梨園氣溶膠中梨火疫病菌的定量檢測

荊琚 王杰花 韓麗麗 陳衛(wèi)民 吳品珊 雷榮

關(guān)鍵詞：梨園；氣溶膠；梨火疫病菌；定量檢測

解淀粉歐文氏菌Erwinia arnylouora被列為我國重大檢疫性細(xì)菌，其引起的梨火疫病于2015年6月首次在新疆伊犁地區(qū)霍城縣發(fā)現(xiàn)并暴發(fā)流行，現(xiàn)已蔓延至新疆14個地州（市），嚴(yán)重危害梨、蘋果、山楂、海棠、榀槨等果樹，尤其在庫爾勒香梨上傳播極為迅速，給新疆乃至全國林果產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重威脅。2017年，蘋果在中國的種植面積約222萬hm2，產(chǎn)量382萬t；梨種植面積約107萬hm2，產(chǎn)量1289萬t，種植面積和產(chǎn)量均為世界第一。我國梨每年的出口值超過2億美元，是世界上最大的梨出口國之一，也是我國農(nóng)業(yè)重要的經(jīng)濟來源之一。因此，梨火疫病害一旦傳播至國內(nèi)其他省份，將造成巨大損失。

細(xì)菌、真菌、病毒、噬菌體等微生物可附著在氣溶膠包含的固體或液體顆粒上，以獨立個體或聚集體的形式在空氣中擴散，造成病原微生物的長距離傳播和入侵。迄今，大部分研究認(rèn)為梨火疫病菌主要通過傷口、自然孔口和花侵入寄主，進(jìn)而侵染韌皮部組織、花絲及柱頭，引起組織發(fā)病，而通過在種植蘋果的模擬苗圃中研究風(fēng)雨形成的氣溶膠在梨火疫病傳播流行中的作用，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)疫情都與流行之前發(fā)生的風(fēng)暴有關(guān)。梨火疫病菌在相對濕度為40%～90%的空氣粒子中可存活較長時間。目前自然條件下國內(nèi)梨園氣溶膠攜帶梨火疫病菌情況未見報道。因此，本研究于2019年-2021年收集了新疆庫爾勒市人和農(nóng)場‘香梨’園中的氣溶膠，對其中可能攜帶的梨火疫病菌進(jìn)行檢測，為掌握梨火疫病的傳播途徑提供技術(shù)依據(jù)，對庫爾勒香梨產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有理論和實踐意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1梨園基本概況

試驗地位于新疆巴州庫爾勒人和農(nóng)場，共12個梨園，經(jīng)緯度：41°40'N～41°49'N，85°59'E～85°47'E，海拔：907.5～928m，株行距：3m×5m，每個梨園面積0.67hm2，共計8.04 hm2。其中健康（不發(fā)病）梨園3個、輕度發(fā)病（病情指數(shù)1.00～10.00）梨園3個、中度發(fā)?。ú∏橹笖?shù)10.01～30.00）梨園3個、重度發(fā)?。ú∏橹笖?shù)30.01以上）梨園3個，種植品種‘香梨’。土質(zhì)為沙壤土，土壤肥力中等，地勢平坦，排灌方便，井水灌溉，栽培條件（施肥量、灌水等）均勻一致，符合當(dāng)?shù)貙嶋H林業(yè)生產(chǎn)。

1.1.2致病性測試材料

2019年4月-2021年6月，采集庫爾勒市綠化4隊行道樹上未噴任何藥劑、健康的當(dāng)年生‘香梨’樹嫩枝條、葉片、幼果，供離體接種使用。巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院溫室秋季栽植2年生‘小葉刺’杜梨Pyrus betulifolia苗，供次年活體接種使用。

1.1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株

梨火疫病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（編號：E．a(chǎn)Y2003，寄主：蘋果），由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)胡白石教授提供。

1.2試驗方法

1.2.1梨園氣溶膠中梨火疫病菌收集方法

2019年-2021年，每年春季（4月下旬）、夏季（6月中旬）、秋季（9月中旬）3個季節(jié)，將病原菌孢子捕捉器（河南云飛科技發(fā)展有限公司）放置于梨園中兩行‘香梨’樹中間，載玻片（長×寬=8cm×3cm，采集面積為24cm2）上涂抹凡士林后放入孢子捕捉器內(nèi)并設(shè)定放置時間。收集完成的載玻片樣本放入50mL無菌離心管中，帶回實驗室用移液器吸取5mL無菌水重復(fù)沖洗載玻片6次，制備成氣溶膠懸浮液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。病原菌孢子捕捉器放置按照以?種方法：

