度呈較明顯的量效關(guān)系，其中HWE 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最優(yōu)，當(dāng)其濃度為200 mg/mL 時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)18.83±0.58 mm；而在MIC 及MBC 指標(biāo)測(cè)定中，HWE 對(duì)大腸桿菌的抑制效果表現(xiàn)最好，其MIC 和MBC 值分別為3.12和12.5 mg/mL。李夢(mèng)淼等[27]測(cè)定了玫瑰茄醇提物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出較好的抑菌效果，并通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定出其主要抑菌活性物質(zhì)為黃酮類(lèi)化合物。Borrás–linares 等[28]的研究結(jié)果表明，玫瑰茄提取物對(duì)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抑制作用更為顯著。

隨著“全面替抗”時(shí)代的到來(lái)，尋找天然無(wú)公害替代抗生素的添加物成為必然趨勢(shì)，植物提取物型飼料添加劑是極佳的選擇，也是今后飼料添加劑的主導(dǎo)方向。Saxena 等[29]證明了玫瑰茄提取物對(duì)不同階段絲蟲(chóng)（幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)）均具有殺滅作用，在250 mg/L 濃度下能體外殺死微絲幼，并認(rèn)為將玫瑰茄開(kāi)發(fā)成治療絲蟲(chóng)病的有效藥物具有良好的前景。玫瑰茄也被證明具有開(kāi)發(fā)成天然抑菌劑的應(yīng)用前景[27-30]。該研究結(jié)果表明，玫瑰茄具備開(kāi)發(fā)成抗氧化劑和抑菌劑的潛力，可作為抗氧化劑及抑菌防霉劑添加到飼料中，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用木槿屬植物提供了新思路。左苗[31]在飼料中添加一定量的玫瑰茄提取物，發(fā)現(xiàn)肉雞及鯰魚(yú)的生長(zhǎng)性能均能得到一定的改善，這表明玫瑰茄在飼料添加劑上的開(kāi)發(fā)與利用具有一定的可行性。