乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究進展

趙海洋，張蓉，孫浩偉，包帥，田祚寧，曹永春

（1.北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，北京 100096；2.北京市農(nóng)林科學院水產(chǎn)科學研究所，北京 100068；3.昌邑市畜牧業(yè)發(fā)展中心，山東 濰坊 261300）

根據(jù)《2023 年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》報道，我國2022 年水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量為6 690.29 萬t，同比增長2.16%，養(yǎng)殖方式從粗放式走向精細化。但隨著單位水域養(yǎng)殖密度的增加，養(yǎng)殖水域的環(huán)境惡化，給病原微生物的傳播創(chuàng)造了有利的條件。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，健康管理和病害防治是關(guān)鍵，益生菌制劑的應用，已成為水產(chǎn)病害防治的重要技術(shù)手段之一。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用的一些傳統(tǒng)益生菌，并非魚類消化道原籍優(yōu)勢菌群，在魚類應用時，可能存在弊端和風險。而分離于動物腸道或養(yǎng)殖水體的微生物，制備成的微生態(tài)制劑，即原籍菌群[1]，可以避免排斥現(xiàn)象產(chǎn)生，在最大程度發(fā)揮益生功能的同時，保障腸道的微生態(tài)平衡，將受到的外來干擾降到最低，防止產(chǎn)生異常增殖[2]。

乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）作為腸道的“原籍菌”，是一類以碳水化合物為底物，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細菌的總稱，廣泛分布在人及動物的腸道、食品及環(huán)境中。乳酸菌屬于革蘭陽性菌，非孢子化，厭氧或兼性需氧，球或桿狀[3]，最佳生長pH 值一般在5.5～5.8，營養(yǎng)需求復雜，分為同發(fā)酵和雜發(fā)酵，同發(fā)酵從糖中產(chǎn)生乳酸，而雜發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙酸、酒精和二氧化碳[4-5]。乳酸菌進入腸道后，可迅速定植于腸道，形成優(yōu)勢菌群，代謝產(chǎn)生益生物質(zhì)，增強魚類免疫調(diào)節(jié)功能，改善魚類腸道結(jié)構(gòu)，促進魚類新陳代謝與生長，因而受到人們的廣泛關(guān)注[6]?，F(xiàn)簡述乳酸菌作為飼料添加劑的抗氧化作用機制及其在水生動物養(yǎng)殖中的應用現(xiàn)狀，以期為乳酸菌制劑在高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的進一步應用，提供理論依據(jù)。

1 乳酸菌分類

1.1 乳桿菌屬

乳桿菌屬為長桿狀或球狀，通常成短鏈。革蘭陽性，不生孢，兼性厭氧，有時微好氧，在有氧時生長差，降低氧壓時生長較好。存在廣泛，嗜酸性，最適pH 值為5.5～6.0，pH 值在3.0～4.5 時仍能生存，在乳桿菌中，植物乳桿菌是被研究最多的菌株。Piccolo等[7]評估了植物乳桿菌對歐洲海鱸的生長性能和血清生化參數(shù)的影響，補充植物乳桿菌喂養(yǎng)90 d，對生長性能有明顯的影響，血清生化參數(shù)中的總膽固醇和甘油三酯也有明顯增加。Soltani 等[8]在80 d 的喂養(yǎng)試驗中，研究了3 種不同劑量的植物乳桿菌，對鯉生長和血液免疫學參數(shù)的影響，結(jié)果顯示，植物乳桿菌使鯉的生長性能和血液免疫指標有正增長，具有明顯較高的溶菌酶和堿性磷酸酶，還可以提高鯉對嗜水氣單胞菌引起的動靜脈敗血癥的抗病能力。Kane 等[9]評估了植物乳桿菌，對用鏈球菌和乳酸菌疫苗處理的虹鱒的血清生化以及免疫反應的影響，結(jié)果顯示，給免疫后的魚喂食植物乳桿菌，引起免疫參數(shù)如溶菌酶、替代補體活性、白細胞和淋巴細胞總數(shù)以及血清生化參數(shù)等明顯增加。

