安徽省首次發(fā)現(xiàn)腎形腎狀線蟲危害瓜蔞

方圓 朱衎衙 吳慧平 彭德良 王行軍 嚴麗 潘月敏 鞠玉亮

關鍵詞：瓜蔞；腎形腎狀線蟲；形態(tài)學特征；系統(tǒng)發(fā)育；生活史瓜蔞Trichosanthes kirilowzii Maxim.屬葫蘆科栝樓屬多年生草質藤本植物，其果實、種皮、種子、根均可入藥，兼具藥用、食用、保健功能，經(jīng)濟價值較高。目前，瓜蔞是當前農(nóng)業(yè)結構調整中重要的特色經(jīng)濟作物之一，在安徽、山東、江蘇等地有大規(guī)模種植。植物線蟲病害是嚴重制約瓜蔞生產(chǎn)的主要土傳病害，且隨著瓜蔞種植年限的增加危害愈發(fā)嚴重。腎形腎狀線蟲Rotylenchulus re-niforrnisLinford&Oliveira，1940是作物根部半內寄生植物線蟲，通常在熱帶和亞熱帶地區(qū)發(fā)生危害，與根結線蟲等并稱為危害最嚴重的世界十大植物線蟲。腎形腎狀線蟲寄主范圍廣泛，可危害豆科、葫蘆科、茄科、十字花科、旋花科、菊科、禾本科、天南星科、大戟科、錦葵科、棕櫚科、莧科、番荔枝科、罌粟科等科的300多種植物。腎形腎狀線蟲生活史較特別，在卵內發(fā)育成2齡幼蟲后進入土壤，在不取食的狀態(tài)下經(jīng)3次蛻皮發(fā)育為未成熟雌蟲（蠕蟲形雌蟲）和雄蟲，蠕蟲形雌蟲蟲體前部1/3處侵入植株根內取食并建立類似孢囊線蟲的取食位點，根外部蟲體逐漸膨大，經(jīng)7～9d最終發(fā)育為成熟的腎形雌蟲。腎形腎狀線蟲侵染根系，導致根系壞死、萎縮、須根減少，植株地上部分表現(xiàn)矮小、黃化等癥狀，可導致作物減產(chǎn)40%_60%。

目前，腎形腎狀線蟲已在我國廣東、上海、湖北、海南、四川、廣西、福建、山東和浙江等地的蔬菜或園林植物上發(fā)生危害。吳慧平等1994年-1996年開展了安徽省盆景花卉根際植物線蟲類群調查工作，在銅陵市南天竹Nandina dornestzca根際土壤中分離到腎形線蟲屬線蟲，但未鑒定到具體種，隨后在安徽省農(nóng)作物上一直未發(fā)現(xiàn)腎形腎狀線蟲發(fā)生危害。筆者于2020年和2021年對安徽省部分瓜蔞產(chǎn)區(qū)植物線蟲病害進行調查，發(fā)現(xiàn)除南方根結線蟲Meloidogyne zncognita外，部分瓜蔞產(chǎn)區(qū)有腎形線蟲病發(fā)生，且危害嚴重?；诖耍狙芯吭谇捌谡{查的基礎上，利用形態(tài)學和分子生物學手段對安徽省瓜蔞腎形線蟲病的病原進行種類鑒定，并對其遺傳進化進行分析，利用室內接種的方法對其生活史進行初步研究。

1材料與方法

1.1田間調查與樣品采集

分別于2020年和2021年對安徽省部分瓜蔞產(chǎn)區(qū)腎形線蟲病害進行調查。采用田間五點取樣法，并有針對性地選擇長勢較弱的瓜蔞，剪去瓜蔞植株地上部分，挖取瓜蔞根系，同時取根際15cm深的土壤1kg，將瓜蔞根系和根際土壤帶回實驗室進行線蟲的分離鑒定。

