棉花EXO70基因家族全基因組的鑒定及種間比較

董琰鈺，徐碧玉，董澤宇，汪露瑤，陳錦文，方磊

棉花EXO70基因家族全基因組的鑒定及種間比較

董琰鈺，徐碧玉，董澤宇，汪露瑤，陳錦文，方磊

浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 310058

【目的】當(dāng)前四倍體棉花的主栽品種是陸地棉與海島棉，陸地棉產(chǎn)量高且適應(yīng)性好，海島棉纖維品質(zhì)優(yōu)異但產(chǎn)量一般。EXO70是胞外分泌體（exocyst complex）中的關(guān)鍵亞基，在植物生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。通過全基因組水平鑒定和分析陸地棉與海島棉EXO70基因家族成員，并研究其在纖維發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)等方面的功能，有助于揭示陸地棉與海島棉種間性狀差異形成的分子基礎(chǔ)。【方法】從擬南芥數(shù)據(jù)庫（TAIR）獲取EXO70家族蛋白序列作為參考序列，采用HMMER、ExPASy、MEME、TBtools等分析工具對(duì)陸地棉TM-1和海島棉Hai7124基因組中EXO70家族成員進(jìn)行鑒定與分析，系統(tǒng)比較該家族在基因表達(dá)模式、重要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性、逆境響應(yīng)等方面的異同點(diǎn)?！窘Y(jié)果】通過對(duì)陸地棉和海島棉的基因組水平分析，均鑒定出54個(gè)EXO70家族成員，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育可將其分為8個(gè)分支。陸地棉和海島棉同源基因可一一對(duì)應(yīng)，分布在陸地棉與海島棉的20條染色體上，絕大多數(shù)成員為單外顯子，但是兩者間有12對(duì)同源基因在閱讀框序列上存在較大差異。陸地棉與海島棉大部分同源基因表達(dá)模式類似，但在同一纖維發(fā)育時(shí)期表達(dá)量存在差異，如分支A中的與同源基因。重要農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)，海島棉有16個(gè)EXO70基因與纖維品質(zhì)性狀顯著相關(guān)，多于陸地棉；陸地棉有13個(gè)基因與產(chǎn)量性狀衣分顯著相關(guān)，多于海島棉。發(fā)現(xiàn)部分性狀關(guān)聯(lián)的差異可能由海陸種間的基因結(jié)構(gòu)差異造成，如和。在不同逆境脅迫下，陸地棉中有25個(gè)基因受誘導(dǎo)，顯著多于海島棉中10個(gè)受誘導(dǎo)基因。【結(jié)論】在棉花四倍體形成、分化與馴化過程中，陸地棉與海島棉EXO70家族基因序列結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，基因表達(dá)模式也保持較高的一致性。海島棉有更多的EXO70基因與纖維品質(zhì)性狀相關(guān)，陸地棉有更多的基因與產(chǎn)量性狀相關(guān)且對(duì)環(huán)境逆境更為敏感。

陸地棉；海島棉；EXO70基因家族；表達(dá)模式；性狀關(guān)聯(lián)分析；逆境響應(yīng)