1）重度發(fā)病梨園不同空間高度收集：在梨園中兩行‘香梨’樹的中間，距離梨樹2.5m處放置孢子捕捉器，設(shè)置3個放置高度，分別距地面50、100、150cm，每個高度放置1個孢子捕捉器，重復(fù)3次，收集時間1h。

2）不同發(fā)病程度梨園收集：在健康、輕度、中度、重度發(fā)病4種梨園，每種梨園選擇3個，每個梨園在兩行梨樹中間距地面高度100cm處放置1個孢子捕捉器，重復(fù)3次，收集時間1h。

3）同一高度不同時間收集：在重度發(fā)病梨園的同一株香梨樹下，距離樹干2.5m，距地面高度100cm處放置孢子捕捉器，收集時間分別設(shè)置為2、5、10、15、20、30、45、60min，每個時間點重復(fù)3次，共計24份樣本。

1.2.2病原菌分離、純化

接種環(huán)蘸取氣溶膠懸浮液在牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基上劃線分離，28℃，倒置培養(yǎng)48h后觀察菌落形態(tài)。挑取乳白色、表面光滑且凸起、有光澤的疑似單菌落，轉(zhuǎn)皿至新鮮NA培養(yǎng)基上，重復(fù)操作3次，用于后續(xù)致病性測定。

1.2.3致病性測試

1.2.3.1接種菌懸液制備

將從氣溶膠中分離純化得到的96株疑似梨火疫病菌菌株轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)48h，挑取單菌落接種于NB培養(yǎng)液中，28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)24h，將OD600值為0.4的菌液作為接種菌懸液。

1.2.3.2離體枝條接種

采集生長一致的健康一年生‘香梨’枝條，剪成25cm莖段，75%乙醇消毒后，插入裝有無菌水的三角瓶中，每瓶插入1個枝條。用噴壺將1×108 cfu/mL的菌懸液均勻噴在待接種枝條上，每處理接種3個枝條，重復(fù)3次，以無菌水為對照。接種后置于室內(nèi)培育架上，在L∥D=12h∥12h，溫度27～28℃、相對濕度75%條件下培養(yǎng)，記錄發(fā)病情況。

1.2.3.3梨幼果接種

取健康‘香梨’幼果用70%乙醇浸泡10min后，用滅菌解剖刀橫切為二，用滅菌牙簽蘸取濃度為1×108cfu/mL菌液分別在兩個橫切面上均勻接種6個點，然后放入90mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放置于鋪滅菌吸水紙的托盤中，保鮮膜封口，在L∥D=12h∥12h，27～28℃條件下保濕培養(yǎng)。記錄梨幼果菌膿出現(xiàn)的時間。

1.2.3.4離體葉片接種

設(shè)置接種菌液濃度為1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109cfu/mL，以無菌水為對照，共8個處理，每處理接種3片香梨葉片，重復(fù)3次。挑選健康、生長期一致的葉片，置于墊有滅菌濕濾紙的90mm培養(yǎng)皿上。用滅菌牙簽在葉片基部葉柄處針刺1個傷口，取5uL菌液滴在傷口處，培養(yǎng)條件同1.2.3.3。記錄葉片發(fā)病情況。

1.2.3.5溫室幼苗接種

用滅菌牙簽在盆栽‘小葉刺’杜梨苗枝條上針刺10處傷口，將濃度為1×108cfu/mL的菌懸液均勻地噴于待接種枝條上，1盆杜梨幼苗為1個處理，重復(fù)3次，無菌水為對照，其他條件同上，接種后5～7d調(diào)查記錄發(fā)病情況。

1.2.4致病菌的再分離

1.2.4.1溫室幼苗、幼嫩組織致病菌再分離

取離體枝條發(fā)病幼莖（剪成0.5～1cm的小段）、離體發(fā)病葉片（剪成1×1cm左右小塊）和溫室發(fā)病幼苗枝條，先用75%乙醇表面消毒30s，再用1%次氯酸鈉消毒1min，無菌水沖洗3遍，用滅菌吸水紙吸干水分后轉(zhuǎn)移至研缽中，加入PBS緩沖液研磨，浸泡15min，使用接種環(huán)蘸取研磨液，在NA培養(yǎng)基平板劃線分離。

1.2.4.2梨果實致病菌再分離

發(fā)病梨果保濕培養(yǎng)5d后，取變黑腐爛的果實，挑取果實表面菌膿或腐爛物，在NA培養(yǎng)基上劃線分離。

1.2.5致病菌的測序鑒定

1.2.5.1總DNA提取

選取致病性測試后有發(fā)病癥狀的組織，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），參照說明書提取總DNA。