1.2線蟲分離及形態(tài)學鑒定

將瓜蔞根際土壤充分混勻，取100mL土壤，利用貝曼漏斗法分離線蟲各齡期幼蟲、蠕蟲形雌蟲及雄蟲，并統(tǒng)計蟲口密度。線蟲的形態(tài)學鑒定主要基于蠕蟲形雌蟲及雄蟲的形態(tài)，臨時玻片制作及形態(tài)測計參考張燕等的方法并稍作改動。

1.3分子生物學鑒定

單條雌蟲DNA提取參考鄧艷鳳等的方法并稍作改動：在體視顯微鏡下從瓜蔞根部挑取單條雌蟲，置于載玻片上用ddH20清洗2次，置于含16uLddH20的PCR管中；液氮處理5min后65℃水浴5min，該步驟重復3次；加入4uL 5×Lysis Buffer，65℃處理1h，95℃處理10min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用已報道的rDNA-D2D3區(qū)特異性引物Rr-F3/Rr-B3對本研究所采集的7份樣品進行分子生物學鑒定，陽性對照為南京農(nóng)業(yè)大學植物線蟲實驗室惠贈的腎形腎狀線蟲，陰性對照分別為南方根結線蟲Meloidogyne zncognita、北方根結線蟲M．hapla、爪哇根結線蟲M．jauoanzca和擬禾本科根結線蟲M．grauminicola，以ddH20為空白對照。PCR反應體系：DNA模板2uL，10umol/L引物Rr-F3/Rr-B3各0.5uL，2×Taq PCR MasterMix12.5uL，超純水補足至25uL。PCR反應程序：94℃預變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.4系統(tǒng)發(fā)育分析

分別選擇腎形腎狀線蟲ITS、18S、28S、mtDNA-CO工基因引物18S/26S、18S-A/18S-S3、D2A/D3B、JB3/JB5進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物電泳檢測后，將條帶亮且與目標基因大小一致的產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司測序。測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，并從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載相關線蟲序列。利用MEGA11的鄰接法（neighbor-joining method）構建系統(tǒng)進化發(fā)育樹，Boostrap值設置為1000，分析分支聚類的可靠性。

1.5室內接種試驗

在體視顯微鏡下從瓜蔞根部挑取腎形腎狀線蟲卵塊，于26℃培養(yǎng)箱中孵化，3d后收集2齡幼蟲并配制2000條/mL的線蟲液，用于室內接種試驗。取瓜蔞種子機械破殼后于溫水中催芽，5d后播種于滅菌土壤（黏土和沙土按2：1混合）中，置于27℃溫室中培養(yǎng)。瓜蔞苗培養(yǎng)10 d后每盆接種2 000條/mL的線蟲液2.5mL，即5000條腎形腎狀線蟲2齡幼蟲，接種后繼續(xù)置于溫室中培養(yǎng)，定期澆水。接種線蟲30d后，統(tǒng)計根部卵塊數(shù)量、每個卵塊含卵量、根部腎形腎狀線蟲數(shù)量、土壤中腎形腎狀線蟲數(shù)量，計算繁殖系數(shù)（R）。R=Pf./Pi式中P.f為接種后30 d線蟲數(shù)量（含卵量），Pi為初始接種線蟲數(shù)量。另外，接種腎形腎狀線蟲后，每2d取1次樣，每次取5棵瓜蔞，用清水輕輕洗去根部泥沙，用次氯酸鈉一酸性品紅染色，觀察線蟲侵染及發(fā)育情況。

2結果與分析

2.1瓜蔞腎形腎狀線蟲病危害癥狀

通過對安徽省部分瓜蔞產(chǎn)區(qū)腎形線蟲病調查發(fā)現(xiàn)，該病害主要在巢湖市瓜蔞種植區(qū)發(fā)生。部分發(fā)生嚴重的田塊，每100mL土壤中腎狀屬線蟲數(shù)量高達1050條，導致瓜蔞大面積枯萎死亡，嚴重威脅瓜蔞產(chǎn)量和品質（圖1a）。感染線蟲的瓜蔞地上部生長緩慢、植株矮小，且在瓜蔞生長后期出現(xiàn)明顯的早衰現(xiàn)象，高溫、干旱條件下瓜蔞易枯死。被線蟲侵染的根系，老根畸形、腫大，嚴重時出現(xiàn)壞死癥狀（圖1b）；新生根須根減少，根部有明顯的成熟雌蟲和膠質卵塊，根系局部出現(xiàn)壞死癥狀（圖1c～e）。

