郭建軍，王 通，吳慶華，曾 靜，袁 林

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.臨川區(qū)連城鄉(xiāng)便民服務(wù)中心，江西撫州 344117）

纖維素是由D-葡萄糖基通過 -1,4-苷鍵聯(lián)結(jié)而成的線狀高分子量碳水化合物[1]，廣泛分布于自然界，如林木[2]、種植業(yè)廢棄物[3]和食草動(dòng)物糞便[4]等都含有大量纖維素，是一種易獲取且廉價(jià)的可再生資源。將天然的纖維素物質(zhì)降解為葡萄糖，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為生物燃料以及其他高附加值產(chǎn)品[5-6]，對于人類的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前，自然界含纖維素材料的利用大多通過物理或化學(xué)手段進(jìn)行預(yù)處理使其結(jié)構(gòu)和性能發(fā)生改變[7-9]，如酸或堿浸泡、蒸汽爆破等，但這些處理方式效率較低、能耗較大、污染較嚴(yán)重[10]；而若能使用纖維素酶進(jìn)行降解[11]，既環(huán)保又高效，但是成本較高，耗時(shí)較長[12]。

纖維素酶是能將纖維素水解為葡萄糖的復(fù)合酶的總稱[13]，包括多種內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和 -葡萄糖苷酶[14]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料、釀造[15]、果汁與蔬菜汁加工[16]、糧食加工、中草藥有效成分提取[17]、紡織[18]、洗滌劑和造紙等生產(chǎn)領(lǐng)域。由于天然纖維素分子鏈內(nèi)或鏈間存在大量氫鍵，導(dǎo)致其形成了髙結(jié)晶度的結(jié)構(gòu)[19]，從而具有較高的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性[20]，難以被分解利用。天然的纖維素酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶活性低[21]、酶系組分不完全是纖維素酶不能被廣泛利用的主要原因[22]。因此，發(fā)酵生產(chǎn)高活性的纖維素酶具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前研究較多的產(chǎn)纖維素酶微生物多是真菌，真菌產(chǎn)生的纖維素酶具有產(chǎn)酶量大、酶活性高和酶系組成豐富合理等優(yōu)點(diǎn)[23]，同時(shí)分泌的胞外酶易于分離提純和工業(yè)生產(chǎn)放大[24]。筆者以課題組實(shí)驗(yàn)室篩選保存的鐮刀菌（Fusariumsp.）YL2[25]為研究對象，設(shè)計(jì)Plackett-Burman 試驗(yàn)，擬篩選出影響纖維素酶發(fā)酵的主要影響因子，結(jié)合響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化響應(yīng)因子，從而確定最佳的纖維素酶液態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌 種 鐮刀菌（Fusariumsp.）YL2，保藏號為CCTCCM 2014551，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、硫酸鎂0.05 g/L、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）8.0 g/L，自然pH 值，121℃滅菌30 min。（2）初始發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：微晶纖維素10.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、硫酸銨 5.0 g/L、磷酸二氫鉀2.0 g/L、硫酸鎂200 mg/L、硫酸錳50 mg/L、硫酸鋅100 mg/L、硫酸銅50 mg/L，自然pH 值，121℃滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 在無菌操作條件下將實(shí)驗(yàn)室保藏的鐮刀菌菌株YL2 小心接至PDA 培養(yǎng)基斜面上，30℃培養(yǎng)48 h 進(jìn)行活化；挑取約1 cm2大小的活化后菌種塊于裝有100 mL 液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)速170 r/min，30℃培養(yǎng)30 h，作為種子液；按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每組做3 個(gè)平行樣。

1.2.2 粗酶液的制備與纖維素酶活力測定 （1）粗酶液的制備。將發(fā)酵液在6 000 r/min 條件下離心8 min，取上清液作為粗酶液。（2）羧甲基纖維素酶（CMC）活力測定。取1 支空白管加入一定稀釋比例的粗酶液0.50 mL，沸水浴滅活10 min 作為空白對照；另取3 支樣品管分別加入粗酶液0.50 mL，再加入2.00 mL 經(jīng)50℃預(yù)熱10 min 的10 g/L 的CMC-Na溶液（用pH 值 4.8 的0.05 mol/L 的檸檬酸緩沖液配制），混勻后置于50℃水浴中反應(yīng)15 min，迅速向各管加入DNS 試劑3.0 mL，沸水浴10 min，冷卻后定容至15 mL 搖勻，以空白管（對照液）調(diào)零，測OD540值。（3）微晶纖維素酶（AVI）活力測定。取1 支空白管加入一定稀釋比例的粗酶液0.50 mL，沸水浴滅活10 min 作為空白對照；另取3 支樣品管分別加入粗酶液0.50 mL，加入2.00 mL 經(jīng)50℃預(yù)熱10 min 的 10 g/L 的微晶纖維素懸液（160 r/min 濕磨48 h），混勻后置于50℃水浴中反應(yīng)15 min，迅速向各管加入DNS 試劑3.0 mL，沸水浴10 min，冷卻后定容至15 mL 搖勻，以空白管（對照液）調(diào)零，測OD540值。以上酶活均減去發(fā)酵液中的還原糖后計(jì)算酶活力。酶活力單位定義為：在50℃，pH 值4.8 的條件下，以1 mL 酶液在1 min 內(nèi)分解底物生成1 μg葡萄糖的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（1 IU/mL）。