1.2.5.2PCR擴增及測序

參照胡白石、袁英哲等方法，使用梨火疫病菌的特異性引物P29B/P29A進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增體系（25uL）：2×Taq PCR mix 12.5uL，引物P29B/P29A（10umol/L）各1uL，DNA uL，ddH90 9.5uL;反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸8min。選取陽性產(chǎn)物送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司雙向測序，所得序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析。

1.2.6氣溶膠中梨火疫病菌的定量檢測

1.2.6.1氣溶膠樣品處理與DNA提取

從重度、中度和輕度發(fā)病的果園中分別隨機選取10份氣溶膠樣本，用無菌水沖洗載玻片收集的氣溶膠樣本于50mL無菌離心管中，12000r/min離心10min，棄上清，用200uL無菌水沖洗離心管底部，混勻，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

1.2.6.2熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序

參照袁英哲等，錢國良等的方法進(jìn)行熒光定量PCR。使用AceQ Universal U+Probe MasterMix（Vazyme）進(jìn)行PCR擴增，每個樣品重復(fù)3次，以無菌超純水為陰性對照。反應(yīng)體系（20uL）：Mix 10 uL，10umol/L上、下游引物各1.5uL，探針0.4uL，DNA模板2.0UL，超純水補足至20uL;擴增條件：95℃ 5min；95℃ 15s，60℃ 1min，40個循環(huán)。檢測引物及探針序列分別為：Ams116F（5'-TCCCACATACTGTGAATCATCCA-3'）， Arns189R（5-GGGTATTTGCGCTAATTTTATTCG-3'），和Ams14IT （5'-FAM-CCAGAATCTGGCCCGCGT-ATACCG-TAMRA-3'）。

1.2.6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

利用細(xì)菌濁度計對培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株（E．a(chǎn)Y2003）菌懸液進(jìn)行計數(shù)，并把菌懸液稀釋到1×108 cfu/mL，再進(jìn)行5倍梯度稀釋，得到1×108、2×107、4×106、8×105、1.6×105、3.2×104 cfu/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌液。各取2．0uL菌液為模板進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)Ct值與菌液濃度對數(shù)值的線性關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到定量計算方程。根據(jù)檢測樣品的Ct值，由方程計算檢測樣品的菌落數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1氣溶膠中梨火疫病菌的分離結(jié)果

2019年-2021年在梨園中共采集氣溶膠樣本1368份，分離出攜帶疑似梨火疫病菌的樣本96份（表1）。健康梨園內(nèi)未分離到梨火疫病菌；春季僅在重度梨園內(nèi)分離到疑似梨火疫病菌；夏季健康，輕、中、重度發(fā)病梨園中均未分離到疑似梨火疫病菌；秋季梨園中分離到的疑似梨火疫病菌較多。重度發(fā)病梨園同一高度（100cm），收集時間為2、5、10、15min時沒有分離到疑似梨火疫病菌，收集時間為20、30、45min和60min時可分離到疑似梨火疫病菌，收集時間越長分離到病菌的氣溶膠樣本越多。分離出的96份疑似梨火疫病菌樣本，其中春季28份，夏季0份，秋季68份。

2.2致病性測定結(jié)果

2019年，對分離出的27份疑似梨火疫病菌菌株進(jìn)行致病性測定，其中離體枝條接種、果實接種、溫室盆栽杜梨苗接種，菌懸液濃度為1×108 cfu/mL時可致病，離體葉片接種在菌懸液濃度為1×105～1×109cfu/mL均可致病。

2020年，對分離出的34份疑似梨火疫病菌菌株，使用離體枝條接種法、溫室盆栽杜梨苗接種法進(jìn)行致病性測定，在菌懸液濃度為1×108 cfu/mL時可致病。

2021年，對分離出的35份疑似梨火疫病菌株，使用離體枝條接種法、果實接種法進(jìn)行致病性測定，菌懸液濃度為1×108 cfu/mL時可致?。▓D1）。

2.3接種致病菌的梨樣品PCR檢測

剪取致病性測定后有發(fā)病癥狀的葉片、枝條、果實，提取基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，均擴增得到900bp的片段（圖2）。對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，在GenBank中進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果表明，所得序列與GenBank中（登錄號：CP050241.1）的序列相似性在99%以上，確定為梨火疫病菌（表2）。

2.4標(biāo)準(zhǔn)菌液標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果顯示，每個濃度重復(fù)檢測3次，結(jié)果基本一致，重復(fù)性較好。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-3.191x+48.007。R2為0.996，可信度較高。擴增效率（E）為105.8%，擴增效率較理想。同批檢測樣品的Ct值帶入定量計算方程式便可獲得總菌落數(shù)cfu/（24cm2．h）。

