荊門某填埋場滲濾液的微生物群落結(jié)構(gòu)及功能分析

趙 倩，陳麗媛，李小堃，漆韞綢，潘紅忠，祝賢彬

（長江大學(xué)油氣地球化學(xué)與環(huán)境湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430100）

衛(wèi)生填埋是世界范圍內(nèi)最常見的城市固體廢物處理方法，可處理近60%的城市生活垃圾。盡管垃圾填埋場可以有效地消除或最大限度地減少廢物對環(huán)境的不利影響〔1〕，但在填埋過程中仍會產(chǎn)生大量的氣體和深棕色或黑色具有強(qiáng)烈腐臭味的液體，嚴(yán)重污染周圍的環(huán)境，威脅人類健康。這種高濃度有機(jī)廢水被稱為垃圾滲濾液（Landfill leachate），其氨氮高，污染物成分復(fù)雜，是世界公認(rèn)的污染威脅最大和難于處理的高濃度有機(jī)廢水〔2-3〕。城市生活垃圾的異質(zhì)性和分解導(dǎo)致滲濾液中存在豐度多樣的微生物群落，具有代謝復(fù)雜基質(zhì)的能力〔4-7〕。然而，滲濾液中微生物群落的多樣性和代謝功能仍不清楚。因此，深入探究滲濾液的微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝功能，對于調(diào)控滲濾液微生物組成和提高垃圾降解效率有重要意義。

目前針對于垃圾滲濾液的微生物群落結(jié)構(gòu)的研究較少。如表1 所示，J. E. MCDONALD 等〔8〕分析研究了英國3 個(gè)垃圾滲濾液的群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)Fibrobacters 為其主要的細(xì)菌門類；B. W. STAMPS 等〔9〕通過分析美國6 個(gè)地區(qū)19 個(gè)垃圾滲濾液的群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)無論地理位置如何，F(xiàn)irmicutes 和Proteobacteria 為主要的微生物群落；T. K?CHLING 等〔10〕研究了巴西3個(gè)不同年齡垃圾填埋場的滲濾液微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Firmicutes 為優(yōu)勢菌門，并且其豐度隨著填埋時(shí)間的增加而增加，其他豐度較高的門包括Bacteroidota、Proteobacteria 和Spirochaetes；Han KE 等〔11〕研究了中國東南沿海兩個(gè)大型城市生活垃圾填埋場的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Thermotogota、Firmicutes 和Bacteroidota 是3 個(gè)優(yōu)勢門，并且也檢測到許多與大分子降解相關(guān)的細(xì)菌屬，例如Defluvititoga、Hydrogenispora和Lentimicrobium。

然而，目前卻有大量研究報(bào)道了不同處理工藝下，如SBR（序批間歇式活性污泥法）、耦合短程硝化反硝化等，垃圾滲濾液處理前后微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，此類研究的目的主要是為了分析出降解垃圾滲濾液中污染物的土著微生物類群。徐芯渝等〔12〕研究菌株Rhodopseudomonas palustris對強(qiáng)化處理滲濾液的效果，結(jié)果表明，添加了該菌株的SBR反應(yīng)器脫氮除磷效果明顯增強(qiáng)且主要優(yōu)勢菌門為Proteobacteria 和Chloroflexi；趙晴等〔13〕研究了短程硝化反硝化耦合厭氧氨氧化工藝中微生物的群落結(jié)構(gòu)演替，發(fā)現(xiàn)該工藝門水平上優(yōu)勢菌群為Planctomycetes，豐度為54.94%，屬水平上主要菌屬為Candidatus Kuenenia，豐度為49.66%；吳長淋〔14〕通過對比兩種滲濾液處理系統(tǒng)（純好氧和厭氧好氧）中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，發(fā)現(xiàn)了厭氧反應(yīng)器中菌群主要包括Bacteroidetes、Firmicutes 和Synergistetes，好氧反應(yīng)器主要菌群為Proteobacteria 和Bacteroidetes。這些研究能為滲濾液中微生物種群的多樣性和功能提供重要的參考依據(jù)。然而，根據(jù)現(xiàn)有資料，滲濾液中微生物的多樣性和代謝功能特征還遠(yuǎn)未得到全面描述〔15〕。高通量測序技術(shù)作為一種生物學(xué)領(lǐng)域新技術(shù)，具有效率高和測序量大的優(yōu)勢，是分析垃圾滲濾液的微生物組成、識別功能性微生物菌群和功能性基因、研究微生物之間相互作用的有力工具，被普遍用于樣品微生物群落的研究〔16〕。因此，本研究采用了高通量測序技術(shù)來分析滲濾液中細(xì)菌和真菌的組成和相對豐度，并確定優(yōu)勢群體，為進(jìn)一步了解滲濾液中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性等提供科學(xué)依據(jù)〔17〕。