纖維素酶活力=[葡萄糖含量（mg）×稀釋倍數(shù)]/[反應(yīng)液中酶液用量（mL）×反應(yīng)時(shí)間（min）]

1.2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)工藝 （1）單因素試驗(yàn)。培養(yǎng)基組分的優(yōu)化：分別選取碳源、氮源、緩沖鹽、金屬鹽、表面活性劑進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究各因素對發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響；培養(yǎng)條件的優(yōu)化，在已確定培養(yǎng)組分下培養(yǎng)36 h 后測定酶活力，依次考察培養(yǎng)基起始pH 值、培養(yǎng)溫度、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、接種量和培養(yǎng)時(shí)間對菌株生長狀況及產(chǎn)酶的影響。（2）Plackett-Burman 試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以微晶纖維素酶（AVI）作為響應(yīng)值，篩選出主效應(yīng)因子。每個(gè)因素選2 個(gè)水平，中心點(diǎn)試驗(yàn)3 次，共16 組試驗(yàn)。（3）最陡爬坡試驗(yàn)。根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)分析篩選出影響微晶纖維素酶活的顯著因子，根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化的步長和上升路徑，以酶活力為響應(yīng)值設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，找出顯著因素最大響應(yīng)區(qū)域，確定響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。（4）響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果，采用Box-Behnken 法對鐮刀菌YL2 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，包括設(shè)計(jì)3 因素5 水平共17 個(gè)析因試驗(yàn)和3 個(gè)中心試驗(yàn)，共20 組試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行3 次重復(fù)。獲得菌株產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)組分與條件，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間曲線驗(yàn)證優(yōu)化效果，并確定產(chǎn)酶發(fā)酵周期。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和繪圖；PB 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、中心組合試驗(yàn)均運(yùn)用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響 采用稻草粉、麩皮、微晶纖維素、糊精、葡萄糖、糖蜜和蔗糖等為碳源進(jìn)行培養(yǎng)，由圖1A 可知，不同碳源對鐮刀菌YL2 產(chǎn)酶影響的差異較大，微晶纖維素、麩皮和稻草粉對產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，采用稻草粉作為碳源時(shí)效果最好，CMC 活力為35.27 IU/mL，AVI 活力為2.46 IU/mL。由圖1B 可知，隨著稻草粉添加量的不斷增大，酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)?shù)静莘厶砑恿繛?5 g/L 時(shí)，CMC 和AVI 活力達(dá)到峰值，分別為36.87 和2.83 IU/mL。因此，初步確定稻草粉的添加量為25 g/L。

圖1 不同碳源對鐮刀菌YL2 產(chǎn)纖維素酶的影響

2.1.2 氮源對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響 不同微生物對氮源的需求也有較大的差異。由圖2A 可知，有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更有利于菌體的生長。其中，有機(jī)氮源對產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，采用豆餅粉作為氮源時(shí)效果最好，CMC 活力為37.03 IU/mL，AVI活力為2.58 IU/mL。由圖2B 可知，當(dāng)豆餅粉添加量為25 g/L 時(shí)，CMC 和AVI 活力均達(dá)到峰值，分別為38.71 和2.87 IU/mL。因此，選擇豆餅粉添加量為25 g/L 比較適合。

