河流疏浚底泥余水的固定化微生物處理技術

王獻昆，田志超，周 南，趙志榮，何詩詩，余艷鴿，辜曉原，翟德勤，鄭茂盛

（1.中電建生態(tài)環(huán)境集團有限公司，廣東深圳 518102；2.華北電力大學環(huán)境科學與工程學院，北京 102206）

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，大量污染物隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等人類活動排入河流，沉積于河道底泥中，因此底泥富集了營養(yǎng)鹽、重金屬、有機物等各種有害物質(zhì)。當河水中污染物濃度較低時，底泥將隨著河水的流動持續(xù)向水體中釋放污染物質(zhì)，成為河道的內(nèi)源污染源〔1〕。通過疏浚方式清理河道污染底泥是河道治理的主要手段之一，通過底泥清淤結合沿河截污、補水工程等措施能夠有效降低重度黑臭水體斷面占比，或將黑臭水體級別降為輕度黑臭。然而在疏浚底泥的過程中會產(chǎn)生大量余水，若處理不當會造成二次污染〔2〕。目前，國內(nèi)主要通過堆場自然脫水方式來降低疏浚底泥的含水率，而對于大量疏浚底泥余水的處理，往往僅經(jīng)簡單的絮凝沉淀而未做進一步處理，即就近排入附近的受納水體，從而造成二次污染〔3-4〕。

生物法以其投資低、效益高、無二次污染且運行管理方便等優(yōu)勢得到了快速發(fā)展，并逐漸應用到水環(huán)境污染治理中〔5-6〕，其中固定化微生物技術作為新興技術，其采用物化的方式將微生物固定在相應載體中，使其在特定空間內(nèi)高度富集，從而實現(xiàn)對污水的有效處理〔7〕。固定化微生物技術因其處理效率高、反應速度快、微生物流失少等特點得到廣泛應用，但利用固定化微生物技術處理疏浚底泥余水卻鮮有報道〔8-10〕。

筆者以廣東省某河道治理項目的疏浚底泥余水為研究對象，基于固定化微生物技術，設計多級接觸氧化一體化裝置開展中試研究，其中采用親水聚氨酯基填料作為微生物載體，高效去除余水中的氨氮和總氮等；同時基于分子生物學研究方法，對裝置各級反應池中的微生物群落結構和功能進行分析，為進一步提升處理效能及實際工程應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

本試驗中多級接觸氧化一體化裝置的工藝結構如圖1 所示。整個裝置尺寸為6.0 m×2.4 m×2.2 m，有效工作容積為15.0 m3，分為5 級反應池，每級反應池的工作容積約3.0 m3，其中前兩級為缺氧池，后3級為好氧池，出水進入清水池，其中在清水池中設有回流泵，可通過管路回流至第1 級底部。好氧反應池底部中央放置曝氣盤，通過鼓風機向反應池內(nèi)曝氣，每級反應池出水堰高度沿水流方向逐漸降低，并在清水池設置出水口。該一體化裝置前端設有調(diào)節(jié)池和絮凝沉淀池，經(jīng)過預處理后的水作為該裝置的進水進入第1 級反應池。

圖1 多級接觸氧化一體化裝置Fig.1 The multistage contact oxidation integrated equipment

1.2 試驗裝置的啟動與調(diào)試

試驗裝置的啟動分為3 個階段，分別為悶曝階段、間歇進水階段和提高負荷階段〔11〕。

1）悶曝階段。向裝置中添加親水聚氨酯基填料，將3 000 mg/L 的某污水處理廠污泥加入至每個生化池中，同時為強化系統(tǒng)的反硝化功能，以150 g/m3的投加量向前兩級反應池中加入好氧反硝化菌劑Pseudomonas stutzeri，控制曝氣量為7 m3/h，連續(xù)悶曝2 d〔12-13〕。

2）間歇進水階段。每天按設計流量（50 m3/d）的50%緩慢泵入一倍反應池體積的水量，逐步替換掉上一階段的進水，如此間歇運行4 d。

3）提高負荷階段。分別按設計流量的20%和50%連續(xù)進水2 d，之后開始以設計流量連續(xù)進水，完成掛膜啟動〔14〕。

在系統(tǒng)啟動后的調(diào)試中，在確保出水水質(zhì)達標的前提下，通過控制風機的曝氣量盡可能降低工藝能耗，運行穩(wěn)定后每級好氧池的曝氣量維持在1.8 m3/h。在運行第30 天，向第1 級反應池底部以一定速率連續(xù)補加質(zhì)量濃度為60 g/L 的乙醇（換算成CODCr為40 mg/L），同時開啟回流裝置，回流比為50%，考察系統(tǒng)對總氮的去除效果。

