櫻桃小果病毒1號(hào)膠體金免疫層析試紙的研發(fā)與應(yīng)用

郭靜靜 田利光 陳呈濤 趙怡琳 遲勝起 原雪峰 曹欣然

關(guān)鍵詞：櫻桃小果病毒1號(hào)；病毒檢測(cè)；膠體金免疫層析試紙；外殼蛋白

近年來(lái)對(duì)櫻桃主產(chǎn)區(qū)病蟲(chóng)害情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，病毒病是危害櫻桃的主要病害，并且對(duì)櫻桃生產(chǎn)的影響逐年加重，目前國(guó)內(nèi)報(bào)道了12種能夠侵染甜櫻桃的病毒，其中櫻桃小果病毒1號(hào)（little cher-ry virus 1，LChV-1）、2號(hào)（LChV-2）和3號(hào)（LChV-3）是櫻桃小果?。╨ittle cherry disease，LCD）的主要病原，侵染后導(dǎo)致櫻桃果實(shí)縮小，嚴(yán)重影響甜櫻桃的產(chǎn)量，甚至徹底喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值。LChV-1田間檢出率較高。該病毒屬于長(zhǎng)線形病毒科長(zhǎng)線病毒屬Closterio‘-oirus[13]。多數(shù)品種對(duì)LChV-1敏感，因此在田間生產(chǎn)中對(duì)該病毒的檢測(cè)尤為重要。

病毒檢測(cè)常用的方法有血清學(xué)檢測(cè)（蛋白水平）和PCR/qPCR/RT-PCR/法（核酸水平）等。在病毒進(jìn)入植物體的過(guò)程中，高度保守的含有多個(gè)抗原決定簇的CP蛋白起重要作用，決定著病毒的抗原性，因此對(duì)LChV-1的CP蛋白免疫獲得抗體后可以對(duì)病毒進(jìn)行特異性檢測(cè)。常規(guī)的Westernblot和PCR等方法均需在實(shí)驗(yàn)室完成，不能滿足田間快速檢測(cè)的需求。目前，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-me-diated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)、膠體金免疫層析（colloidal gold immunochromatographyassay，GICA）技術(shù)和重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombi-nase polymerase amplification，RPA）技術(shù)可以滿足田間檢測(cè)。其中膠體金免疫層析技術(shù)是以血清學(xué)檢測(cè)法為原理建立的一種檢測(cè)方法，是將膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。該方法只要根據(jù)條帶指示即可判斷病毒的有無(wú)，不需要專用儀器和專業(yè)技術(shù)人員操作，能夠滿足田間快速檢測(cè)的需求。

LChV-1存在潛伏侵染現(xiàn)象，在苗期獲得無(wú)毒種苗是預(yù)防櫻桃病毒病的有效措施，所以，早期的田間檢測(cè)至關(guān)重要。目前的檢測(cè)技術(shù)無(wú)法滿足田間快速檢測(cè)的需求。本研究采用膠體金免疫層析試紙的方法，可以用較短時(shí)間呈現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果，旨在為櫻桃小果病的綜合防控提供了有效監(jiān)測(cè)和檢測(cè)手段。

1材料與方法

1.1構(gòu)建含有LChV-1 CP編碼序列的原核表達(dá)載體

對(duì)NCBI上已經(jīng)報(bào)道的櫻桃小果病毒1號(hào)分離物序列（GenBank序列登錄號(hào)分別為KU715989、KR080325、JX669615、NC001836和KR736335）進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)帶有BarnH工和Not工酶切位點(diǎn)的引物L(fēng)ChV-1-CP-BamHI-12061-F（5'-AAGGATCCAT-GGCGAATTTAGCTTTCACGAAA-3），LChV-1-CP-Notl-13275-R（5'-TTGCGGCCGCTTAATTT-CTTCTACCGCGACGTGG-3）。使用RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25uL）：10×PCR緩沖液（Mg2+ plus）2.5uL，10mmoL/L dNTPs

