基于MiniSeq技術(shù)分析SOX10,NRG1,NRG3基因單核苷酸多態(tài)性與先天性巨結(jié)腸癥的相關(guān)性

先天性巨結(jié)腸癥(hirschsprung’s disease,HD)是常見的小兒遺傳疾病[1-2],臨床癥狀主要表現(xiàn)為胎便排出延遲,糞便瘀積導(dǎo)致腸梗阻及結(jié)腸肥厚擴(kuò)張,嚴(yán)重者可導(dǎo)致爆發(fā)性小腸結(jié)腸炎,若不及時采取治療措施,可能威脅患兒生命[3]。因此,探究HD發(fā)病的相關(guān)因素并及時采取干預(yù)措施,對于改善患兒預(yù)后至關(guān)重要。多項研究認(rèn)為,HD是由多種低外顯致病基因協(xié)同作用造成的遺傳性疾病[4-5],其主要病理機(jī)制為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白通路的失調(diào)。NRG1和NRG3基因均屬于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRGs),可參與調(diào)控神經(jīng)角質(zhì)細(xì)胞的生長、增殖與分化等,在上皮、肌肉細(xì)胞的增殖與分化中發(fā)揮重要作用[6-7]。與NRG1類似,SOX10對于形成和維持發(fā)育后期膠質(zhì)細(xì)胞的特性至關(guān)重要,有學(xué)者在HD患者的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段中觀察到SOX10的異常表達(dá)[8]。上述研究證實HD的發(fā)病與NRG1、NRG3和SOX10基因表達(dá)密切相關(guān),但其基因多態(tài)性對HD發(fā)病的影響相關(guān)研究較少,現(xiàn)基于MiniSeq基因測序技術(shù)對HD患者NRG1、NRG3和SOX10基因多個位點單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)進(jìn)行檢測,探討基因多態(tài)性與HD發(fā)病的相關(guān)性,具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 對象 選擇本院在2019年2月到2023年2月期間確診為HD的患兒74例作為病例組,并將同期83例健康兒童納入對照組,病例組患兒年齡為2個月～10歲,平均年齡(4.83±1.34)歲;對照組體檢兒童年齡為3個月～9歲,平均年齡(4.22±1.10)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①HD診斷參考《先天性巨結(jié)腸的診斷及治療專家共識》[9];②研究對象家屬簽署知情同意書;③研究對象均具有完整的臨床資料。排除對象:①樣本采集前接受藥物治療;②內(nèi)分泌相關(guān)病史者;③配合度較低者。本次研究應(yīng)用的治療方案經(jīng)東莞市第八人民醫(yī)院倫理委員會的審核批準(zhǔn)(審批號:DEPH190211)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集患者基本資料用于本次研究,包括性別、母親年齡、父親年齡、其它先天性疾病、母孕期主/被動吸煙、母親接觸有毒物質(zhì)、父親接觸有毒物質(zhì)、母孕期合并癥、母孕期患病史、家庭先天性畸形史、家庭惡性腫瘤病史及家庭頑固性便秘史。

1.2.2SOX10、NRG1和NRG3基因單核苷酸多態(tài)性檢測 利用生物信息數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)查找目的基因的多態(tài)性位點,本研究選取SOX10多態(tài)性位點rs139884,3個NRG1多態(tài)性位點rs2439302、rs7835688和rs16879552,3分NRG3多態(tài)性位點rs10748842、rs10883866和rs6584400,釆用PCR擴(kuò)增目的基因,再對所選SNP位點進(jìn)行分型分析。

采外周血2 mL于EDTA抗凝管中,使用白細(xì)胞純化試劑處理血液樣本5 min,離心3 min轉(zhuǎn)速為3 000 r/min,再經(jīng)兩次純化后得到白細(xì)胞樣本,渦旋裂解白細(xì)胞樣本3 min,得到待測DNA樣品。SOX10、NRG1和NRG3基因PCR引物設(shè)計如表1所示。PCR反應(yīng)體系20 μL:模板DNA 2 μL,正反向引物各0.5 μL,2×Taq PCR Master Mix 10 μL,去離子水7 μL。PCR反應(yīng)條件:①DNA鏈預(yù)變性95 ℃,10 min;②DNA鏈變性92 ℃,30 s;反應(yīng)體系退火55 ℃,30 s;DNA鏈延伸72 ℃,45 s,均循環(huán)36次;③DNA鏈總延伸72 ℃,10 min;④產(chǎn)物4 ℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測,若目的電泳帶清晰、無雜帶,表明PCR擴(kuò)增成功。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增成功后選用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別對選取的7個SNP位點進(jìn)行酶切分析,酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察并記錄影像。采用美國Illumina公司MiniSeq高通量測序儀進(jìn)行基因測序。