1.3 水質(zhì)指標及檢測方法

反應器運行期間，每天定時取樣。在達到穩(wěn)定運行之后，從每級反應池取樣分析各污染物的沿程分布。氨氮、總氮、CODCr采用國標方法測定（GB 7479—1987、GB 11894—1989、GB 11914—1989），溶解氧（DO）采用便攜式溶氧儀現(xiàn)場測定。根據(jù)運行期間的取樣分析，系統(tǒng)進水平均氨氮為（12.27±4.12） mg/L，總氮為（15.74±4.48） mg/L，CODCr為（50.32±22.09） mg/L。進水碳氮比僅為3.20，且進水中難生物降解有機物含量較高，導致進水中生物可利用碳源嚴重不足。

1.4 DNA 提取和實時定量PCR

通過分子生物學研究方法對裝置中功能微生物的豐度和群落多樣性進行取樣分析檢測。在工藝穩(wěn)定運行后對每級反應池中的微生物填料樣品進行采集，然后低溫保存并迅速運回實驗室，采用土壤DNA 快速提取試劑盒（MP Biomedicals，USA）對樣品中的總DNA 進行提取，通過NanoDrop 光度計ND-2000 對DNA 濃度和純度進行測定。分別以特異性引物338F/806R、Arch amoA 19F/616R、amoA 1F/2R、comamoA AF/3R9、Ps 136F/598F 對樣品中的總細菌、氨氧化古菌（AOA）、氨氧化細菌（AOB）、完全氨氧化菌（CAOB）以及P.stutzeri菌進行定量PCR 擴增〔15-17〕，以引物narG1960m2F/2050m2R、napAV17F/4R、nirScd3aF/R3cd、cnorB2F/6R、nosZ1527F/1773R對周質(zhì)硝酸還原酶基因、膜質(zhì)硝酸還原酶基因、亞硝酸還原酶基因、一氧化氮還原酶基因、一氧化二氮還原酶基因進行擴增〔18〕。定量PCR 在Applied Biosystems 7500 系統(tǒng)中進行，并采用20 μL 反應體系，包含10 μL 2×SuperReal Premix Plus、0.5 μL 正向和反向引物、2 μL 50×Roxpreference 染料、5 μL 無RNase H2O 和2 μL 模板DNA。使用相應基因克隆后的標準質(zhì)粒經(jīng)過10 倍梯度稀釋后作為模板制作標準曲線。每個樣品設置3個平行，并以無菌水代替模板DNA做陰性對照。

1.5 微生物群落分析

利用515FmodF/806RmodR 引物對樣品中總細菌進行高通量測序分析。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認后，在Illumina MiSeq 平臺上進行測序，測序后利用QIIME 軟件對原始序列進行過濾和篩選〔13〕。利用USEARCH（Version 1.8.0）將剩余序列劃分為不同的操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs），相似性閾值為97%，并通過Greengenes GG_13_8 數(shù)據(jù)庫進行物種注釋。利用MEGA 7.0 軟件采用鄰域連接（Neighbor-joining，NJ）法對CAOBamoA基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析。通過使用Galaxy web 在線平臺進行PICRUSt 功能預測潛在的微生物功能〔19〕。通過對氮循環(huán)相關功能基因的預測，評估各級生物接觸氧化池的氮循環(huán)相關生物功能活性。

2 結果與討論

2.1 固化微生物技術對氨氮和總氮的去除效果

試驗裝置調(diào)試完成后開始正式試驗，水處理量維持在50 m3/d，裝置進出水氨氮和總氮變化見圖2。

圖2 裝置進出水氨氮（a）和總氮（b）的變化Fig.2 Variations of influent and effluent ammonia（a）and total nitrogen （b）

由圖2 可以看出，裝置的進水氨氮處于5.95～20.31 mg/L，裝置出水氨氮在0.13～4.06 mg/L，出水氨氮平均值為1.02 mg/L，平均去除率達到91.21%。在進水氨氮波動較大的情況下，保持了穩(wěn)定的氨氮去除效果，表現(xiàn)出良好的抗沖擊能力。