1.2 片球菌屬

片球菌屬革蘭染色為陽性，球狀，直徑1.2～2.0 μm，菌體排列成四聯(lián)狀，也可成對排列，單個細胞罕見，不形成鏈狀，不運動，不產(chǎn)芽孢。兼性厭氧，有的菌株在有氧時會抑制生長。在過去的十幾年中，人們關(guān)注水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的片球菌屬益生菌，大多數(shù)研究都集中在乳酸片球菌方面。飼料中添加乳酸片球菌，對斑馬魚精子質(zhì)量有影響，用益生菌處理斑雄性馬魚10 d 后，發(fā)現(xiàn)與雄性和精子質(zhì)量有關(guān)的選定基因有明顯的上調(diào)[10]。Hoseinifar 等[11]研究了虹鱒中單一或聯(lián)合添加乳酸片球菌和低聚半乳糖的效果。雖然單一給藥，對其生長性能沒有明顯影響，但聯(lián)合給藥，明顯改善了生長性能參數(shù)。此外，也觀察到，補充乳酸片球菌，可以明顯提高免疫反應和對鏈球菌的抵抗力，在對鯉的研究中，也觀察到類似的結(jié)果[12]。

1.3 腸球菌屬

腸球菌屬呈球形或卵圓形，在液體培養(yǎng)基中為成對或短鏈，不生芽孢，為革蘭陽性菌，有時以鞭毛運動，沒有明顯的莢膜，兼性厭氧。通常生長溫度在10～45 ℃，在pH 值9.6、6.5%氯化鈉（NaCl）中和40%膽鹽中也能生長。腸球菌屬中的糞腸球菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中研究最多的益生菌之一，從2014 年開始有一些報道。Allameh 等[13]研究了口服糞腸球菌，對爪哇鯉生理反應的可能影響。爪哇鯉以單劑量喂養(yǎng)5 周，在飼養(yǎng)期結(jié)束時，益生菌組的消化酶活性以及腸道短鏈脂肪酸（丙酸和丁酸）都有明顯增加。Matsuura 等[14]也報道了口服糞腸球菌后，細胞介導的免疫反應的提升。

1.4 乳球菌屬

乳球菌屬是Schleifer 等[15]在1985 年提議設(shè)立一個新的菌屬，這個菌屬的大多數(shù)細菌原來是鏈球菌屬和乳桿菌屬中的細菌。乳球菌屬革蘭染色為陽性，球狀、卵圓狀，直徑0.5～1.5 μm，菌體排列成對和短鏈。Nguye 等[16]從野生海洋魚類的腸道中分離出乳球菌WFLU12，研究發(fā)現(xiàn)，WFLU12 通過競爭性排斥和增加先天性免疫反應，保護魚類免受副豬鏈球菌感染。此外，用益生菌喂養(yǎng)的魚的生長性能和飼料利用率都有所提高，這些結(jié)果突顯了分離宿主相關(guān)益生菌的重要性，是一個值得進一步研究的課題。孔雨昕等[17]在烏鱧飼料中添加乳酸乳球菌，飼喂8 周后，觀察各試驗組腸道形態(tài)，發(fā)現(xiàn)處理組烏鱧腸道中部的皺襞高度高于對照組，并且顯著提高了cld3 的相對表達水平，維護了腸道物理屏障。

2 乳酸菌抗氧化機制

氧化應激，指細胞內(nèi)氧自由基水平升高，導致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 損傷[18]?；钚匝酰≧OS），包括超氧陰離子自由基、羥基自由基和過氧化氫，是高活性氧自由基之一。在進化過程中，大多數(shù)生物體，具有酶防御、非酶抗氧化防御以及修復系統(tǒng)，以保護其免受氧化應激[19]。然而，這些天然抗氧化系統(tǒng)，通常不足以防止生物體受到氧化損傷。添加能夠延遲或防止細胞基質(zhì)氧化物質(zhì)，可保護機體免受氧化損傷。因此，近年來從生物資源中尋找更安全、天然的抗氧化劑，來替代合成抗氧化劑，引起了極大關(guān)注。乳酸菌在宿主腸道中表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，并促進抗氧化酶的產(chǎn)生，以幫助去除宿主腸道中的ROS，從而減輕氧化損傷。乳酸菌的抗氧化特性已在體外和體內(nèi)得到證實，但是抗氧化活性的機制尚不完全清楚。目前的研究認為，乳酸菌可能通過清除ROS、螯合金屬、增加抗氧化酶水平和調(diào)節(jié)微生物群，來發(fā)揮抗氧化作用。