0 引言

【研究意義】棉花是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，陸地棉（）與海島棉（）是目前最主要的2個(gè)棉花栽培種。陸地棉產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)，而海島棉產(chǎn)量低但纖維品質(zhì)較好，因此，研究陸地棉適應(yīng)性強(qiáng)和海島棉纖維品質(zhì)好的相關(guān)基因?qū)τ谂嘤呖箖?yōu)質(zhì)的棉花新品種具有重要意義。EXO70（exocyst component of 70 kDa）是控制囊泡運(yùn)輸?shù)闹匾騕1]，參與細(xì)胞壁形成、細(xì)胞分泌和抗逆應(yīng)答等重要細(xì)胞學(xué)過程。鑒定陸地棉和海島棉的EXO70家族基因，可為揭示EXO70在棉花生長發(fā)育尤其是纖維發(fā)育中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，進(jìn)行該類基因與重要農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析為挖掘關(guān)鍵EXO70基因找到切入點(diǎn)，分析和對(duì)比該類基因在陸地棉、海島棉中的表達(dá)模式，將為深入探究EXO70調(diào)控機(jī)制奠定參考基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】囊泡運(yùn)輸是真核細(xì)胞中一種關(guān)鍵的跨膜運(yùn)輸和物質(zhì)交流方式，用于轉(zhuǎn)運(yùn)大分子等無法直接穿越細(xì)胞膜和質(zhì)膜的物質(zhì)[2]，為細(xì)胞的分裂、生長、形態(tài)建成和極性建立等基本的生理活動(dòng)運(yùn)送原料或傳遞信號(hào)[3]。經(jīng)典的囊泡運(yùn)輸可劃分為4個(gè)過程：出芽（小泡形成）、轉(zhuǎn)運(yùn)（沿細(xì)胞骨架運(yùn)輸）、拴系（兩膜最初接觸）、膜融合（運(yùn)輸完成），由拴系因子介導(dǎo)的拴系過程是膜融合發(fā)生的必要條件[4]。Exocyst復(fù)合體是重要的拴系因子之一，是由SEC3（Secretory3）、SEC5、SEC6、SEC8、SEC10、SEC15、EXO70和EXO84（exocyst component of 84 kDa）組成的八亞基復(fù)合體[5-8]。EXO70是Exocyst復(fù)合體的關(guān)鍵亞基[9]，決定胞吐時(shí)的靶標(biāo)膜位點(diǎn)。近年來，越來越多植物中EXO70基因家族成員的功能研究被報(bào)道，主要集中在調(diào)控花粉管伸長和極化、根毛生長、細(xì)胞壁物質(zhì)沉積、細(xì)胞板激活和成熟、防御和自噬方面[10-15]，廣泛參與植物生長發(fā)育和免疫反應(yīng)。在植物生長方面，擬南芥影響細(xì)胞板的組裝、導(dǎo)管組織分化及運(yùn)輸、凱氏帶及次生壁的形成[11, 16-17]；和參與調(diào)節(jié)花粉管的極性生長與成熟[1, 18]；突變會(huì)影響水稻對(duì)礦質(zhì)營養(yǎng)素的吸收及維管束的分化[19]。在免疫調(diào)節(jié)方面，擬南芥EXO70B1和EXO70B2蛋白可以相互作用調(diào)節(jié)鞭毛受體蛋白（FLS2）向質(zhì)膜的運(yùn)輸，從而參與植物的免疫調(diào)節(jié)[12]。水稻與AVR-Pii互作，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)免疫過程[20]；沉默煙草中的2個(gè)EXO70B基因可以增加植株對(duì)晚疫病菌的感病性[21]。在不同逆境脅迫條件下，葡萄中14個(gè)EXO70基因的表達(dá)有顯著差異，這些基因在抗逆調(diào)控中起重要作用[22]。目前，對(duì)于棉花EXO70家族的報(bào)道主要集中在抗逆與免疫調(diào)節(jié)方面。在棉花應(yīng)對(duì)鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用，并且還與自噬相關(guān)[23]。2021年，Zhu等[24]在亞洲棉、雷蒙德氏棉、陸地棉和海島棉共鑒定到165個(gè)EXO70基因，系統(tǒng)發(fā)育分析表明擬南芥與棉花這兩種雙子葉植物中EXO70基因相似。通過VIGS技術(shù)沉默陸地棉驗(yàn)證基因功能，揭示了棉花EXO70基因可能廣泛參與代謝，也可能影響植物激素的生物合成和分布[24]。【本研究切入點(diǎn)】雖然關(guān)于棉花EXO70基因家族及部分棉花EXO70基因的功能已有相關(guān)報(bào)道，但還未見針對(duì)陸地棉與海島棉EXO70家族成員的組織表達(dá)及關(guān)聯(lián)重要農(nóng)藝性狀的海陸種間比較研究，且EXO70家族成員對(duì)棉花纖維發(fā)育的影響尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于陸地棉和海島棉基因組數(shù)據(jù)和二者不同組織及逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行海島棉和陸地棉的EXO70基因家族全基因組鑒定和種間比較分析等工作，旨在揭示EXO70基因家族在生長發(fā)育過程和抗逆境脅迫過程中的作用，結(jié)合陸地棉與海島棉EXO70基因各自優(yōu)勢可進(jìn)一步應(yīng)用于棉花選育與改良方面。

1 材料與方法

1.1 棉花EXO70基因家族成員的全基因組鑒定

為了鑒定EXO70基因家族成員，從Cottonomics數(shù)據(jù)庫（http://cotton.zju.edu.cn/）[25]中下載異源四倍體陸地棉TM-1（v2.1）、異源四倍體海島棉Hai7124（v1.1）基因組序列及基因注釋文件（general feature format，GFF），從Pfam[26]數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）中下載EXO70蛋白結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型（編號(hào)PF3081），從擬南芥基因組網(wǎng)站（https://www.arabidopsis. org/）下載已報(bào)道的擬南芥EXO70蛋白的氨基酸序列。利用HMMER 3.0軟件的hmmsearch搜索程序鑒定棉花全基因組中含有EXO70保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，同時(shí)，利用BLAST+v2.6.0[27]搜索棉花全基因組中與已報(bào)道的擬南芥EXO70蛋白的氨基酸序列最相近的蛋白序列（值＜1×10-5），將所獲得的EXO70蛋白序列提交至NCBI網(wǎng)站的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（conserved domain database，CDD）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證。