表1 SOX10、NRG1和NRG3基因各SNP位點引物序列

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果 根據(jù)兩組研究對象SOX10、NRG1和NRG3基因的7個SNP位點分析顯示,rs139884位點等位基因C/T,分型為CC、TT、CT;rs2439302位點等位基因C/G,分型為CC、GG、CG;rs7835688位點等位基因G/C,分型為GG、CC、GC;rs16879552位點等位基因T/C,分型為TT、CC、TC;rs10748842位點等位基因T/C,分型為TT、CC、TC;rs10883866位點等位基因C/G,分型為CC、GG、CG;rs6584400位點等位基因G/A,分型為GG、AA、GA(圖1),圖2為各SNP位點的基因型分布情況。對檢測出的SOX10、NRG1和NRG3基因多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗,實際頻數(shù)和理論頻數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),樣本符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(表2)。

A:rs139884位點1、2為CT基因型,3、4為TT基因型,5、6為CC基因型;B:1、2、3分別為rs2439302位點CG、CC、GG基因型,4、5、6分別為rs7835688位點GC、CC、GG基因型;C:1、2、3分別為rs16879552位點TT、CC、TC基因型,4、5、6分別為rs10748842位點TT、CC、TC基因型;D:1、2、3分別為rs10883866位點CC、CG、GG基因型,4、5、6分別為rs6584400位點GG、AA、GA基因型。

A:rs2439302位點;B:rs2439302位點;C:rs2439302位點;D:rs16879552位點;E:rs10748842位點;F:rs10883866位點;G:rs6584400位點。

表2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗

2.2 兩組一般資料比較 對兩組一般資料進(jìn)行比較,母親年齡、其它先天性疾病、父親接觸有毒物質(zhì)、母孕期合并癥、母孕期患病史、家庭頑固性便秘史對患兒HD發(fā)病無顯著影響(P>0.05),病例組患兒父親年齡顯著高于對照組(P<0.05),病例組母孕期主/被動吸煙、母親接觸有毒物質(zhì)、母親接觸有毒物質(zhì)及有家庭惡性腫瘤病史的患兒人數(shù)顯著高于對照組(P<0.05,表3)。

表3 病例組與對照組一般資料對比

以理論值作為參照組進(jìn)行用卡方檢驗(χ2)。

2.3 不同基因中單個SNP位點與先天性巨結(jié)腸癥的相關(guān)性SOX10、NRG1和NRG3基因各SNP位點基因型在兩組中的分布情況如表4所示,NRG3基因rs10748842、rs10883866、rs6584400位點和SOX10基因rs139884位點各基因型在兩組間的分布頻率差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);病例組患者NRG1基因rs2439302位點CG和GG基因型人數(shù)顯著高于對照組,并且rs7835688位點GC和CC基因型人數(shù)顯著高于對照組(P<0.05),攜帶NRG1基因rs2439302和rs7835688突變雜合基因和突變純合基因型的個體比同基因位點野生純合基因攜帶者HD發(fā)病風(fēng)險更高。

表4 SOX10、NRG1和NRG3基因不同SNP位點與HD發(fā)病的相關(guān)性

2.4 HD發(fā)病的多因素分析 將是否HD發(fā)病作為因變量(未發(fā)病=0,發(fā)病=1),將患者一般資料中具有顯著差異的因素及2個NRG1基因SNP位點的基因型作為自變量(表5)進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,校正母親年齡、其它先天性疾病、父親接觸有毒物質(zhì)及母孕期合并癥等因素后,分析結(jié)果顯示,性別、母孕期主/被動吸煙、母親接觸有毒物質(zhì)、rs2439302-G和rs7835688-C等位基因是影響HD發(fā)病的獨(dú)立危險因素(表6)。

表5 多因素Logistic回歸分析變量賦值情況

2.5 列線圖模型 將篩選出的5個獨(dú)立危險因素作為預(yù)測因子構(gòu)建列線圖模型,根據(jù)列陣圖讀出賦分結(jié)果,預(yù)測HD發(fā)病風(fēng)險率,以劉某為例,男性賦分49.43分,母孕期主/被動吸煙賦分33.75分,母親未接觸有毒物質(zhì)賦分0分,NRG1的rs2439302位點基因型為CG或GG賦分39.06分,NRG1的rs7835688位點基因型為GC或CC賦分38.24分,所得總分160.48分對應(yīng)的概率即為預(yù)測HD發(fā)病概率79.03%(圖3)。