1 材料與方法

1.1 垃圾滲濾液采集與保存

本研究中采用的滲濾液是填埋齡在3 a 左右的垃圾滲濾液，試驗(yàn)用垃圾滲濾液取自湖北省荊門市沙洋縣某設(shè)計(jì)日處理規(guī)模為170 t 的城市生活垃圾填埋場（地理位置為北緯3°71′，東經(jīng)112°50′），填埋作業(yè)區(qū)周邊設(shè)置有截洪溝、排雨水溝。當(dāng)?shù)靥幱趤啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，一年四季分明。年平均降雨量為793.27 mm，年平均氣溫17.1 ℃。采集到的滲濾液樣品立即與等體積的無水乙醇混合并儲存在已消毒的1 L 容器中，在24 h 內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室中，滲濾液樣品在分析前于4 ℃條件下儲存〔18〕，滲濾液樣品理化指標(biāo)見表2。

表2 滲濾液理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical parameters of leachate samples

1.2 理化指標(biāo)測定

滲濾液樣品pH、水溫（WT）采用水質(zhì)分析儀現(xiàn)場測定，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行氨氮（NH3-N）（納氏試劑分光光度法，HJ 535—2009）、硝態(tài)氮（NO3--N）（紫外分光光度法，HJ/T346—2007）、總氮（TN）（堿性過硫酸鉀消解法，GB 11894—1989）、總磷（TP）（鉬酸銨消解法，GB 11893—1989）、COD（重鉻酸鉀滴定法，GB 11914—1989）等指標(biāo)的測定，測定均重復(fù)3 次。

1.3 垃圾滲濾液DNA 提取

滲濾液樣品先用粗棉布過濾以去除碎片和其他顆粒，然后以14 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，以收集顆粒。隨后，用真空裝置將濾液通過孔徑為0.22μm 的濾膜，將含有微生物的顆粒和濾膜一起用于DNA 提取，使用Fast DNA?SPIN Kit 試劑盒（MP Biomedicals，U. S.）提取樣品總DNA；用1.5%瓊脂糖凝膠電泳評估DNA；用NanoDrop1000 紫外分光光度計(jì)測定DNA 濃度和純度；提取的DNA 樣品在測序前儲存在-80 ℃的環(huán)境下〔1〕。

1.4 垃圾滲濾液PCR 擴(kuò)增和高通量測序

采用GeneAmp 9700 PCR 儀（ABI，CA，U. S.）對提取的DNA 樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，選取兩對引物擴(kuò)增細(xì)菌和真菌的16S rRNA，引物515F（5’-GTGCCAG CMGCCGCGGTAA-3’）和907R（5’-CCGTCAATTC MTTTRAGTTT-3’）用于擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因的V3～V4 高變區(qū)〔9〕，引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTA GAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTC ATCGATGC-3’）對真菌ITS 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃1 min 30 s，31 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min，10 ℃終止，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用Illumina Miseq PE250 平臺對擴(kuò)增子片段進(jìn)行高通量測序〔19〕。

1.5 序列數(shù)據(jù)處理與生物信息學(xué)分析

根據(jù)測序樣品的條形碼，將原始測序結(jié)果準(zhǔn)確分配至各測序樣品，利用FLASH、QIIME 質(zhì)量過濾器和UCHIME 等軟件獲得高質(zhì)量序列。通過UPARSE聚類和注釋與有效序列相似度超過97%的序列，獲得可操作分類單元（OTUs），使用Origin 繪制菌群門和屬水平上的物種分布圖，將樣品中無法識別該分類水平的類群統(tǒng)稱為未知類群（unclassified），并且門水平相對豐度低于1%和屬水平低于2%的類群，統(tǒng)稱為其他類群（others）〔13〕。使用FAPROTAX 對滲濾液細(xì)菌群落進(jìn)行生態(tài)功能預(yù)測，采用Tax4Fun（v 0.3.1）預(yù)測細(xì)菌群落的代謝功能。所有數(shù)據(jù)處理采用Excel 2019，并使用Origin 2021 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