1.2 棉花EXO70基因家族成員蛋白序列的理化性質(zhì)分析

根據(jù)陸地棉與海島棉注釋文件，通過ExPASy在線網(wǎng)站（http://cn.expasy.org/tools）對(duì)GhEXO70和GbEXO70蛋白序列的等電點(diǎn)（isoelectric point，）、相對(duì)分子質(zhì)量（relative molecular mass，Mr）、親水性平均系數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY）等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。

1.3 棉花EXO70基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及保守基序分析

利用MEGA 11.0軟件中的MUSCLE對(duì)擬南芥、海島棉、陸地棉的EXO70家族成員的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用最大似然法自動(dòng)選擇最佳替代模型，自展值（bootstrap value）設(shè)為1 000構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用iTOL（https://itol.embl.de/）對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。通過MEME程序[28]對(duì)家族成員進(jìn)行基序分析（最大發(fā)現(xiàn)數(shù)設(shè)為20）。通過陸地棉與海島棉基因組注釋文件，利用TBtools[29]軟件對(duì)EXO70基因的基因結(jié)構(gòu)及保守基序進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

1.4 棉花EXO70基因家族成員種內(nèi)共線性分析

通過MCScanX[30]軟件對(duì)海島棉和陸地棉中EXO70基因進(jìn)行共線性分析，鑒定基因復(fù)制事件，用Circos[31]對(duì)共線性分析結(jié)果進(jìn)行可視化，參數(shù)均使用軟件默認(rèn)參數(shù)。利用TBTools軟件分別計(jì)算陸地棉和海島棉復(fù)制基因?qū)Φ姆峭x突變率（non-synonymous mutation rate，Ka）、同義突變率（synonymous mutation rate，Ks）和二者的比值（Ka/Ks）。

1.5 棉花EXO70基因家族不同組織中的表達(dá)模式分析

從Cottonomics數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫中下載海島棉與陸地棉不同組織、不同纖維發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)編號(hào)為PRJNA490626。使用軟件fastp[32]過濾以獲得高質(zhì)量讀長，使用HISAT2（v2.1）[33]將高質(zhì)量讀長比對(duì)到TM-1參考基因組或Hai7124參考基因組上，使用featureCounts 2.0.0[34]對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量，計(jì)算EXO70基因的表達(dá)分度FPKM值以評(píng)估基因的表達(dá)水平。取陸地棉和海島棉葉、根、莖、花瓣及以開花后天數(shù)（day post-anthesis，DPA）計(jì)算的纖維發(fā)育時(shí)期（0、1、3、5、10、20和25 DPA）的EXO70家族基因FPKM數(shù)據(jù)，利用R語言做組織表達(dá)模式可視化分析。

1.6 棉花EXO70基因家族主要纖維發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)分析

采用陌凡生物公司EASYspin PLUS植物RNA快速提取試劑盒，提取2021年種植在杭州市永安基地的陸地棉TM-1的0 DPA、3 DPA、5 DPA和10 DPA的RNA，分別取3 μl總RNA用諾唯贊公司的HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)后的cDNA稀釋為100—200 ng·μl-1。選擇作為內(nèi)參基因，隨機(jī)挑選4個(gè)基因（、、和）進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系選用ChamQ SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊）體系。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，用2-ΔΔCt方法計(jì)算該基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 棉花EXO70基因家族成員關(guān)于重要農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

下載陸地棉群體和海島棉群體遺傳變異信息和對(duì)應(yīng)的表型數(shù)據(jù)[35-37]，利用ANNOVAR軟件[38]分別對(duì)遺傳變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋，隨后基于非同義突變的分型對(duì)EXO70基因進(jìn)行單倍型分析。EXO70基因的不同單倍型的纖維品質(zhì)和產(chǎn)量相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀（即纖維長度、纖維強(qiáng)度和衣分）進(jìn)行差異分析（＜0.05），利用R語言可視化。

1.8 棉花EXO70基因家族逆境脅迫下表達(dá)模式分析

從Cottonomics數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫中下載海島棉與陸地棉不同逆境脅迫處理的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)（編號(hào)PRJNA490626）。原始數(shù)據(jù)的處理和基因表達(dá)量的計(jì)算方法同1.5，以FPKM=1作為條件進(jìn)行過濾，即FPKM＞1的基因視為表達(dá)，若所有組織中FPKM＜1的基因視為不表達(dá)，不表達(dá)的基因過濾不進(jìn)行差異基因分析。基于基因轉(zhuǎn)移格式（gene transfer format，GTF）的注釋文件和DESeq2軟件包對(duì)陸地棉和海島棉應(yīng)對(duì)逆境脅迫差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）進(jìn)行鑒定并篩選，差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為取偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）矯正后的＜0.05。對(duì)應(yīng)逆境脅迫條件下篩選到的差異基因也即受到脅迫誘導(dǎo)的基因記為“1”，其他記為“0”，并用R語言可視化標(biāo)記EXO70家族基因是否受到脅迫誘導(dǎo)。