圖2 不同氮源對鐮刀菌YL2 產(chǎn)纖維素酶的影響

2.1.3 不同鹽對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響 以初始發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的緩沖鹽（磷酸二氫鉀2.0 g/L）為基礎(chǔ)，做不同的替代。由圖3A 可知，檸檬酸氫二銨和乙酸銨對產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，采用檸檬酸氫二銨作為緩沖鹽時(shí)產(chǎn)酶效果最好，CMC 活力為39.26 IU/mL，AVI 活力為2.74 IU/mL。從圖3B 可知，添加不同金屬鹽（1.0 g/L）對菌株產(chǎn)酶有正影響：Mg2+＞Zn2+＞Mn2+＞Cu2+＞Fe2+，而Ca2+和Al3+對菌株產(chǎn)酶存在負(fù)效應(yīng)。最佳產(chǎn)酶金屬鹽為MgSO4，發(fā)酵液CMC 活力為40.51 IU/mL，AVI 活力為3.02 IU/mL。

圖3 不同鹽對鐮刀菌YL2 產(chǎn)纖維素酶的影響

2.1.4 表面活性劑對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響 由圖4A 可知，當(dāng)表面活性劑為蔗糖酯時(shí)，菌體發(fā)酵產(chǎn)酶效果最顯著。表面活性劑添加量控制在合適范圍內(nèi)，將有利于提高產(chǎn)酶能力；當(dāng)添加量為1.2 g/L 時(shí)酶活力達(dá)到峰值，CMC 活力為42.46 IU/mL，AVI 活力為3.26 IU/mL。因此，后續(xù)試驗(yàn)采用1.2 g/L 的蔗糖酯作表面活性劑。

圖4 表面活性劑對鐮刀菌YL2 產(chǎn)纖維素酶的影響

2.1.5 發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響 根據(jù)前面優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分，研究初始pH 值對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響，結(jié)果如圖5A 所示，起始pH 值為6.0 時(shí)產(chǎn)酶效果最好，CMC 和AVI 活力最高，分別為43.55 和3.34 IU/mL；當(dāng)初始pH 值超過6.0 時(shí)酶活降低。研究培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)（圖5B），當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，酶活力最高，CMC 和AVI 活力分別為44.78 和3.44 IU/mL，因此初步確定目的菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)溫度為30℃。如圖5C 所示，在500 mL 三角瓶裝100 mL 培養(yǎng)基時(shí)能獲得較佳的產(chǎn)酶效果，CMC 活力為45.31 IU/mL，AVI活力為3.48 IU/mL。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為225 r/min 時(shí)，酶活力均達(dá)到峰值，CMC 和AVI 活力分別為46.75 和3.59 IU/mL（圖5D）。考察接種量對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響發(fā)現(xiàn)（圖5E），當(dāng)接種量為3%（V/V）時(shí)，酶活力均達(dá)到峰值，CMC 和AVI 活力分別為46.97和3.61 IU/mL。由圖5F 可知，培養(yǎng)時(shí)間為6 d 時(shí)，酶活力達(dá)到頂峰，CMC 和AVI 活力分別為47.65 和3.66 IU/mL，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過7 d 時(shí)，酶活力呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。

圖5 不同培養(yǎng)條件對鐮刀菌YL2 產(chǎn)纖維素酶的影響

2.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取10 個(gè)對菌株發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)纖維素酶影響較大的因素，通過Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行N=12 的Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素選高（1）、低（-1）2 個(gè)水平，每組試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，考察它們對產(chǎn)纖維素酶的影響，篩選出顯著性影響因子。Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和結(jié)果如表1 所示。

表1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

利用Design Expert 8.0 軟件對表1 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2 所示，主效應(yīng)“Prob ＞F”等于0.003 2 ＜0.05，表明該模型與試驗(yàn)值擬合良好。碳源（稻草粉）、表面活性劑（蔗糖酯）和初始pH 值 3 個(gè)因子滿足“Prob ＞F”小于0.05，說明它們對產(chǎn)纖維素酶酶活有顯著影響，可考慮作為主要因素進(jìn)一步做響應(yīng)面試驗(yàn)；其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)，檸檬酸氫二銨、裝液量和培養(yǎng)溫度對產(chǎn)纖維素酶酶活的影響呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)均取較低值，分別為2.0 g/L、80 mL/500mL、30℃；而豆餅粉、硫酸鎂、搖床轉(zhuǎn)速和接種量的影響呈現(xiàn)正效應(yīng)均取較高值，分別為25 g/L、1.0 g/L、225 r/min、3%。