以垃圾滲濾液為研究對象，提取微生物總DNA，采用高通量測序技術(shù)，進(jìn)行測序統(tǒng)計(jì)，之后對滲濾液中細(xì)菌和真菌的相對豐度進(jìn)行了分析，并進(jìn)行了功能預(yù)測。

2.1 測序統(tǒng)計(jì)

垃圾滲濾液細(xì)菌樣品共獲得47 935 條高質(zhì)量基因序列，平均長度為360 bp。真菌樣品共獲得98 571 條高質(zhì)量基因序列，平均長度為229 bp。常用α多樣性分析微生物群落，其中表征菌群豐度（Community richness）的指數(shù)為OTUs 和Coverage 指數(shù)，用于評估樣本中物種組成的豐富度和均勻度，指數(shù)越大越好；表征菌群多樣性（Community diversity）的指數(shù)為Shannon 和Chao-1 指數(shù)，二者越大說明樣品中物種的復(fù)雜程度越高〔20〕。表3 和圖1 為垃圾滲濾液的α 多樣性結(jié)果，細(xì)菌群落的OTUs、Chao-1、Shannon 和Coverage 指數(shù)分別為622、694.22、4.35 和99.79%，真菌群落的OTUs、Chao-1、Shannon 和Coverage 指數(shù)分別為120、119.97、2.97 和99.98%。細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)都較大，說明滲濾液樣品的微生物豐度和多樣性較高，Coverage 均大于99%，說明數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

圖1 α 多樣性Fig.1 Alpha diversity

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)

垃圾滲濾液樣品通過高通量測序得到的OTUs分別在門、綱、目、科、屬5 個(gè)分類水平進(jìn)行比對鑒定，結(jié)果見圖2。

圖2 滲濾液微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Microbial community structure of leachate

細(xì)菌樣品物種注釋統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：23 個(gè)門，62 個(gè)綱，130 個(gè)目，195 個(gè)科，315 個(gè)屬。在細(xì)菌門水平上，相對豐度≥1.00%的共9 個(gè)門。如圖2（a）所示，其中Proteobacteria 占比最大為50.26%，Bacteroidota 占13.48%，Desulfobacterota 和Campilobacterota 分別占8.63% 和8.47%，其次為Actinobacteriota（5.30%）、Firmicutes（4.71%）、Spirochaetota（2.89%）、Thermotogota（2.68%）和Synergistetes（1.37%），其余門類均低于1.00%，總計(jì)占比為2.21%。因此，Proteobacteria 為該垃圾滲濾液中的優(yōu)勢菌門。

如圖2（b）所示，在屬水平，全部細(xì)菌序列至少有315 個(gè)屬，其中豐度≥2% 的屬有10 個(gè)（共占52.23%），Pseudomonas所占比例最高，為20.25%，并且Pseudomonas作為一種自然界常見的病菌，更容易在高COD、高TN 和高NH4+-N 的垃圾滲濾液處理體系中生存并富集〔3〕。其余9 個(gè)屬分別為Sulfurimonas（8.08%）、Desulfuromonas（3.74%）、MSBL7（3.38%）、Thiobacillus（3.33%）、Leucobacter（2.89%）、Sphaerochaeta（2.75%）、Lentimicrobium（2.64%）、Defluviitoga（2.64%）和Lutibacter（2.53%）。不足2%的屬有305個(gè)，屬于Proteobacteria 門有9 個(gè)，豐度為11.6%；屬于Bacteroidota 門有3 個(gè)，豐度為4.64%。

垃圾滲濾液樣品中鑒定出的真菌分屬于4 個(gè)門、12 個(gè)綱、21 個(gè)目、31 個(gè)科和38 個(gè)屬。在真菌門分類水平上，微生物組成如圖2（c）所示，主要的微生物群落為unclassified_k_Fungi（29.93%）、Basidiomycota（26.04%）、Ascomycota（25.89%）和Rozellomycota（18.14%）。