2 結(jié)果

2.1 棉花EXO70基因家族成員的鑒定和分布

通過序列相似性與保守結(jié)構(gòu)域搜索在陸地棉TM-1和海島棉Hai7124基因組中均鑒定到了54個(gè)EXO70家族基因。以擬南芥、陸地棉和海島棉EXO70氨基酸序列構(gòu)建棉花EXO70家族成員系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），所有EXO70可分為8個(gè)分支，每個(gè)分支的成員數(shù)量不等但各分支內(nèi)海島棉和陸地棉EXO70基因數(shù)量相同，分支A、B、C、D、E、F、G和H中的陸地棉成員數(shù)量分別為4、2、9、4、9、4、7和15個(gè)。從鑒定家族成員與系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育來看，陸地棉與海島棉在EXO70家族的每個(gè)分支數(shù)量保持一致，并且陸地棉與海島棉同源基因能夠一一對(duì)應(yīng)，表明EXO70基因家族在海島棉與陸地棉分化過程中相對(duì)保守。

圖1 擬南芥（At）、陸地棉（Gh）和海島棉（Gb）EXO70基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 棉花EXO70家族成員的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征

通過對(duì)陸地棉EXO70家族成員編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析（電子附表1）。EXO70家族成員編碼的肽鏈由310—743個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量介于34 871.98—86 021.92 Da，平均值為71 029.997 Da；理論等電點(diǎn)介于4.84—8.94，平均值為6.22，多數(shù)偏酸性；蛋白不穩(wěn)定指數(shù)介于37.42—61.76，平均值為46.32，其中8個(gè)EXO70成員為穩(wěn)定蛋白（蛋白不穩(wěn)定指數(shù)＜40），其余的46個(gè)基因?yàn)椴环€(wěn)定蛋白（蛋白不穩(wěn)定指數(shù)＞40）。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，EXO70家族基因主要定位于葉綠體、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)以及線粒體中，其中，有48個(gè)基因定位在細(xì)胞核中，22個(gè)定位在葉綠體上，9個(gè)定位在細(xì)胞質(zhì)中，4個(gè)定位在線粒體上，以細(xì)胞核中分布最廣泛。海島棉家族成員理化性質(zhì)（電子附表2）與陸地棉類似，無明顯差異。

2.3 棉花EXO70基因家族保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析及比較

通過對(duì)陸地棉與海島棉EXO70家族的保守基序、基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行查詢和比較后發(fā)現(xiàn)，同一分支中的海陸同源基因含有相似的保守基序和外顯子結(jié)構(gòu)。保守基序分析（圖2）將預(yù)測到的20種基序依次命名為motif 1—motif 20。同一分支的蛋白序列呈現(xiàn)相似的保守基序排列方式，不同EXO70蛋白所包含的保守基序數(shù)目及種類存在差異。陸地棉與海島棉EXO70蛋白中，基序種類最少的蛋白僅含8種，而最多的含有19種motif，說明家族中的一些成員在保守基序上存在差異。陸地棉和海島棉除了分支A的全部成員與分支G的個(gè)別成員，其他成員都為單外顯子基因。從基因長度來看，不同的基因具有相似長度的編碼區(qū)序列，說明EXO70基因在進(jìn)化過程中內(nèi)含子長度存在較大的變異，這可能是導(dǎo)致其功能多樣化的原因之一。

通過對(duì)比陸地棉和海島棉同源基因全長序列與編碼序列，發(fā)現(xiàn)有12對(duì)陸地棉海島棉同源基因編碼序列有差異（電子附表3）。其中，編碼序列差異較大的有6對(duì)同源基因集中在分支H中，如的長度小于陸地棉同源基因，且氨基酸數(shù)目比后者少83個(gè)。此外，分支A中的海島棉的編碼序列比它在陸地棉中的同源基因長1 035 bp，相應(yīng)氨基酸數(shù)目多345個(gè)。分析對(duì)比外顯子個(gè)數(shù)可知，在54對(duì)陸地棉海島棉同源基因中，45對(duì)同源基因?yàn)閱瓮怙@子，6對(duì)多外顯子，其余3對(duì)同源基因外顯子個(gè)數(shù)存在差異。如有2個(gè)外顯子，而海島棉同源基因?yàn)閱瓮怙@子基因。