2.1 清除自由基

ROS 和活性氮，主要是在暴露于干擾細菌或宿主細胞代謝的壓力條件下產(chǎn)生的。大多數(shù)LAB具有清除O2自由基的系統(tǒng)，通過這些系統(tǒng)，可以降低食品發(fā)酵過程中自由基積累的風險和這些自由基對宿主生物體的損害。許多益生菌菌株及其代謝產(chǎn)物，在體外表現(xiàn)出對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氧離子（O2-）和過氧化氫（H2O2）的高清除能力，這些清除活性，通常隨著細菌細胞濃度的增加而增加[20]。有研究表明，某些菌株的培養(yǎng)上清液，表現(xiàn)出明顯高于完整細胞的自由基清除活性[21]，而在另一項研究中，完整細胞的清除活性又高于上清液[22]。這可能是由于益生菌品種之間的差異造成的。

2.2 金屬離子螯合

據(jù)報道，螯合劑如乙二胺四乙酸（EDTA）、巴菲咯啉二磺酸（BPS）、青霉胺和去鐵胺，可以捕獲金屬離子，防止金屬離子催化氧化[23]。Lin 等[24]在1999 年測定了19 種LAB 菌株的金屬離子（亞鐵離子和銅離子）螯合能力，結(jié)果顯示，嗜熱鏈球菌821 對Fe2+（亞鐵離子）和Cu2+（銅離子）都表現(xiàn)出最好的螯合能力。其他菌株也顯示了對Fe2+或Cu2+的螯合能力。此外，干酪乳桿菌KCTC 3260，通過螯合Fe2+和Cu2+，被證明具有很高的抗氧化能力[25]。盡管益生菌中金屬離子螯合作用的機制還不是很清楚，但研究表明，過渡金屬離子可以抑制酶催化的磷酸酯置換反應，并通過氫過氧化物的分解，產(chǎn)生過氧自由基和烷氧自由基[26]。因此這些益生菌菌株的螯合能力，可能是由于存在于益生菌細胞內(nèi)無細胞提取物中的生理性螯合劑[24]。

2.3 酶的調(diào)節(jié)

LAB 有自己的抗氧化酶系統(tǒng)，大多數(shù)LAB 可以通過產(chǎn)生抗氧化酶來清除自由基，將自由基分解為O2和H2O2[27]。據(jù)報道，屬于乳球菌和嗜熱菌菌株的無細胞提取物中，具有超氧化物歧化酶（SOD）活性，其中乳球菌的活性高于嗜熱菌[28]。此外，表達高水平SOD 或過氧化氫酶的LAB 菌株，可以作為傳統(tǒng)食品應用和新的治療用途的一種策略來開發(fā)。LAB 可以誘導宿主抗氧化酶的活性，從而調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)，減輕氧化壓力。補充乳酸菌后，不僅在血清中觀察到SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽（GSH）過氧化物酶等活性的增加，而且在各種動物的不同組織（肝臟）中也被觀察到，表明乳酸菌具有強大的抗氧化特性[29]。

2.4 腸道微生物群的調(diào)節(jié)

在腸道病原體過度增殖的情況下，腸道上皮細胞會產(chǎn)生并釋放大量的ROS，造成嚴重的氧化應激。已經(jīng)證明，腸道微生物群，可以調(diào)節(jié)氧化還原信號，影響宿主的氧化還原平衡[30]。補充LAB，可以調(diào)節(jié)腸道微生物群，據(jù)推測，LAB 可能部分地通過重建宿主的腸道微生物群，組成而發(fā)揮其抗氧化作用[31]。乳酸菌對腸道微生物群的調(diào)節(jié)與氧化應激密切相關(guān)，在高脂肪飼糧喂養(yǎng)的小鼠中，用硫辛酸處理后，ROS 和MDA 減少，總抗氧化能力增加，這與乳酸菌呈強烈的正相關(guān)，與大腸桿菌和腸球菌呈負相關(guān)[32]。補充約翰氏乳桿菌BS15，減輕了高脂肪飼料引起的氧化應激，并改變了小鼠腸道中厚壁菌和擬桿菌的比例，表明LAB 對腸道微生物群的調(diào)節(jié)，有可能改善宿主的氧化還原狀態(tài)[33]。