系統(tǒng)進水總氮在8.33～25.00 mg/L，在運行的前30 d，由于進水中有機物含量較低，系統(tǒng)對總氮幾乎沒有去除效果。補加碳源并開啟回流后，出水總氮明顯降低，平均出水總氮為6.16 mg/L，總氮去除率達到59.00%。乙醇作為一種易被微生物利用的碳源，一方面可直接被反硝化菌利用發(fā)揮脫氮作用，另一方面還可被普通異養(yǎng)菌利用消耗DO，有助于營造缺氧厭氧環(huán)境，促進反硝化脫氮過程，從而降低出水總氮。

2.2 各級反應池的水質(zhì)變化

系統(tǒng)在第30 天后穩(wěn)定運行期間各級反應池中的氨氮、總氮、CODCr和DO 的變化見圖3。

圖3 系統(tǒng)穩(wěn)定運行期間各級反應池中的氨氮（a）、總氮（b）、CODCr（c）和DO（d）的變化Fig.3 Variations of ammonia （a），total nitrogen （b），CODCr（c）and dissolved oxygen （d） concentrations in each stage during the stable operation

由圖3 可以看出，隨著余水處理進程，氨氮逐級降低，尤其在后3 級的好氧環(huán)境中快速降低，出水平均氨氮為（1.30±1.13） mg/L。進水中的平均DO 為3.15 mg/L，在補加碳源且開啟回流的條件下，沿程DO 逐漸下降，在第2 級時DO 下降至0.42 mg/L，加上碳源的補充，達到了反硝化細菌進行脫氮的缺氧環(huán)境，總氮到第3 級時下降到（6.73±2.41） mg/L，之后由于碳源的缺乏以及DO 的存在，總氮保持較為穩(wěn)定。

2.3 各級反應池中氨氧化微生物的豐度及群落結構

在系統(tǒng)中氨氧化微生物負責將氨氮轉化為亞硝酸鹽，是硝化過程中的限速步驟〔20〕。各級反應池中氨氧化微生物的豐度變化見圖4。

圖4 各級反應池中AOB amoA （a）、AOA amoA （b）、CAOB amoA （c）以及16S rRNA （d）的豐度變化Fig.4 Variations of AOB amoA （a），AOA amoA （b），CAOB amoA （c）and 16S rRNA （d）abundances in different stages

由圖4 可以看出，3 類氨氧化微生物的amoA基因豐度在各級反應池中的變化趨勢一致，均在后3級好氧池中的豐度較高，這與氨氧化微生物好氧化能自養(yǎng)的營養(yǎng)攝取方式相一致。在后3 級好氧池中，AOBamoA的豐度在（3.53～5.54）×107copies/mL，大約是CAOBamoA〔（1.67～2.25）×107copies/mL〕的2～3 倍。自CAOB 發(fā)現(xiàn)以來，已發(fā)現(xiàn)其在多種水處理工藝中與AOB 同時存在〔21-22〕，甚至在氨氧化過程中占據(jù)主要地位，打破了以往氨氧化過程僅由AOB主導的傳統(tǒng)觀念〔23-24〕。AOAamoA在系統(tǒng)中的豐度較低〔（1.32～2.10）×106copies/mL〕，因此推測系統(tǒng)的氨氧化過程主要由AOB 和CAOB 負責。而對于總細菌來說，在設備第1 級中的豐度最高，主要由于進水和補加的碳源為異養(yǎng)菌提供了豐富的碳源。相比于普通異養(yǎng)菌，硝化細菌生長較為緩慢，極易受到水量和水質(zhì)波動的沖擊，而系統(tǒng)中固定化填料的存在為硝化細菌的生長繁殖提供了有利條件，避免了隨水流流失的風險，因而在系統(tǒng)中保持了較高的豐度，保障了在進水波動的條件下系統(tǒng)仍有穩(wěn)定的硝化性能。

2.4 各級反應池中反硝化基因豐度

菌劑P.stutzeri是在污水處理系統(tǒng)中篩選出的好氧反硝化菌株經(jīng)擴大培養(yǎng)而成，該菌屬具有高效的反硝化能力，且在活性污泥系統(tǒng)強化實驗中取得了顯著的脫氮提升效果〔25〕，因而在本系統(tǒng)中作為強化菌劑予以投加使用。反硝化基因豐度可在一定程度上代表系統(tǒng)中微生物的脫氮能力，各級反應池中的P.stutzeri及反硝化基因豐度見圖5。