2.4 棉花EXO70基因家族成員的共線性分析

對(duì)陸地棉和海島棉中EXO70基因分別進(jìn)行種內(nèi)共線性分析，對(duì)該家族成員進(jìn)行復(fù)制基因比對(duì)。在陸地棉中共檢測出108個(gè)同源基因?qū)Γ▓D3），其中，A、D亞組內(nèi)分別有23對(duì)、20對(duì)直系同源基因，A、D亞組間有65對(duì)旁系同源基因，這些同源基因?qū)Φ腒a/Ks值范圍在0.04—1.05（電子附表4）。而同源基因?qū)χ兄挥信c的Ka/Ks值大于1，為1.043。有6個(gè)同源基因?qū)Πl(fā)生同義突變，有22個(gè)基因沒有找到復(fù)制的同源基因?qū)?。在海島棉中共檢測出104個(gè)同源基因?qū)Γ▓D3），其中，A亞組內(nèi)有24對(duì)同源基因，D亞組內(nèi)有18對(duì)，A、D亞組間有62對(duì)旁系同源基因。這些同源基因?qū)Φ腒a/Ks值范圍在0.03—1.05（電子附表5），也只有與基因?qū)Φ腒a/Ks值＞1，為1.047。其中，有2個(gè)同源基因?qū)Πl(fā)生同義突變，有21個(gè)基因沒有找到復(fù)制的同源基因?qū)?。從圖3可知，陸地棉除了A亞組的第2、6和8染色體與D亞組的第2、6和8染色體沒有EXO70家族成員外，其他每條染色體上都至少含有一個(gè)EXO70基因，其中，A亞組第5染色體上最多，包含7個(gè)EXO70基因，海島棉EXO70基因在染色體上的分布情況與陸地棉一致。

但這個(gè)趨勢越來越明顯。像教育、家裝、交通，醫(yī)療，都在發(fā)生很大的變化，都出現(xiàn)了有一定代表性的網(wǎng)絡(luò)協(xié)同或智能商業(yè)的企業(yè)。

2.5 棉花EXO70家族基因組織表達(dá)模式分析及比較

根據(jù)已發(fā)表的陸地棉和海島棉不同組織和不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（電子附表5和電子附表6），比較分析陸地棉和海島棉EXO70基因的表達(dá)模式（圖4）?？傮w來看，不同EXO70家族分支呈現(xiàn)不同的表達(dá)規(guī)律，陸地棉和海島棉在同一分支中的表達(dá)趨勢又大致相似。在分支A中，陸地棉與海島棉存在4對(duì)同源基因在纖維發(fā)育時(shí)期較其他時(shí)期呈現(xiàn)優(yōu)勢表達(dá)，分支F中的4對(duì)同源基因與分支A情況一致。分支B中的2對(duì)同源基因都呈現(xiàn)組成型表達(dá)，在主要組織和纖維發(fā)育時(shí)期表達(dá)量都較高。陸地棉與海島棉在分支C與分支G中的成員在組織和胚珠纖維發(fā)育中表達(dá)量極低。由圖4可知，存在多數(shù)基因呈組成型表達(dá)，陸地棉中共有18個(gè)，海島棉中共有17個(gè)。陸地棉在纖維發(fā)育時(shí)期表達(dá)基因有34個(gè)，海島棉中有36個(gè)，多于陸地棉。

圖2 陸地棉（A）和海島棉（B）EXO70基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹、蛋白基序、超家族和基因結(jié)構(gòu)

圖3 陸地棉（A）與海島棉（B）EXO70家族種內(nèi)共線性分析

海島棉和陸地棉同源基因表達(dá)模式大致相似，但在纖維發(fā)育時(shí)期中，海島棉整體表達(dá)量高于陸地棉。如，分支C中的海島棉在纖維發(fā)育時(shí)期20 DPA時(shí)表達(dá)量高于同源基因（圖4）。從纖維整體發(fā)育時(shí)期來看，陸地棉與海島棉同源基因的表達(dá)峰值時(shí)期也有所差異。分支A中陸地棉與同源基因都在纖維發(fā)育后期表達(dá)較高（圖4），前者集中表達(dá)在10 DPA，而海島棉在20 DPA表達(dá)達(dá)到高峰并高于陸地棉，表達(dá)高峰較陸地棉延后。為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取4個(gè)基因設(shè)計(jì)引物（電子附表8）對(duì)其在纖維發(fā)育時(shí)期中的0、3、5和10 DPA進(jìn)行定量表達(dá)分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)表達(dá)趨勢均與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致（圖4和圖5）。