真菌屬水平分類上，如圖2（d）所示，主要的微生物群落為unclassified_k_Fungi（29.92%）、Apiotrichum（21.62%）、unclassified_p_Rozellomycota（18.03%）、Penicillium（7.81%）、Candida（5.49%）、Talaromyces（4.23%）、unclassified_f_Ophiostomataceae（2.39%）、Aspergillus（2.29%）、unclassified_o_Hypocreales（2.02%）、Trichosporon（1.24%）、others（4.97%）。

2.3 功能預(yù)測

通過Tax4Fun 對滲濾液細(xì)菌中的微生物進(jìn)行功能注釋，預(yù)測序列主要屬于代謝（37.27%）、環(huán)境信息處理（21.95%）、遺傳信息處理（7.11%）和細(xì)胞過程（2.07%）。KEGG 途徑代謝有最豐富的代謝群，基于KEGG 數(shù)據(jù)庫的功能基因注釋見圖3。

圖3 基于KEGG 數(shù)據(jù)庫的功能基因注釋Fig.3 Functional gene annotation based on the KEGG database

如圖3 所示，在KEGG 水平2 的代謝水平中，與其他功能相比，滲濾液微生物中氨基酸代謝（12.49%）、碳水化合物代謝（11.69%）、輔因子和維生素的代謝（6.63%）和能量代謝（6.46%）的代謝功能豐度最高，這些基因參與細(xì)胞的代謝，是微生物生長的基礎(chǔ)，氨基酸在填埋期間可以作為微生物生長和代謝的能量和碳源，碳水化合物可以為降解纖維素和半纖維素提供基質(zhì)，輔因子和維生素的代謝可以維持代謝穩(wěn)定，表明與碳相關(guān)的代謝和有機(jī)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化具有高活性〔1〕。與環(huán)境信息處理相關(guān)的基因也有較高的豐度，如膜傳輸（11.14%），信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（10.81%）。另外還有與遺傳信息處理相關(guān)的基因，如復(fù)制和修復(fù)（3.68%），翻譯（3.43%），折疊、分類和降解（2.07%）。研究表明滲濾液微生物存在相互作用關(guān)系，可以進(jìn)行能量代謝、物質(zhì)交流和信息傳遞〔3〕。

通過FAPROTAX 對滲濾液細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測，結(jié)果見圖4。

圖4 細(xì)菌群落功能預(yù)測Fig.4 Prediction of bacterial community function

如圖4 所示，細(xì)菌微生物主要以碳（C）、氮（N）和硫（S）元素循環(huán)代謝型和動物病原型微生物為主，其中碳循環(huán)代謝型相關(guān)的微生物主要以化能異養(yǎng)作用、有氧化能異養(yǎng)作用、發(fā)酵作用、甲烷生成作用、碳?xì)浠衔锝到鉃橹鳎坏x相關(guān)微生物主要以硝酸鹽還原、硝酸鹽呼吸、亞硝酸鹽呼吸為主；硫循環(huán)相關(guān)微生物主要以黑色硫化物氧化、硫化合物呼吸、硫呼吸為主；動物病原型微生物主要是以動物寄生蟲或共生體、人類病原體及肺炎人體病原體為主。

2.4 對比分析

Proteobacteria、Bacteroidota 和Firmicutes 是垃圾滲濾液中常見的微生物，在不同地區(qū)均被報(bào)道為優(yōu)勢菌門〔1〕，與本研究結(jié)果一致，說明內(nèi)陸城市與沿海城市滲濾液的微生物群落結(jié)構(gòu)具有相似性。Proteobacteria 在滲濾液中豐度通常較高，多項(xiàng)研究證明，Proteobacteria 可能參與可溶性基質(zhì)的發(fā)酵，有機(jī)污染物的降解，將可溶性糖轉(zhuǎn)化為單糖，減輕污染物的生物毒性〔21〕。Bacteroidota 和Firmicutes 是厭氧環(huán)境常見的水解酸化細(xì)菌，可以促進(jìn)填埋場復(fù)雜有機(jī)質(zhì)的降解，如纖維素、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素和脂質(zhì)等〔22〕。

參考目前已發(fā)表垃圾滲濾液有關(guān)微生物群落論文〔1〕并結(jié)合此項(xiàng)研究所獲數(shù)據(jù)，利用SPSS 軟件對滲濾液樣品的α多樣性進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果見圖5。

