碳源對(duì)除磷顆粒污泥除污效能和微生物特性的影響

相延錚，何成達(dá)，朱騰義，何 瑜

（揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225100）

近年來由于我國工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化問題愈演愈烈，這使得水中藻類大量滋生，壓縮了其他生物的生存空間，提高了水體的可利用難度。磷是導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的關(guān)鍵元素之一?，F(xiàn)階段的除磷方法主要分為物理法、化學(xué)法與生物法〔1〕，其中物理法選擇性差、效率低；化學(xué)法容易產(chǎn)生二次污染；傳統(tǒng)的生物除磷系統(tǒng)目前以絮狀污泥為主，存在著構(gòu)筑物占地面積大、沉淀時(shí)間長、二次釋磷等問題；而好氧顆粒污泥因其生物量大、沉降速度快、抗負(fù)荷能力強(qiáng)等特點(diǎn)〔2-5〕，克服了以往除磷方法的諸多局限性。

除磷顆粒污泥主要是通過污泥內(nèi)的聚磷菌（PAOs）對(duì)磷進(jìn)行過量吸收來去除水體中的磷。不同的有機(jī)物在不同的生物種群中代謝途徑不同，長期使用某種碳源對(duì)生物除磷顆粒污泥進(jìn)行培養(yǎng)，會(huì)對(duì)除磷系統(tǒng)中的微生物種群產(chǎn)生一定的篩選作用，從而影響除磷顆粒污泥的除磷效能。利用丙酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖4 種不同碳源運(yùn)行生物除磷顆粒污泥系統(tǒng)，探究這4 種碳源對(duì)生物除磷顆粒污泥系統(tǒng)處理污染物的效果，并通過Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)分析生物除磷顆粒污泥在不同碳源馴化下微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置及工藝

試驗(yàn)采用4 根高1 m、直徑0.1 m、有效容積5 L的有機(jī)玻璃柱狀SBR（a、b、c、d）作為除磷顆粒污泥運(yùn)行的主要反應(yīng)器，工藝流程見圖1。

圖1 SBR 工藝流程Fig.1 Technological process of SBR

該反應(yīng)器主要由攪拌槳、轉(zhuǎn)子流量計(jì)、曝氣泵、加熱帶、蠕動(dòng)泵等組成。反應(yīng)器在底部設(shè)有微孔曝氣頭并連接由轉(zhuǎn)子流量計(jì)控制流量的曝氣泵進(jìn)行曝氣；在柱子2 L 處設(shè)置出水口，排出出水及剩余污泥；5 L 處設(shè)置進(jìn)水口，通過蠕動(dòng)泵進(jìn)水，容積交換率為50%；厭氧段采用攪拌槳進(jìn)行攪拌，確保泥水充分混合；柱體纏有加熱帶，將反應(yīng)器溫度控制在（25±2） ℃。4 組反應(yīng)器所投加的碳源分別為：a-丙酸鈉；b-乙酸鈉；c-葡萄糖；d-蔗糖。

反應(yīng)器每天運(yùn)行4 個(gè)周期，每個(gè)周期為6 h，運(yùn)行方式為厭氧-好氧。其中厭氧攪拌85 min，好氧曝氣210 min，沉淀時(shí)間3 min，進(jìn)水排水各15 min。每周期的進(jìn)水、排水量各為2.5 L，反應(yīng)器的運(yùn)行時(shí)間由定時(shí)器控制。

1.2 接種污泥及試驗(yàn)廢水

4組SBR 反應(yīng)器內(nèi)接種污泥均是由湯汪污水處理廠曝氣池的絮狀污泥馴化培養(yǎng)出的成熟生物除磷顆粒污泥，馴化過程中丙酸鈉為單一碳源，接種污泥具有優(yōu)異的除磷性能。試驗(yàn)廢水為模擬廢水，a、b、c、d 這4 組反應(yīng)器中污泥質(zhì)量濃度均為9 000 mg/L，SVI為21.6 mL/g，碳源分別由丙酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖提供，氮源、磷源分別由氯化銨、磷酸二氫鉀提供，進(jìn)水COD、TP 分別保持在450、20 mg/L 左右。為了確保反應(yīng)器內(nèi)微生物的良好代謝性能，向試驗(yàn)廢水中適量投加FeCl3·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、KI、MnCl2·4H2O、Na2MoO4·2H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·7H2O、EDTA 等化合物提供微量元素。