1uL，LChV-1-CP-BamHI-12061-F和LChV-1-CP-Notl-13275-R各1uL，cD-NA 1uL，5U/uL Taq DNA聚合酶1uL，ddH20補(bǔ)足至25uL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min;94℃變性40s，50℃退火40s，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min，

將PCR產(chǎn)物連接到表達(dá)載體pESC-HIS上，經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序得到酶切位點(diǎn)和序列信息正確的重組表達(dá)載體pESC-HIS-LChV-1-CP。

1.2LChV-1CP蛋白的原核表達(dá)及蛋白純化

將pESC-HIS-LChV-1-CP原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中。挑取含重組質(zhì)粒的Rosetta菌株于LB培養(yǎng)基中活化8h，然后擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600達(dá)0.5左右，在LB培養(yǎng)基中加入0.5mmol/L的IPTG繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h，進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。收集少量菌體加入2×SDS蛋白上樣緩沖液[20 mmoL/L Tris-HCl（pH 7.4）、0.2moL/L NaCI、1mmoL/L EDTA]沸水浴8min，采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)。成功表達(dá)后，將獲得的菌體超聲波破碎，分別檢測(cè)上清液和沉淀物中蛋白質(zhì)含量，確定表達(dá)蛋白的可溶性。

大量誘導(dǎo)表達(dá)LChV-1的CP蛋白并超聲破碎。上清液用0.22um的水系濾膜過(guò)濾至50mL離心管中，過(guò)Ni柱純化（整個(gè)層析過(guò)程在4℃環(huán)境中進(jìn)行）。裝柱：根據(jù)待純化的蛋白量，將2 ml。介質(zhì)加入層析柱；平衡：用5～10倍柱體積平衡緩沖液平衡層析柱；上樣：將蛋白加入層析柱中，收集流出液；洗滌：用洗滌緩沖液（19.6mL 1×Buffer B，400uL1mol/L咪唑）分兩次洗脫雜蛋白，每次1mL，再用洗脫緩沖液（8.5mL1×Buffer C，1.5mL 1mol/L咪唑）洗脫目的蛋白，收集5管流出液（每管500uL）。SDS-PAGE電泳檢測(cè)，-80℃保存。

1.3LChV-1 CP抗血清制備、特異性檢測(cè)及效價(jià)分析

將純化后的LChV-1 CP蛋白送北京華大基因科技有限公司進(jìn)行抗血清制備。采用Western blot檢測(cè)抗血清的特異性。獲得的一抗的多抗血清終濃度為1：5000，加入二抗終濃度為1：20000。使用間接ELISA方法分析抗血清效價(jià)，多抗血清用TBS從200倍開(kāi)始2倍梯度稀釋，終濃度分別為200、400、800、1600、3200、6400、12800倍和25600倍，反應(yīng)終止后在波長(zhǎng)405nm下測(cè)定吸光度，以O(shè)D值大于0.1標(biāo)準(zhǔn)判斷為陽(yáng)性。

1.4膠體金免疫層析試紙的研發(fā)

1.4.1確定最佳抗體標(biāo)記濃度

將制備好的膠體金溶液pH調(diào)節(jié)至7.08。取不同濃度的抗血清30uL加入離心管中，加入膠體金125uL，5min后，加入10% NaCI，1h后觀察顏色變化，顏色不變的最低濃度即為最佳抗體標(biāo)記濃度。

1.4.2制備金標(biāo)抗體

取1mL膠體金，用0.2mol/L碳酸鉀調(diào)節(jié)pH至7.08。將最佳抗體標(biāo)記濃度（0.24mg/mL）的抗血清加入到1mL膠體金中，迅速振蕩5min，室溫靜置1h；加入137.8uLBSA至終濃度為1%;振蕩5min后靜置1h；13000r/min4℃離心25min，棄上清，加入1mL含0.01mol/L硼砂的2%BSA重懸沉淀；重復(fù)步驟上一步；13000r/min 4℃離心25min，加入200uL TBS重懸沉淀。