圖3 預(yù)測HD發(fā)病風(fēng)險的列線圖模型

2.6 模型驗證 采用Bootstrap法重復(fù)抽樣1 000次內(nèi)部驗證該模型,列線圖模型預(yù)測HD發(fā)病風(fēng)險作為檢驗變量,患者實際HD發(fā)病作為狀態(tài)變量,構(gòu)建列線圖模型預(yù)測HD發(fā)病的ROC曲線和校準(zhǔn)曲線,列線圖模型的校準(zhǔn)度以校準(zhǔn)曲線中的平均絕對誤差(Mean absolute error,MAE)進(jìn)行評估,由分析結(jié)果可知,內(nèi)部驗證前后曲線下面積(AUC)分別為0.837(95%CI:0.784～0.893)、0.841(95%CI:0.786～0.896),靈敏度分別為86.5%和89.2%,特異度分別為77.1%、78.3%,MAE分別為0.015、0.017,表明列線圖預(yù)測模型區(qū)分度、校準(zhǔn)度、靈敏度及特異度良好(圖4～5、表7)。

圖4 內(nèi)部驗證前后列線圖預(yù)測模型的ROC曲線

圖5 內(nèi)部驗證前后列線圖預(yù)測模型的校準(zhǔn)曲線

表7 Bootstrap內(nèi)部驗證前后模型區(qū)分度指標(biāo)比較

3 討論

HD是一種先天性高度異質(zhì)性遺傳疾病[10]。目前發(fā)現(xiàn)可以在胚胎時期影響腸道發(fā)育的基因有10余種[11-12]。其中SOX10基因?qū)儆赟OX基因家族成員,參與胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化的調(diào)控[13]。目前SOX10在HD相關(guān)綜合征中研究報道較多,而研究對象為HD患者相關(guān)報道較少[14]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRGs)是由一個表皮生長因子信號分子通路組成,他們參與了細(xì)胞間通訊,如遷移,増殖,分化及調(diào)亡等。NRG1可在整個神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展中表達(dá)[15],而NRG3與NRG1有相同的受體,并且基因的協(xié)同作用可以對成神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育產(chǎn)生影響[16]。但對于散發(fā)性HD患者上述基因編碼區(qū)序列發(fā)生突變難以發(fā)現(xiàn)。因此不同SNP位點與HD的發(fā)病相關(guān)研究逐漸增多[17-19]。

HD屬于復(fù)雜多基因病,多基因病是指一類由多對、十幾對或更多的基因控制的、遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的疾病。目前認(rèn)為一些常見的遺傳變異,主要是指SNPs及其特定的組合可能是造成復(fù)雜性狀疾病易感性的最重要的原因[20]。有研究表明在中國漢族人群中,NRG1基因變異會增加HD的風(fēng)險[8],本研究中確認(rèn)了NRG1基因兩個SNP位點rs2439302與rs7835688與HD發(fā)病相關(guān),rs2439302位點C突變?yōu)镚,病例組CG和GG基因型人數(shù)顯著高于對照組;rs7835688位點G突變?yōu)镃,病例組GC和CC基因型人數(shù)顯著高于對照組,rs2439302-G與rs7835688-C為HD發(fā)病的風(fēng)險等位基因,分析其原因可能是由于NRG1通路的失調(diào)導(dǎo)致HD發(fā)病,并且NRG1風(fēng)險基因型存在的情況下,RET rs2435357風(fēng)險基因型(TT)增加2.3至19.53倍。NRG1不僅影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育、遷移以及髓鞘和軸突形成,還與RET之間存在相互作用,通過多重機(jī)制影響HD的發(fā)展[21]。研究中多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,除rs2435357-G和rs7835688-C外,性別、母孕期主/被動吸煙、母親接觸有毒物質(zhì)也是影響HD發(fā)生的獨(dú)立危險因素,基于這5項因素構(gòu)建預(yù)測HD發(fā)病風(fēng)險的列線圖模型并驗證模型,內(nèi)部驗證前后AUC值分別為0.837(95%CI:0.837～0.893)、0.841(95%CI:0.841～0.896),靈敏度分別為87.8%和89.2%,特異度分別為77.1%、78.3%,該模型具有良好的預(yù)測價值。但研究中未發(fā)現(xiàn)SNP位點rs16879552、rs139884、rs10748842、rs10883866及rs6584400與HD的發(fā)病風(fēng)險相關(guān),SOX10和NRG3基因可能不是HD發(fā)病的易感基因。本研究存在一定的局限性,納入的樣本數(shù)據(jù)來自同一醫(yī)療中心,結(jié)果難免存在一定偏倚;研究對象均為中國漢族,對于我國以外的其他種族人群,尚未進(jìn)行本研究結(jié)果的合理性和有效性探討,未來還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步對研究結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。

綜上所述,NRG1是先天性巨結(jié)腸癥的易感基因,rs2439302-G和rs7835688-C為HD發(fā)病的風(fēng)險等位基因,而rs16879552、rs139884、rs10748842、rs10883866和rs6584400與HD發(fā)病無明顯相關(guān)性;基于性別、母孕期主/被動吸煙、母親接觸有毒物質(zhì)、rs2439302-G和rs7835688-C構(gòu)建的列線圖模型對HD發(fā)病風(fēng)險有較好的預(yù)測效果。