1.3 檢測分析方法

所測水樣均通過定性濾紙過濾，COD 采用TE-5102G 型快速消解分光光度法，TP 采用鉬酸銨分光光度法。

在系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行的第120 天，分別從4 組反應(yīng)器內(nèi)采集顆粒污泥樣本進(jìn)行高通量測序。DNA 由E.Z.N.A. ?土壤DNA 試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA）提取，在260 nm 和280 nm 的波長下，用NanoDrop1000 分光光度計(jì)進(jìn)行定性和定量分析；利用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）在ABI GeneAmp?9700 PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；隨后將PCR 產(chǎn)物置于Illumina MiSeq PE300 平臺(tái)（Personalbio Biotechnology Co.，Ltd.，Shanghai，China）進(jìn)行分析，測序結(jié)果由上海美吉生物云提供。

2 結(jié)果與討論

2.1 典型周期內(nèi)的COD 和TP 變化

在系統(tǒng)運(yùn)行的第150 天，各反應(yīng)器內(nèi)COD、TP（以PO43-計(jì)）的變化情況如圖2 所示。

圖2 各反應(yīng)器內(nèi)COD 和TP 的變化Fig.2 Variation of COD and TP in each reactor

由圖2 可知，以丙酸鈉馴化并運(yùn)行的系統(tǒng)對(duì)COD 和TP 處理效果最為優(yōu)異，以蔗糖馴化并運(yùn)行的系統(tǒng)處理效果最差。

為了更好地探究以不同碳源馴化的除磷顆粒污泥對(duì)各碳源廢水COD、TP 的去除情況，將a 組（丙酸鈉馴化）、b 組（乙酸鈉馴化）、c 組（葡萄糖馴化）、d 組（蔗糖馴化）4 組反應(yīng)器分別加入含不同碳源模擬廢水進(jìn)行全周期水樣測試。其中，COD 的變化情況如圖3 所示。

圖3 系統(tǒng)內(nèi)COD 變化Fig.3 Variation of COD in the system

由圖3 可知，對(duì)以丙酸鈉、乙酸鈉為碳源的廢水進(jìn)行處理，a 組反應(yīng)器對(duì)COD 的去除效果最為優(yōu)異，出水COD 分別為33.4 mg/L、41.1 mg/L，COD 去除率分別為93.3%、91.4%。對(duì)以葡萄糖、蔗糖為底物的廢水處理，a 組反應(yīng)器對(duì)COD 的去除率略低于c 組反應(yīng)器，但處理效果仍相對(duì)較好，COD 去除率分別可以達(dá)到84.2%、81.1%。

對(duì)以乙酸鈉為碳源的廢水進(jìn)行處理，b 組反應(yīng)器對(duì)COD 去除效果較好，出水COD 為46.2 mg/L，處理效率為90.4%，僅略低于a 組反應(yīng)器。

與以蔗糖為碳源馴化的d 組反應(yīng)器相比，c 組反應(yīng)器對(duì)4 種進(jìn)水中COD 的處理效果較好，且對(duì)以葡萄糖、蔗糖為碳源的廢水處理中效果最好，在對(duì)丙酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖4 種廢水處理中，出水COD分別為70.9、48.1、67.5、75.2 mg/L，去除率分別為85.7%、90.0%、85.6%、83.8%。

對(duì)4 種含不同碳源進(jìn)水進(jìn)行處理，d 組反應(yīng)器對(duì)各進(jìn)水的COD 去除率均為最低，分別為82.9%、84.4%、81.3%、76.7%。