1.4.3膠體金免疫層析試紙的檢測(cè)原理

試驗(yàn)采用競(jìng)爭(zhēng)法。在試紙條的結(jié)合墊上固定金標(biāo)抗體，NC膜的T線和C線上分別固定待測(cè)抗原和能與金標(biāo)抗體特異性結(jié)合的二抗。當(dāng)待測(cè)樣品液體滴加到試紙條上后，通過(guò)層析作用，液體依次會(huì)流過(guò)結(jié)合墊、T線、C線。當(dāng)樣品中含有目的抗原時(shí)，移動(dòng)至結(jié)合墊時(shí)待測(cè)抗原與結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體結(jié)合，移動(dòng)至T線時(shí)，由于金標(biāo)抗體已經(jīng)與樣品中的待測(cè)抗原結(jié)合，故無(wú)法被T線上的抗原捕獲，膠體金不會(huì)發(fā)生聚集，T線不會(huì)顯色，移動(dòng)至C線時(shí)，游離的金標(biāo)抗體被二抗捕獲，膠體金聚集并顯色，結(jié)果呈現(xiàn)為一條線；當(dāng)樣品中不含有目的抗原時(shí)，液體移動(dòng)至結(jié)合墊，結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)未被占據(jù)，液體移動(dòng)至T線，金標(biāo)抗體被T線上的抗原捕獲，膠體金聚集并顯色，液體運(yùn)動(dòng)至C線，游離的金標(biāo)抗體被二抗捕獲，膠體金聚集并顯色，結(jié)果呈現(xiàn)為兩條線。

1.5田間樣品檢測(cè)

采用膠體金免疫層析試紙條及常規(guī)RT-PCR對(duì)田間甜櫻桃樣品進(jìn)行檢測(cè)。田間甜櫻桃上常發(fā)生的病毒有櫻桃小果病毒1號(hào)、櫻桃小果病毒2號(hào)（littlecherry virus 2，LChV-2）、櫻桃病毒A（cherry virus A，CVA）、櫻桃綠斑駁病毒、李矮縮病毒（prune dwarf virus，PDV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、李樹(shù)皮壞死與莖痘伴隨病毒（plum bark necrosis stem pitting-asso-ciated virus，PBNSPaV）、李屬壞死環(huán)斑病毒（prunus nec-rotic ring spot virus，PNRSV）和柑橘葉斑駁病毒（citrusleaf blotch virus，CLBV）。這些病毒的RT-PCR檢測(cè)所用的特異性引物參考專利ZL201811480617.2。

田間甜櫻桃樣本于2021年7月采集于煙臺(tái)棲霞，品種為‘輝煌’‘玲瓏脆’‘櫓櫻三’‘瑞德’‘五月紅’。采用TransZoI Plant試劑盒提取植物葉片總RNA，利用RT-PCR檢測(cè)病毒。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（25uL，試劑購(gòu)自TaKaRa公司）：植物總RNA 20～50ng，100mmol/L反向引物 5．0uL，10mmol/LdNTPs 4．0uL，ddH25．0uL。80℃ 3 min然后冰上5min，加入5×Reverse Transcriptase M-MLVbuffer 5．0uL，反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）0.5uL，Recom-binant RNase Inhibitor 0．5uL，于42℃反應(yīng)90min。PCR反應(yīng)體系（20.0uL）：cDNA 2．0uL，100mmol/L上、下游引物各0.5uL，2×Taq Master Mix（康為世紀(jì)生物科技有限公司）10uL，超純水7.0uL。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃40s，50～54℃40s，72℃20～35s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