2.5梨園氣溶膠樣本的實時熒光定量PCR檢測

病原孢子捕捉器從重度、中度和輕度發(fā)病梨園氣溶膠中收集到的病菌，通過實時熒光定量PCR檢測（表3），結(jié)果均為陽性。從30份樣品中均可檢測出不同數(shù)量的梨火疫病菌，其中最高值2. 81×104 cfu/（24cm2．h），最小值8.50×102 cfu/（24cm2·h）。重度發(fā)病果園總菌落數(shù)平均值為8.74×103cfu/（24cm2．h），中度發(fā)病果園總菌落數(shù)平均值為4.55×103 cfu/（24cm2·h），輕度發(fā)病果園總菌落數(shù)平均值為2.36×103 cfu/（24cm2·h）。健康果園在3個季節(jié)的氣溶膠檢測中均未測到梨火疫病菌，在輕度、中度、重度發(fā)病果園內(nèi)氣溶膠中檢測出梨火疫病菌。且氣溶膠中的梨火疫病菌含量與果園田間發(fā)病程度呈正相關(guān)性。

3結(jié)論與討論

梨園氣溶膠中梨火疫病菌分離試驗結(jié)果顯示，在春季（4月下旬）、夏季（6月中旬）采集的氣溶膠樣本中，春季只有重度發(fā)病梨園中攜帶梨火疫病菌，夏季檢測不到梨火疫病菌，而秋季（9月中旬）在不同發(fā)病程度梨園采集的氣溶膠中均檢測到梨火疫病菌，說明秋季梨園空氣中氣溶膠攜帶梨火疫病菌的濃度高于春季、夏季梨園。該試驗結(jié)果與梨園梨火疫病發(fā)病規(guī)律相符。春季為果樹生長初期，梨火疫病發(fā)病率低，擴散至空氣中的病菌少，因此只有重度發(fā)病梨園檢測到梨火疫病菌；夏季是果樹生長期，氣溫較高，在30℃以上（梨火疫病的適宜溫度為25～28℃），不利于梨火疫病菌的繁殖和擴展蔓延；秋季，經(jīng)過整個生長季節(jié)的積累以及適宜的氣候條件（秋季有一定量的雨水），梨火疫病發(fā)病率高，擴散至空氣中的梨火疫病菌也較多，隨著空氣的流動，整個疫區(qū)梨園空氣中均攜帶梨火疫病菌。因此，根據(jù)秋季是梨火疫病發(fā)病高峰期的特點，秋冬季防控應(yīng)以修剪病枯枝、藥劑清園為主，即在9月下旬至10月中旬果實采收后進(jìn)行清園，對病枯枝進(jìn)行全面修剪并及時清除，同時選用46%氫氧化銅水分散粒劑或33.5%喹啉銅懸浮劑進(jìn)行藥劑清園，噴淋樹體，降低病原越冬基數(shù)。

Southey等報道，梨火疫病菌在相對濕度40%～90%時附著在空氣中小顆粒表面可以很好地存活下來，模擬氣溶膠在露天環(huán)境暴露2h仍有大量病菌存活。含有歐文氏菌Erwinia spp．的氣溶膠至少可存活1h。Crosse等研究發(fā)現(xiàn)，在良好的環(huán)境條件下，葉片損傷是蘋果芽感染解淀粉歐文氏菌E．a(chǎn)mylooora的誘發(fā)因素，氣溶膠落在蘋果芽上，細(xì)菌會迅速繁殖，蘋果感染E．a(chǎn)rnylouora與風(fēng)導(dǎo)致的葉片損傷有關(guān)。盡管每個氣溶膠顆粒攜帶細(xì)菌數(shù)量很低，但其可能是E．a(chǎn)rnylovora流行病學(xué)上的重要來源。McManus等的研究也表明，風(fēng)、降雨是E．a(chǎn)rnylovora在苗圃中傳播的最重要因素，他們利用空氣微生物采樣器收集空氣樣本，調(diào)查了梨火疫病菌在風(fēng)雨形成的氣溶膠內(nèi)懸浮的可能性，結(jié)果在所有收集的風(fēng)雨形成的空氣樣本中均檢測到梨火疫病菌，而在干燥空氣中收集的樣本幾乎不含病菌。本試驗夏季梨園氣溶膠樣本中檢測不到梨火疫病菌的結(jié)果與此結(jié)果相符。

本試驗采用病原孢子捕捉器有效地收集到梨園氣溶膠中的梨火疫病菌，且氣溶膠中攜帶的梨火疫病菌具有致病性。由此推斷梨園氣溶膠中攜帶的梨火疫病菌可能造成梨火疫病流行，是梨火疫病的傳播途徑之一。