2.6 棉花EXO70家族與重要農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

通過對(duì)EXO70家族基因的不同單倍型的表型特征進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)15個(gè)陸地棉和18個(gè)海島棉的EXO70基因的不同單倍型存在顯著性差異（＜0.05）（電子附表9）。經(jīng)過分析對(duì)比可知，海島棉EXO70基因成員大部分與纖維長度和纖維強(qiáng)度這兩個(gè)纖維品質(zhì)性狀相關(guān)，陸地棉EXO70基因成員更多是與產(chǎn)量性狀衣分相關(guān)（電子附表9）。如圖6-A可知，與纖維長度性狀呈顯著相關(guān)的海島棉基因個(gè)數(shù)有15個(gè)，而陸地棉只有7個(gè)，與纖維強(qiáng)度性狀顯著相關(guān)的海島棉基因有16個(gè)，而陸地棉只有7個(gè)。在產(chǎn)量相關(guān)性狀——衣分方面，陸地棉與之顯著相關(guān)基因個(gè)數(shù)多于海島棉，分別為13和8個(gè)。分析比對(duì)同源基因可知，陸地棉與海島棉只有2對(duì)基因與纖維長度性狀相關(guān)聯(lián)，有3對(duì)同源基因與纖維強(qiáng)度相關(guān)聯(lián)，有2對(duì)同源基因與衣分相關(guān)聯(lián)。其中，只有分支B中的陸地棉和海島棉同源基因可找到與3個(gè)性狀同時(shí)關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。

結(jié)合EXO70家族成員基因結(jié)構(gòu)分析與基因關(guān)聯(lián)分析可知，基因結(jié)構(gòu)存在差異的陸地棉與海島棉同源基因，在關(guān)聯(lián)性狀時(shí)也有差異。如，在分支H中的陸地棉與同源基因海島棉編碼序列存在較大差異（圖6-B），前者相對(duì)于后者存在提前終止情況，而海島棉在A11:115905472位點(diǎn)處可顯著關(guān)聯(lián)纖維長度、纖維強(qiáng)度性狀但陸地棉同源基因在對(duì)應(yīng)位點(diǎn)無關(guān)聯(lián)性狀。分支A中存在編碼序列差異的與（電子附表3），海島棉在D09:42925528與D09:42925541 2個(gè)位點(diǎn)與纖維長度、纖維強(qiáng)度和衣分3個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)（電子附表8），而在陸地棉同源基因?qū)?yīng)位點(diǎn)處無性狀關(guān)聯(lián)。

圖5 4個(gè)基因在纖維發(fā)育時(shí)期的定量表達(dá)分析

結(jié)合組織表達(dá)模式與關(guān)聯(lián)分析結(jié)果可知，纖維發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異與基因關(guān)聯(lián)表型的差異相互印證。如，陸地棉在纖維發(fā)育時(shí)期基本不表達(dá)，而海島棉同源基因有表達(dá)，并且在20 DPA時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰（圖4），群體數(shù)據(jù)中顯示部分海島棉的 EXO基因可關(guān)聯(lián)纖維長度、纖維強(qiáng)度等纖維品質(zhì)性狀，而陸地棉并無EXO70基因與此類纖維相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)，且只能關(guān)聯(lián)到衣分這種產(chǎn)量性狀（電子附表9）。

2.7 棉花EXO70家族基因脅迫表達(dá)模式分析及比較

如圖7所示，在相同算法條件下，將脅迫處理中是否受誘導(dǎo)基因區(qū)分，陸地棉和海島棉的同源基因在應(yīng)對(duì)低溫（4 ℃）、高溫（37 ℃）、鹽脅迫（NaCl）、干旱脅迫（PEG）逆境條件下響應(yīng)表達(dá)有所不同。4種非生物脅迫條件下，陸地棉受逆境脅迫誘導(dǎo)的EXO70基因有25個(gè)，而海島棉只存在10個(gè)。整體數(shù)量上看，陸地棉要多于海島棉：在低溫4 ℃脅迫條件下，陸地棉受誘導(dǎo)基因有11個(gè)，海島棉中只有1個(gè)；在高溫37 ℃脅迫條件下，受誘導(dǎo)陸地棉基因個(gè)數(shù)為11，而海島棉為6個(gè)；在鹽（NaCl）脅迫條件下，陸地棉有14個(gè)基因受誘導(dǎo)，而海島棉中有2個(gè)；在干旱（PEG）脅迫條件下，陸地棉有4個(gè)基因受誘導(dǎo)，海島棉中也有4個(gè)。

不同進(jìn)化分支中，陸地棉與海島棉在4種非生物脅迫條件下受誘導(dǎo)情況各自都具有一定的偏好性。陸地棉受誘導(dǎo)基因分布在分支C、D、E、F、G和H中，集中分布于E和H這2個(gè)分支中。而海島棉受誘導(dǎo)基因存在于A、C和H中，在分支H中受誘導(dǎo)基因個(gè)數(shù)最多，為5個(gè)，占總海島棉EXO70整體受誘導(dǎo)基因個(gè)數(shù)的50%，其余分支不存在海島棉基因受誘導(dǎo)的情況。