圖5 各級反應池中P. stutzeri （a）及反硝化基因narG （b）、napA （c）、nirS （d）、cnorB （e）以及nosZ （f）的豐度變化Fig.5 Abundance variations of P. stutzeri （a） and denitrifying genes narG （b），napA （c），nirS （d），cnorB （e） and nosZ （f） in different stages

由圖5（a）可知，P.stutzeri在第1 級、第2 級缺氧反應池中具有較高的豐度，而在后3 級的好氧環(huán)境中豐度較低，說明該菌在缺氧環(huán)境中更容易形成競爭優(yōu)勢，這與研究者對該菌屬的研究結論相一致〔26〕。另外，聚氨酯基填料有效避免了P.stutzeri菌劑在系統(tǒng)中的流失，對維持其在系統(tǒng)中的豐度起到了促進作用〔12〕。值得說明的是，由于進水以及回流污水中DO 的帶入，前兩級缺氧反應池中的DO依然有1.70 mg/L 和0.42 mg/L，因而會對傳統(tǒng)反硝化菌的脫氮能力造成顯著的抑制作用，而P.stutzeri屬于好氧反硝化菌，可在一定的DO 條件下發(fā)揮反硝化作用，而且前兩級缺氧池中具有較高濃度的碳源，因此在缺氧池中投加菌劑P.stutzeri可有效維持其生長優(yōu)勢并顯著提高系統(tǒng)的反硝化能力〔27〕。對各編碼反硝化酶的反硝化基因narG、napA、nirS、cnorB、nosZ的豐度進行研究，由圖5（b）～圖5（f）可知其呈現(xiàn)出了一致的變化趨勢，即在前3 級反應池中豐度較高，平均豐度均比后兩級高出1～3 個數(shù)量級。系統(tǒng)補加碳源后，充足的碳源和氮源為反硝化菌富集營造了良好的生長環(huán)境，也與前3 級總氮去除率較高的結果相呼應。而進入好氧區(qū)后，較高的DO 快速消耗了碳源，使反硝化菌生長受到抑制，尤其在后兩級中，碳源的缺乏使反硝化基因豐度維持在較低的水平。

2.5 各級反應池中微生物群落與功能分析

各級反應池中豐度占比大于2%的細菌群落結構在屬水平上的分布見圖6。

由圖6 可知，各級反應池中的微生物群落結構存在著明顯差異，前兩級缺氧池中Massilia和Arthrobacter屬占有較高的相對豐度。其中Massilia屬的豐度在第1 級、第2 級反應池中分別占總細菌的22.97% 和38.70%，Arthrobacter屬分別占9.39% 和2.87%。有研究表明2 個菌屬具有高效的異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力，在碳源充足的條件下菌株M.neuiana對氨氮和亞硝氮的去除率均可達到90%以上〔28〕，菌株A.arilaitensis在溫度低至15 ℃的條件下對硝態(tài)氮的去除率依然可達到100%〔29〕。值得注意的是，好氧反硝化菌雖然具有同時利用硝酸鹽和氧氣作為電子受體的能力，其反硝化效率依然會受到高濃度氧氣的抑制，因此，得益于缺氧池中較高濃度的碳源以及較低的DO，兩個菌屬在前兩級缺氧池中保持了較高的豐度。在第3、4、5 級生物反應池中，F(xiàn)lavobacterium是豐度最高的菌屬，分別占總細菌數(shù)的29.0%、44.1%和56.8%。Flavobacterium屬同樣具有優(yōu)秀的異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力，當分別以氨氮和硝氮為唯一氮源時，一株Flavobacterium菌株的脫氮效率可分別達到49.1% 和36.5%〔30〕。因此，豐富的群落結構組成，尤其是具有硝化和反硝化功能菌屬的大量存在，保障了系統(tǒng)高效的有機物和總氮去除能力。

PICRUSt 能夠很好地搭建從物種到基因功能的橋梁，通過生物信息算法很好地挖掘微生物群落的功能信息〔19〕。圖7 展示了各級反應池中細菌反硝化代謝通路的功能預測。

圖7 各級反應池中反硝化功能的PICRUSt 預測Fig.7 PICRUSt prediction of denitrification function in different stages