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)這3 個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向和步長，其他各因素分別取各自的水平進(jìn)行試驗(yàn)，確定中心點(diǎn)。最陡爬坡的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。隨著碳源（稻草粉）質(zhì)量濃度、表面活性劑（蔗糖酯）質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間3 個(gè)主要影響因素的不同變化，酶活力的變化趨勢呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中第5 組發(fā)酵培養(yǎng)條件對應(yīng)的微晶纖維素酶（AVI）活力達(dá)到了最大值，達(dá)到5.15 IU/mL，相應(yīng)變量接近最大響應(yīng)區(qū)域，所以選取第5 組條件即稻草粉30.0 g/L、蔗糖酯1.4 g/L 和初始pH 值6.3 為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面的分析。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4 中心組合試驗(yàn)結(jié)果與分析

以最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)為基點(diǎn)，進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶活優(yōu)化的中心組合設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表4。利用Design-Expert 8.0 軟件對中心組合試驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸過程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，進(jìn)而尋求最優(yōu)響應(yīng)因子水平。擬合得二次多項(xiàng)式方程：Y=6.21 ＋0.465X1＋0.479X2＋0.379X3＋

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表5 可知，回歸模型F值為53.71，P＜0.001，說明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢詳M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)；模型的決定系數(shù)R2為0.943，校正系數(shù)R2adj為0.894，說明該模型能夠解釋89.4%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)變化，模型擬合度好；失擬項(xiàng)的F值為0.084，P=0.985 5 ＞0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著，即回歸模型顯著，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂尚哦雀?，可用來分析及預(yù)測最大值。

表5 回歸模型的方差分析

由圖6 可知，在一定范圍內(nèi)隨著稻草粉濃度、蔗糖酯濃度和初始pH 值的增加，纖維素酶活力隨之增加，當(dāng)達(dá)到最大值后，隨著各因素濃度的繼續(xù)增加，纖維素酶活力逐漸降低；各因素之間不是簡單的線性關(guān)系，這三者之間相互有交互作用，共同影響著纖維素酶的生物合成。這說明只有在各因素濃度適宜的條件下，纖維素酶活力才會(huì)達(dá)到最大值。

圖6 稻草粉、蔗糖酯和初始pH 值對鐮刀菌YL2 產(chǎn)纖維素酶的影響的響應(yīng)曲面

基于上述模型，通過Design Expert 13.0 軟件對回歸方程求極值，得到此模型的最大值，X1=0.634，X2=0.531，X3=0.558，對應(yīng)稻草粉、蔗糖酯的添加量分別為31.585、1.453 g/L，初始pH 值為6.412，此條件下AVI 酶活為6.75 IU/mL。

經(jīng)過修正，選擇稻草粉添加量31.6 g/L、蔗糖酯添加量1.45 g/L、初始pH 值6.4，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，獲得AVI 平均活力為6.72 IU/mL、CMC 平均活力84.36 IU/mL，與模型預(yù)測值接近，說明該模型能較好地反映鐮刀菌YL2 發(fā)酵合成纖維素酶的實(shí)際情況。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)優(yōu)化了鐮刀菌YL2 液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基，對比分析了稻草粉、麩皮、微晶纖維素及糊精等碳源，尿素、硫酸銨、豆餅粉及蛋白胨等氮源，檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽及不同金屬鹽等鹽溶液對產(chǎn)酶的影響，并探討了添加表面活性劑對鐮刀菌YL2 液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的影響，結(jié)果顯示，碳源以稻草粉、氮源以豆餅粉、緩沖鹽為以檸檬酸氫二銨、金屬鹽以硫酸鎂為最適宜，表面活性劑以1.2 g/L 蔗糖酯最有利于菌株產(chǎn)酶。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，利用Design-Expert 軟件，對纖維素酶高產(chǎn)菌鐮刀菌YL2 進(jìn)行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化。通過Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出影響產(chǎn)酶的3 個(gè)主要因素，即稻草粉（碳源）添加量、蔗糖酯（表面活性劑）添加量和初始pH 值。在此基礎(chǔ)上通過最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明，當(dāng)?shù)静莘厶砑恿繛?1.585 g/L、蔗糖酯添加量為1.453 g/L、初始pH 值為6.412 時(shí)，酶活力最高，此條件下AVI 活力預(yù)測值為6.75 IU/mL。經(jīng)過修正，最佳培養(yǎng)基配方為稻草粉31.6 g/L、豆餅粉25 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、硫酸鎂1.0 g/L、蔗糖酯1.45 g/L，在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 值6.4、500 mL 的三角瓶中裝液量為80 mL、搖床轉(zhuǎn)速225 r/min、接種量3%、培養(yǎng)溫度30℃的最優(yōu)產(chǎn)酶條件下培養(yǎng)6 d，微晶纖維素酶（AVI）和羧甲基纖維素酶（CMC）酶活為分別6.72 和84.36 IU/mL。