對(duì)于同一分支中，陸地棉與海島棉同源基因在不同脅迫條件下受誘導(dǎo)情況也不同。例如，在分支H中的陸地棉在4 ℃與NaCl條件下都會(huì)受到誘導(dǎo)，而海島棉同源基因卻只在干旱條件（PEG）下受誘導(dǎo)。存在于分支C的陸地棉在高溫、低溫條件下都會(huì)受誘導(dǎo)，而同源基因只在高溫中存在誘導(dǎo)情況。

A：陸地棉（Gh）和海島棉（Gb）與纖維長度（FL）、纖維強(qiáng)度（FS）、衣分（LP）性狀呈顯著相關(guān)基因個(gè)數(shù)；B：GH_D09G1462與同源基因GB_D09G1473的基因結(jié)構(gòu)，和位于外顯子的非同義SNP（上部）；GB_D09G1473的2個(gè)非同義SNP的不同單倍型在纖維長度、纖維強(qiáng)度和衣分的差異；****表示在P＜0.05時(shí)單倍型間差異極顯著（t檢驗(yàn)）

3 討論

3.1 棉花EXO70基因家族的鑒定和表達(dá)分析為后續(xù)深入研究提供借鑒

陸地棉和海島棉是目前世界上最主要的2個(gè)棉花栽培種，且均已完成全基因組序列的測序和組裝工作[39-41]，這為本研究進(jìn)行海島棉和陸地棉中EXO70基因家族的鑒定和分析提供極有利的先決條件。本文從陸地棉（TM-1）、海島棉（Hai7124）2個(gè)四倍體栽培棉種中都分別鑒定出54個(gè)EXO70基因，說明EXO70這類多拷貝基因在四倍體棉花的分別進(jìn)化階段在數(shù)量上較為保守。二倍體擬南芥EXO70基因家族成員數(shù)是23個(gè)，本文鑒定出異源四倍體棉花EXO70家族成員數(shù)量是擬南芥的2.35倍，可能是因?yàn)槊藁ㄟM(jìn)化過程中發(fā)生了基因組的加倍和復(fù)制事件。近幾年，隨著測序技術(shù)的不斷更新和改進(jìn)，基因組測序和組裝的水平得到了大幅提高。這樣的技術(shù)進(jìn)展導(dǎo)致不同的基因組版本中基因注釋等信息存在一些差異。未來，整合多個(gè)版本的基因組信息和分子試驗(yàn)，可以更加有效和準(zhǔn)確地鑒定EXO70基因家族成員。酵母與大多數(shù)動(dòng)物的EXO70基因?yàn)閱慰截?，而大部分植物尤其是陸生植物中EXO70基因?yàn)槎嗫截?，這可能是因?yàn)橹参锞哂卸喾N多樣的細(xì)胞壁及復(fù)雜的液泡結(jié)構(gòu)，需要多種胞泌復(fù)合體滿足其適應(yīng)環(huán)境，進(jìn)而演化出不同基因特有的調(diào)控機(jī)制[42-43]，相關(guān)報(bào)道也證明不同的EXO70蛋白會(huì)參與細(xì)胞壁形成、細(xì)胞分泌和細(xì)胞免疫等不同的重要細(xì)胞學(xué)過程[44]。本研究鑒定的EXO70家族成員中既有組織特異型基因，也有少數(shù)組成型基因，這說明不同的棉花EXO70基因通過組織特異的表達(dá)模式參與不同組織的生長發(fā)育進(jìn)程。已有報(bào)道證明，在非生物脅迫下，囊泡運(yùn)輸相關(guān)蛋白可通過參與質(zhì)膜修復(fù)來增加植物對(duì)溫度等非生物脅迫的耐受性[28]，而在本研究的另一個(gè)表達(dá)模式——逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式研究中，不同分支的EXO70成員存在脅迫誘導(dǎo)多樣化、不同基因特異逆境誘導(dǎo)的情況，說明EXO70基因在棉花抗逆境脅迫過程中具有一定的功能。

熱圖表示基因在應(yīng)對(duì)非生物脅迫過程中，是否顯著差異表達(dá)（紅色，差異表達(dá)；白色，未差異表達(dá)）

3.2 EXO70家族基因在棉花進(jìn)化過程中具有保守性

陸地棉與海島棉EXO70家族同源基因結(jié)構(gòu)有所差異，并且外顯子的個(gè)數(shù)也有所不同，而內(nèi)含子-外顯子的基因結(jié)構(gòu)通常被認(rèn)為是進(jìn)化的印記[45]。陸地棉與海島棉同源基因存在的基因結(jié)構(gòu)差異，可能會(huì)導(dǎo)致二者基因表達(dá)的差異從而引起基因功能的不同。從種內(nèi)共線性分析來看，陸地棉與海島棉中存在發(fā)生同義突變的基因?qū)?，說明這些序列分歧度太大，進(jìn)化距離很遠(yuǎn)。此外，陸地棉與海島棉都只有1個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks值大于1，其余都小于1，說明這些基因是受到正向選擇，EXO70家族基因在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了較為強(qiáng)烈的凈化選擇[46]，暗示大部分EXO70基因進(jìn)化保守，功能穩(wěn)定。