圖5 α 多樣性相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of α diversity

如圖5 所示，有效序列與Coverage 呈顯著正相關(guān)（r=0.64，P＜0.01），說明有效序列越多，樣品覆蓋率就越高，OTUs 與Shannon、Chao-1 呈顯著正相關(guān)（r=0.70，P＜0.01；r=0.95，P＜0.01），Shannon 和Chao-1都是樣品微生物多樣性的指標(biāo)，因此該3 個(gè)指標(biāo)呈顯著正相關(guān)，與Coverage 呈顯著負(fù)相關(guān)（r=0.84，P＜0.01），Shannon 與Chao-1 呈顯著正相關(guān)（r=0.63，P＜0.01），與Coverage 呈顯著負(fù)相關(guān)（r=0.51，P＜0.01），Chao-1 與Coverage 呈顯著負(fù)相關(guān)（r=0.93，P＜0.01）。

通常，填埋場的地理位置和物理化學(xué)特性是影響滲濾液微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素〔4，6〕。地理差異產(chǎn)生的影響可能取決于氣候條件、廢物成分和處置過程等因素。這些因素在一定程度上導(dǎo)致不同城市滲濾液理化指標(biāo)的差異，并影響微生物群落的分布。參考目前已發(fā)表垃圾滲濾液有關(guān)微生物群落論文〔1〕并結(jié)合此項(xiàng)研究所獲數(shù)據(jù)，利用SPSS 軟件對滲濾液樣品的理化指標(biāo)（pH、TN、NH3-N、TP 和COD）和微生物進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果見圖6。

圖6 滲濾液樣品中理化指標(biāo)與微生物的相關(guān)性Fig.6 Correlation coefficents between physicochemical indicators and microbial in leachate

由圖6 可以看出，相關(guān)性指標(biāo)揭示了滲濾液理化性質(zhì)與微生物的關(guān)系。理化參數(shù)中，填埋時(shí)長對微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，與Synergistetes 負(fù)相關(guān)（r=0.50，P＜0.01），這一結(jié)果與前人的研究一致〔23〕，隨著填埋年限的增加，有機(jī)材料的降解會導(dǎo)致廢物成分的變化，這可能會影響滲濾液的微生物群落〔9〕。TN 和NH3-N 也顯著影響了滲濾液微生物群落結(jié)構(gòu)，與Firmicutes 顯著負(fù)相關(guān)（r=0.48，P＜0.01；r=0.60，P＜0.01），TP 與Firmicutes 顯著負(fù)相關(guān)（r=0.59，P＜0.01），說明Firmicutes 可能含有與氮磷轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因。先前的研究〔24〕還表明，填埋場中的一些填埋環(huán)境條件，如含氧量、含水量和溫度，會影響滲濾液中的微生物群落。然而，本研究并未關(guān)注這些因素，有必要進(jìn)一步研究這些因素及其與其他因素的相互作用對滲濾液產(chǎn)生過程中微生物群落的影響。

3 總結(jié)

本研究利用高通量測序技術(shù)，對湖北荊門某垃圾填埋場滲濾液微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及其功能預(yù)測進(jìn)行了較為詳細(xì)地研究，探究其種群結(jié)構(gòu)和功能特征，細(xì)菌方面共鑒定出23 個(gè)門、62 個(gè)綱、130 個(gè)目、195 個(gè)科和315 個(gè)屬，優(yōu)勢類群為Proteobacteria 門（50.25%）和Pseudomonas屬（20.25%）；真菌方面共鑒定出4 個(gè)門、12 個(gè)綱、21 個(gè)目、31 個(gè)科和38 個(gè)屬，其中Basidiomycota 門（26.04%）和Apiotrichum屬（21.62%）為優(yōu)勢菌群?；贔APROTAX 預(yù)測滲濾液細(xì)菌微生物的生態(tài)功能，表明細(xì)菌群落主要以碳（C）、氮（N）和硫（S）元素循環(huán)代謝型和動物病原型微生物為主，基于Tax4Fun 軟件分析預(yù)測，滲濾液中存在豐富的代謝功能，尤其是氨基酸代謝和碳水化合物代謝，豐富的代謝基因調(diào)控填埋場木質(zhì)素和纖維素的降解，對于填埋場的穩(wěn)定具有重要意義。