2.2形態(tài)學鑒定

未成熟雌蟲：蠕蟲形，加熱殺死后蟲體呈“C”形，唇區(qū)隆起、圓錐形、無縊縮；頭架、口針強壯，口針基部球圓形；食道腺長，覆蓋腸端，口針基部球距食道腺開口距離與口針長度基本相等；中食道球卵圓形，瓣門清楚，排泄孔位于食道峽基部；雙生殖管對生，卵巢不成熟；尾長圓錐形，具透明尾端（圖2）。

成熟雌蟲：蟲體腹彎，膨大呈腎形；頸區(qū)彎曲不規(guī)則；陰門突起，受精囊圓形至不規(guī)則形，通常有精子；肛門后蟲體呈半球形，具細長尾尖突；產(chǎn)卵于膠質卵囊內（圖2）。

雄蟲：食道退化，中食道球不發(fā)達；口針纖弱；交合刺纖長，向腹面彎曲呈弓狀，交合傘不明顯（圖2）。

基于形態(tài)學鑒定，本研究所獲得的腎狀屬線蟲主要形態(tài)測量值（表2）與海南省已報道的腎形腎狀線蟲群體RRLC1基本吻合，確定引起瓜蔞腎形線蟲病的病原為腎形腎狀線蟲Rotylenchulus

reni-rorrnis Linford&Oliveira，1940.

2.3特異性引物驗證

以單條雌蟲DNA為模板進行PCR擴增，結果顯示，采自安徽省巢湖市中廟鎮(zhèn)和柘皋鎮(zhèn)瓜蔞田的7份樣品均擴增出190bp大小的條帶，與陽性對照一致，而對照組無擴增條帶，進一步確定其為腎形腎狀線蟲（圖3）。

2.4系統(tǒng)發(fā)育分析

將本研究所測腎形腎狀線蟲（ah-Rr）的ITS、28S、COI基因序列分別在NCBI與已有的腎形腎狀線蟲數(shù)據(jù)進行BLAST比對，ITS序列種內一致性為88.05%～99.66%，28S種內一致性為94.95%～100%，COI種內一致性為99.18%～100%，可見腎形腎狀線蟲ITS區(qū)遺傳變異較大，與已報道結果一致?；贗TS、28S、COI的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖4～6），本研究腎形腎狀線蟲ITS和28S均與A型（type A）群體遺傳距離較近，而與B型（type B）群體遺傳距離較遠，表明本研究腎形腎狀線蟲屬于A型。此外，本研究腎形腎狀線蟲ITS與孤雌生殖群體（AY335190）遺傳距離較遠，而與兩性生殖群體（AY335191、FJ374686）遺傳距離較近。

2.5腎形腎狀線蟲生活史

腎形腎狀線蟲接種瓜蔞后，每2d取瓜蔞根系用次氯酸鈉一酸性品紅染色，觀察線蟲發(fā)育情況。結果發(fā)現(xiàn)，接種2齡幼蟲6d后可在瓜蔞根部發(fā)現(xiàn)未成熟雌蟲侵染根系（圖7a），接種8d后未成熟雌蟲在根外的蟲體部分逐漸膨大（圖7b～e），接種16d后在根部可見成熟雌蟲（圖7f～g），接種20d時成熟雌蟲周圍可見膠質卵塊（圖7h～i），每個卵塊平均含64個卵，接種24d后卵塊內可見2齡幼蟲游出。該結果表明，在27℃室內條件下，腎形腎狀線蟲寄生瓜蔞根部的生活史周期為24d。此外，將5000條腎形腎狀線蟲2齡幼蟲接種瓜蔞30d后，根據(jù)根部卵塊數(shù)量、每個卵塊含卵量、根部腎形腎狀線蟲數(shù)量、土壤中腎形腎狀線蟲數(shù)量，計算得到繁殖系數(shù)（R）為（11.12±0.62）（表3）。通過室內接種試驗，首次證實瓜蔞為腎形腎狀線蟲的新寄主。