3.3 EXO70家族可能參與棉花纖維發(fā)育過程

棉花纖維的各個(gè)發(fā)育時(shí)期對(duì)纖維品質(zhì)與產(chǎn)量都至關(guān)重要。棉花纖維是從棉花胚珠表皮單個(gè)細(xì)胞突起進(jìn)而發(fā)育形成，與擬南芥表皮毛形成過程類似，并且當(dāng)今學(xué)者普遍認(rèn)為二者表皮毛發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)類似[47]。在擬南芥表皮毛無胼胝質(zhì)的突變體中，功能缺失可導(dǎo)致表皮毛中胼胝質(zhì)合成酶PMR4分泌受阻，在毛狀體成熟階段細(xì)胞壁成分積累產(chǎn)生缺陷，而野生型毛狀體細(xì)胞壁可發(fā)生大量二次增厚[42, 48]。還有研究表明是在擬南芥氣管元件（tracheary element）發(fā)育過程中表達(dá)的基因，并在TE的囊泡運(yùn)輸中起作用從而調(diào)節(jié)細(xì)胞壁增厚[16]。本研究通過對(duì)比陸地棉與海島棉EXO70基因家族中同源基因在編碼序列、組織表達(dá)及重要農(nóng)藝性狀的基因關(guān)聯(lián)分析，可為后續(xù)棉花選育與改良方面結(jié)合陸地棉與海島棉優(yōu)勢基因，提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

陸地棉和海島棉均存在54個(gè)EXO70家族基因，在進(jìn)化過程中基因家族數(shù)目相對(duì)保守，但基因結(jié)構(gòu)序列存在部分差異，同源基因的分子功能也發(fā)生了分化。海島棉存在更多EXO70基因與纖維長度、強(qiáng)度等品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)，可能與其優(yōu)異的纖維品質(zhì)特性相關(guān)；陸地棉存在更多EXO70基因與衣分、籽指等產(chǎn)量性狀顯著關(guān)聯(lián)，并且具有更強(qiáng)的非生物脅迫響應(yīng)能力，可能與其高產(chǎn)、廣適性等特性相關(guān)。

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Genome-wide identification and interspecific comparative analysis of the EXO70 gene family in cotton

DONG YanYu, XU BiYu, DONG ZeYu, WANG LuYao, CHEN JinWen, FANG Lei

College of Agriculture & Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058

【Objective】The two main types of allotetraploid cotton that are currently cultivated are upland cotton, known for its high yield and good adaptability, and island cotton, which boasts excellent fiber quality but lower yield. EXO70, a vital subunit of the exocyst complex, plays a significant role in plant growth, development, and stress response. By identifying and analyzing members of the EXO70 gene family in upland and island cotton at the whole-genome level, and studying their functions in fiber development and environmental adaptation, we can shed light on the molecular basis for the differences in traits between these two varieties. 【Method】The reference sequences of EXO70 protein inwere obtained from the TAIR database. HMMER, ExPASy, MEME, TBtools, and other analysis tools were used to identify and analyze the members of EXO70 gene family in the genomes of upland cotton TM-1 and island cotton Hai7124. The similarities and differences in gene expression patterns, correlations with crucial agronomic traits, and stress responses of this family were systematically compared. 【Result】Through genome-level analysis of upland cotton and sea-island cotton, 54 EXO70 family members were identified in both upland and sea-island cotton, which could be divided into eight subgroups based on phylogenetic analysis. Orthologous genes between upland cotton and sea-island cotton can be paired one-to-one and are distributed across the 20 chromosomes of both species. The majority of the members have single exons, while 12 pairs of homologous genes displayed significant differences in the reading frame sequences. Most orthologous genes inanddisplay similar expression patterns, but differences in expression levels are observed during the same fiber development stage, such asand its orthologous geneand. Under different stresses, upland cotton showed a significantly higher number of induced genes compared to sea-island cotton. 【Conclusion】The sequence structure and gene expression patterns of the EXO70 family were found to be relatively conserved in both upland and island cotton during the formation, differentiation, and domestication of tetraploid cotton. However, in terms of EXO70 family members, island cotton had more genes related to fiber quality traits, while upland cotton had more genes related to yield traits and exhibited greater sensitivity to environmental stress.

;; EXO70 gene family; expression pattern; trait association analysis; abiotic stress response

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.23.005

2023-02-14；

2023-05-04

國家自然科學(xué)基金面上基金（32172008）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（226-2022-00153）

董琰鈺，E-mail：dongyy@zju.edu.cn。通信作者方磊，E-mail：fangl@zju.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）