將櫻桃葉片用緩沖液（20mmol/L Tris-HCI，150mmol/L NaCI，0.05% Tween-20，pH 7.5）研磨后，滴加于膠體金免疫層析試紙上。10min后待條帶清晰穩(wěn)定后，通過(guò)觀察檢測(cè)線和質(zhì)檢線的顯色情況進(jìn)行判定。檢測(cè)線沒(méi)有紅色條帶，質(zhì)檢線出現(xiàn)紅色條帶，判定為陽(yáng)性，說(shuō)明所檢測(cè)植物樣本中有LChV-1；檢測(cè)線和質(zhì)檢線兩條線都顯現(xiàn)紅色條帶，判定為陰性，即所檢測(cè)樣品中不含有LChV-1；只有檢測(cè)線有條帶，或檢測(cè)線質(zhì)檢線均沒(méi)有條帶，表明該試紙條檢測(cè)結(jié)果不可信。

2結(jié)果與分析

2.1LChV-1 CP蛋白的原核表達(dá)及可溶性

SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出的目的蛋白量差異不明顯。選取0.5mmol/L濃度的IPTG進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的蛋白分子量在43～55kD之間，與LChV-1-CP蛋白的分子量（45kD）相符（圖2）。可溶性檢測(cè)結(jié)果顯示，目的蛋白在上清和沉淀中均存在（圖2）。上清中的目的蛋白可用于Ni柱純化。

2.2抗血清的特異性及效價(jià)

以實(shí)驗(yàn)室保存的健康煙草葉片、重組的LChV-1CP蛋白、帶有LChV-1的田間櫻桃葉片為材料，對(duì)制備好的抗血清進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果（圖3）顯示，重組的LChV-1CP蛋白和田間樣本在45kD處有明顯特異性條帶。表明該抗體可用于LChV-1的檢測(cè)。間接ELISA進(jìn)行抗血清的效價(jià)分析顯示，抗血清在稀釋12800倍時(shí)，仍然可以檢測(cè)出陽(yáng)性樣本。

2.3膠體金免疫層析試紙檢測(cè)體系的優(yōu)化

2.3.1最佳抗體標(biāo)記濃度

膠體金結(jié)合墊上含有抗體標(biāo)記膠體金顆粒，該抗體為本實(shí)驗(yàn)所獲得的特異性良好的LChV-1CP的抗血清。為確定結(jié)合墊上最佳抗體標(biāo)記濃度，將終濃度分別為0，0. 12，0.24，0.48mg/mL和0. 72mg/mL用作抗體標(biāo)記濃度，以不變顏色的最低濃度為金標(biāo)抗體的最佳濃度。結(jié)果顯示，最佳標(biāo)記濃度為0.24mg/mL（圖4）。

2.3.2最佳檢測(cè)線濃度

檢測(cè)線包被抗原，該抗原為本實(shí)驗(yàn)所獲得的可溶性良好的LChV-1CP的重組蛋白。為確定最佳檢測(cè)線濃度，將不同抗體終濃度（0.0625，0.125，0.25，0.5，1mg/mL）重組蛋白點(diǎn)涂于硝酸纖維素膜上，作為檢測(cè)線。如圖5所示，肉眼可識(shí)別的最低濃度即為最佳檢測(cè)線濃度，最終確定最佳檢測(cè)線濃度為0.25mg/ml．。

2.3.3最佳質(zhì)檢線濃度

確定檢測(cè)線濃度后進(jìn)行質(zhì)檢線濃度的確定，將不同終濃度（0.1，0.08，0.06，0.04，0.02mg/mL）羊抗兔IgG抗體點(diǎn)涂于硝酸纖維素膜上，作為質(zhì)檢線，肉眼可識(shí)別的最低濃度即為最佳質(zhì)檢線濃度，最終確定最佳質(zhì)檢線濃度為0.04mg/mL（圖6）。