3 在水產(chǎn)中的應用

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，乳酸菌主要作為益生菌來改善水產(chǎn)動物健康和其生產(chǎn)能力。

來自土壤和大氣的鉛，污染了水體，對水生動物產(chǎn)生不利影響。Giri 等[34]研究了羅伊氏乳桿菌P16對鯉接觸鉛引起的毒性的保護作用，表明羅伊氏乳桿菌P16 減少了鉛暴露引起的氧化應激，扭轉(zhuǎn)了腸道微生物群的有害變化，恢復了腸道酶的活性。在針對耶爾森病的疫苗中加入植物乳桿菌426951，可顯著提高溶菌酶和堿性磷酸酶的活性，并增強虹鱒的疫苗接種效果[35]。LAB 可以產(chǎn)生具有抗菌活性的物質(zhì)，如細菌素、抗真菌肽等[36]。其中，細菌素、核糖體合成的細胞外肽或蛋白質(zhì)分子，對不同類型的微生物具有殺滅或抑制作用，占據(jù)特殊地位。最初，不同菌株產(chǎn)生的細菌素，被認為只對其他密切相關(guān)的LAB 物種有活性，但進一步的研究表明，它們對系統(tǒng)發(fā)育較遠的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，也有抗菌活性。LAB 抗菌化合物的抑制譜，包括引起魚類和貝類疾病的微生物，如沙門氏氣單胞菌、嗜水菌、沙門氏弧菌、致病性大腸桿菌等[37-38]。副溶血性弧菌是引起急性肝胰腺壞死（AHPND）的病原體，當蝦感染溶血性弧菌時，飼料中加入嗜酸菌和釀酒酵母作為益生菌混合物，可以減少肝胰腺病變，保護蝦免受AHPND 發(fā)病的影響[39]。

大量的體外和體內(nèi)研究顯示，LAB 對呼吸道和胃腸道病毒如輪狀病毒、諾瓦克病毒等，具有潛在的抗病毒活性[40]。Harikrishnan 等[41]的研究表明，使用乳酸菌，產(chǎn)生了對褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）的淋巴細胞病病毒（LCDV）的抗性。Son等[42]研究證實，添加植物乳桿菌的飼料，增強了石斑魚（Epinephelus coioides）對虹膜病毒的先天免疫反應和抵抗力[42]。Nakayama 等[43]將LAB 的抗病毒活性機制，歸結(jié)為與病毒的直接接觸，通過誘導抗病毒基因的表達，來抑制病毒的復制調(diào)節(jié)，或刺激宿主免疫系統(tǒng)功能。Jung 等[44]研究表明，給予高劑量的乳酸桿菌，能促進快速誘導抗體IgG1、IgG2a、先天免疫細胞和細胞因子。乳酸菌支持體液免疫和細胞免疫，刺激溶菌酶的釋放，激活吞噬作用，從而提高身體對感染的整體保護水平[45]。越來越多的試驗表明，通過預防性使用乳酸菌，可以改善養(yǎng)殖水生動物的健康狀況和養(yǎng)殖水體的質(zhì)量，提高生產(chǎn)性能。

4 結(jié)語

乳酸菌能調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，促進魚類的生長和發(fā)育，增強魚類的免疫力和抵抗力，是一種安全的微生物添加劑，廣泛應用于飼料工業(yè)。隨著我國綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮了重要作用，對乳酸菌的有效性、特異性和多樣性提出了更高的要求。篩選特異性功能菌株，利用現(xiàn)代生物技術(shù)，不斷增強乳酸菌產(chǎn)品的功能，有針對性地使用乳酸菌產(chǎn)品，建立可持續(xù)、穩(wěn)定、安全的水產(chǎn)養(yǎng)殖微生態(tài)系統(tǒng)，將是水產(chǎn)養(yǎng)殖研究領(lǐng)域開展乳酸菌研究和應用的重點任務。