3結論與討論

植物線蟲是引起我國農(nóng)作物病害的重要病原物之一，對大田作物造成的經(jīng)濟損失約為10%～20%，嚴重時可達30%～50%，部分地區(qū)可超80%。隨著全球氣候變化、種植制度改革、高值農(nóng)業(yè)迅速發(fā)展等因素，植物線蟲病害發(fā)生趨勢愈發(fā)嚴重，將成為我國重要的植物病害。腎形腎狀線蟲作為一種危害嚴重的植物線蟲，近年來在蔬菜、果樹、園林植物上相繼被發(fā)現(xiàn)和報道。腎形腎狀線蟲形態(tài)學鑒定主要基于未成熟雌蟲、成熟雌蟲及雄蟲的形態(tài)特征。本研究中的腎形腎狀線蟲主要形態(tài)測量值與國內已報道的腎形腎狀線蟲群體基本吻合，個別特征略有差別。不同形態(tài)測量值的差異可能與腎形腎狀線蟲所處溫濕度、土壤環(huán)境、寄主種類等因素相關。腎形腎狀線蟲rDNA-ITS區(qū)在不同群體甚至同一群體內遺傳變異較大，Vovlas等和Palomares-Rius等利用ITS、28S對腎形腎狀線蟲進行系統(tǒng)發(fā)育分析，對A型（type A）和B型（tybe B）進行有效區(qū)分，并將腎形腎狀線蟲與腎狀屬其他線蟲進行有效區(qū)分。基于ITS、28S、COI基因進行的遺傳進化分析表明，本研究所采集腎形腎狀線蟲屬于A型，且與兩性生殖腎形腎狀線蟲（AY335191，F(xiàn)J374686）遺傳距離較近，無A型和B型同時發(fā)生的現(xiàn)象。

腎狀屬線蟲生活史較特別，2齡幼蟲在土壤中不取食的狀態(tài)下經(jīng)過3次蛻皮發(fā)育成未成熟雌蟲，未成熟雌蟲為取食蟲態(tài)。幼蟲蛻皮過程通常會保留前一齡期的角質層，且每次蛻皮后蟲體較前一齡期短小。筆者對分離自土壤的腎形腎狀線蟲鏡檢時，發(fā)現(xiàn)土壤中存在各齡期幼蟲，且大量線蟲處于蛻皮階段，前一齡期的角質層覆蓋蟲體的現(xiàn)象較普遍。對腎形腎狀線蟲在瓜蔞根上的生活史研究發(fā)現(xiàn)，瓜蔞根系上卵塊較密集，但每個卵塊含卵量較少，約為64粒，單個雌蟲產(chǎn)卵量明顯少于根結線蟲的產(chǎn)卵量。前人研究表明，腎形腎狀線蟲在缺乏寄主或干燥條件下，線蟲可在土壤中保持某一蠕蟲階段而不生長，其生活史可在兩年內完成。田間調查時也發(fā)現(xiàn)，在部分黏質土且略板結的土質較差的田塊，土壤中腎形腎狀線蟲數(shù)量超過1000條/100mL土壤，表明腎形腎狀線蟲對逆境的適應能力相對較強。此外，5000條2齡幼蟲接種瓜蔞30d后，繁殖系數(shù)為11. 12，高于腎形腎狀線蟲在大豆根部的繁殖能力，本文推測瓜蔞是腎形腎狀線蟲的合適寄主。

綜上所述，本文首次報道腎形腎狀線蟲在安徽省發(fā)生危害，對其形態(tài)特征、遺傳進化、生活史等進行初步描述和研究，且首次報道瓜蔞為腎形腎狀線蟲的新寄主。本研究為進一步掌握腎形腎狀線蟲的分布區(qū)域及潛在寄主，為采取有效的防治措施提供理論依據(jù)。