2.3.4膠體金免疫層析試紙的特異性

用實(shí)驗(yàn)室保存的分別單獨(dú)被黃瓜花葉病毒（cu-cumber mosaic vlrus，CMV），李屬壞死環(huán)斑病毒（prunus necrotic ring spot vlrus，PNRSV），李矮縮病毒（prune dwarf virus，PDV）侵染的植物樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖7）顯示，LChV-1中檢測(cè)線不顯色，其余3種樣品中檢測(cè)線顯色，說(shuō)明該試紙條可以特異性檢測(cè)LChV-1。質(zhì)檢線顯色，說(shuō)明該試紙條可正常使用。該試紙條可以特異性檢測(cè)出含有LChV-1病毒的植物樣本。

2.3.5膠體金免疫層析試紙的田間應(yīng)用

試紙條結(jié)果（圖8a）顯示，樣本1中檢測(cè)線不顯色，質(zhì)檢線顯色，表明樣本含有LChV-1，樣本2～樣本9檢測(cè)線和質(zhì)檢線均顯色，表明樣本不含有LChV-1；將所有樣本提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果與試紙條結(jié)果一致（圖8b）。因此，在田間樣品的檢測(cè)中，制備的膠體金免疫層析試紙可以成功檢測(cè)出LChV-1，具有良好的田間應(yīng)用效果。

3結(jié)論與討論

膠體金免疫層析技術(shù)是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)、層析分析技術(shù)和單克隆（多克?。┛贵w多種方法相結(jié)合的一種固相標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)作為一種新型的免疫標(biāo)記示蹤技術(shù)，比傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫標(biāo)記（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reac-tion，PCR）等方法更快速簡(jiǎn)便、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前檢測(cè)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。其檢測(cè)原理分為競(jìng)爭(zhēng)法與雙抗夾心法，競(jìng)爭(zhēng)抗體法適用于含有單一抗原表位的小分子抗原，雙抗夾心法適用于含有多個(gè)抗原表位的大分子抗原，本試驗(yàn)選用競(jìng)爭(zhēng)法。前期試驗(yàn)中也采用過(guò)結(jié)果更容易判讀的雙抗夾心法，但并未成功，推測(cè)原因可能由于LChV-1CP蛋白表位比較單一，后改為競(jìng)爭(zhēng)法。

試紙樣品墊的作用是迅速吸收待測(cè)樣品，儲(chǔ)存樣品并迅速釋放待測(cè)樣品，試驗(yàn)前期采用磷酸緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）加吐溫-20對(duì)樣品墊進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)層析過(guò)程中樣品墊與結(jié)合墊連接處可見(jiàn)膠體金殘留堵膜，推測(cè)可能由于PBST鹽濃度較高容易引起沉淀，后調(diào)整為T(mén)ris緩沖液（Tris buffered solution，TBS）加吐溫-20，再添加活性劑，這樣可以使樣品墊緩沖液分布均勻，釋放樣品速率加快，膜上背景干凈，膠體金釋放完全。膠體金免疫層析試紙中的核心組件是硝酸纖維素膜（NC），是免疫反應(yīng)的主要載體，其質(zhì)量主要由兩方面決定，一是結(jié)合大分子物質(zhì)的能力，二是膜的孔徑。膜的孔徑是影響層析速度的關(guān)鍵因素。孔徑越小，層析速度越慢，抗原抗體結(jié)合時(shí)間越長(zhǎng)，反應(yīng)越充分，但發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性也相應(yīng)提高，所以需要根據(jù)抗原（抗體）蛋白分子大小、檢測(cè)原理和廠家等多種因素進(jìn)行摸索。

在我們前期工作中發(fā)現(xiàn)，甜櫻桃在田間復(fù)合侵染現(xiàn)象非常普遍。由于櫻桃小果病毒1號(hào)造成危害較為嚴(yán)重，故本試驗(yàn)選擇該病毒進(jìn)行膠體金免疫層析試紙的研發(fā)，旨在為L(zhǎng)ChV-1的早期診斷和綜合防治提供監(jiān)測(cè)和檢測(cè)手段。后期可根據(jù)甜櫻桃復(fù)合侵染特點(diǎn)，針對(duì)兩種或更多種病毒研發(fā)兩重或多重GICA試紙，滿足田間的檢測(cè)需求。