由圖7 可以看出，各級生物反應池中均存在豐富的氮氧化物還原酶來催化脫氮過程中的反硝化反應，保證了系統(tǒng)將硝酸鹽向氮氣的逐步轉化。除一氧化氮還原酶外，硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、氧化亞氮還原酶在前3 級中保持了較高的豐度而在后兩級中豐度較低，保證了系統(tǒng)缺氧反應池中充分的反硝化功能，這與反硝化基因的定量結果一致。一氧化氮還原酶在后3 級中豐度較高可能是由于包括硝化細菌在內(nèi)的多數(shù)好氧細菌也攜帶有一氧化氮還原基因，而使用的cnorB引物僅對部分反硝化菌的一氧化氮還原基因進行了擴增，導致功能預測結果與定量PCR 結果出現(xiàn)差異。值得注意的是，氧化亞氮還原酶在前3 級中的豐度顯著高于后2 級，保證了反硝化過程產(chǎn)物由氧化亞氮向氮氣的轉化，緩解了溫室氣體氧化亞氮的排放〔31〕；但是，好氧池中由于硝化細菌可通過自養(yǎng)反硝化過程產(chǎn)生氧化亞氮，而又沒有足夠的氧化亞氮還原能力，推測好氧池將是氧化亞氮產(chǎn)生與排放的主要區(qū)域。

根據(jù)16S rRNA 測序結果進一步對各級反應池中的硝化細菌群落結構進行考察，將從屬于AOB、CAOB、AOA 以及NOB 的OTUs 與代表序列制作的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖8。

圖8 系統(tǒng)中硝化細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of nitrifying bacteria in the system

由圖8 可以看出，AOB 主要由OTU200 和OTU417 組成，屬于N.oligotropha分支〔32〕。AOA 僅包含一個OTU，即OTU396，屬于Nitrososphaera分支〔33〕。而對于包含有CAOB 以及NOB 的Nitrospira屬，只有OTU562 屬于Nitrospiralineage Ⅱ，但由于16S rRNA 并不能準確區(qū)分CAOB 以及NOB〔34-35〕，只能推測OTU562 可能是CAOB。 另外，OTU93，OTU210，OTU273 屬于Nitrospiralineage Ⅰ，是只有亞硝酸鹽氧化功能的NOB。與許多學者研究一致，Nitrosomonas是污水處理系統(tǒng)中AOB 的主要菌屬，而Nitrosospira屬的豐度通常較低甚至不存在〔36-37〕，主要歸因于具有較高氨氮親和力的Nitrosospira菌屬更適應在低氨氮條件下生存，而低氨氮親和力的Nitrosomonas菌屬在污水處理系統(tǒng)這類富含氨氮的環(huán)境中具有生長和表達活性的優(yōu)勢〔38-40〕。將硝化細菌的OTUs 在各級反應器中的豐度以熱圖形式展示（圖9），可以看出，3 類氨氧化微生物的結果與定量PCR結果一致，主要在好氧池中保持了較高的豐度，尤其在第4 級和第5 級反應池中。對于Nitrospira來說，雖然其對氧氣的親和力低于AOB，但第4 級、第5 級反應中較高的DO 保證了其生長并沒有受到限制，因而維持了較高的豐度，確保了系統(tǒng)的完全硝化性能〔41-43〕。

圖9 各級反應池中硝化細菌的豐度熱圖Fig.9 Heat map of nitrifying bacteria in different stages

3 結論

1）針對疏浚底泥余水對受納水體造成二次污染的風險，基于固定化微生物技術設計了日處理量為50 t/d 的多級接觸氧化一體化裝置，余水經(jīng)過處理后，氨氮和總氮去除率可分別達到91.21% 和59.00%，出水水質(zhì)可達到地表水準Ⅳ類標準。

2）菌劑P.stutzeri的強化以及前3 級反應池中較高的反硝化功能基因豐度保障了對系統(tǒng)中總氮的穩(wěn)定去除，群落結構以及PICRUSt 功能預測也證明了反硝化細菌以及反硝化功能在前3 級反應池中得到了富集和強化。

3）硝化細菌主要在好氧池中得到富集，其中氨氧化細菌（AOB）是系統(tǒng)中豐度最高的氨氧化微生物，其屬于N.oligotropha分支，完全氨氧化菌（CAOB）也可能在系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，具有較高豐度的亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）保障了系統(tǒng)穩(wěn)定的硝化作用。

4）固定化微生物技術促進了系統(tǒng)中硝化細菌和反硝化細菌的富集，增強了系統(tǒng)的抗沖擊負荷能力，對處理疏浚底泥余水具有重要的參考意義。