保持進(jìn)水TP 為20 mg/L 左右，含不同碳源進(jìn)水下各反應(yīng)器中TP 的變化情況如圖4 所示。

圖4 系統(tǒng)內(nèi)TP 的變化Fig.4 Variation of TP in the system

在厭氧階段，各組反應(yīng)器內(nèi)COD 迅速降低，同時(shí)伴隨著磷的快速積累。如圖4 所示，不同碳源條件各組反應(yīng)器均在厭氧末出現(xiàn)磷峰值，這是因?yàn)樵趨捬鯒l件下，PAOs 發(fā)生了釋磷反應(yīng)。a 組反應(yīng)器釋磷量最高，以丙酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖為碳源進(jìn)水時(shí)，釋磷量分別為79.9、70.7、43.0、30.6 mg/L，由此可以推測a 組反應(yīng)器內(nèi)顆粒污泥中PAOs 含量最高。

在好氧階段，PAOs 體內(nèi)的聚羥基脂肪酸酯（PHA）以獲得糖原及微生物生長所需要的能量，將水中的磷吸收到細(xì)胞內(nèi)合成多聚磷酸鹽，以實(shí)現(xiàn)對(duì)磷的去除。4 組反應(yīng)器在此階段內(nèi)COD 均趨于平緩，前60 min 對(duì)TP 的去除速率較快，60 min 后去除速率逐漸緩慢。含丙酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖為碳源進(jìn)水時(shí)，a 組反應(yīng)器對(duì)TP 的去除效果最好，去除率分別為98.5%、97.5%、86.9%、75.3%；d 組反應(yīng)器對(duì)TP 的去除效果最差，去除率分別為58.3%、52.5%、51.8%、45.3%。

由以上數(shù)據(jù)可知，就對(duì)TP 的去除效率而言，a、b組反應(yīng)器優(yōu)于c、d 組反應(yīng)器，且a、b 組反應(yīng)器中COD去除率相當(dāng)，但a 組反應(yīng)器對(duì)TP 去除率優(yōu)于b 組，推測b 組反應(yīng)器內(nèi)聚糖菌（GAOs）占比大于a 組反應(yīng)器。GAOs 為PAOs 的競爭菌種，GAOs 在厭氧階段與其競爭有機(jī)底物，但不參與磷的去除。當(dāng)然，為了證實(shí)這一推測，后續(xù)還需要考察高通量測序中的菌群占比。

2.2 微生物多樣性分析

將包括接種污泥、a 組～d 組在內(nèi)的5 個(gè)樣品標(biāo)記為S0～S4，進(jìn)行微生物菌群多樣性及豐度對(duì)比，多樣性指數(shù)匯總見表1。

表1 微生物多樣性指數(shù)對(duì)比Table 1 Comparison of microbial diversity index

由表1 可知，各樣品覆蓋率（Coverage）均超過99.8%，可以表明本研究中構(gòu)建的序列庫真實(shí)性較高。Sobs、Chao、Ace 數(shù)據(jù)表明，4 組反應(yīng)器內(nèi)污泥樣本的微生物豐富度均低于接種污泥。與接種污泥相比，反應(yīng)器內(nèi)樣品的微生物群落多樣性較低，Shannon 指數(shù)的最小值（3.058）以及Simpson 指數(shù)的最大值（0.129）均出現(xiàn)在S1 樣本處。不僅如此，各反應(yīng)器之間的微生物豐富度以及多樣性之間均有一定差異。造成此種差異的原因可能是因?yàn)樵谖⑸锏纳L過程中，不同碳源所發(fā)揮的作用不同。

在污水處理系統(tǒng)中，一般來說，微生物多樣性越低，則說明可能存在某種優(yōu)勢菌群，起到了一種富集效果，可能會(huì)增強(qiáng)系統(tǒng)對(duì)某一種污染物的去除能力。由上述分析可知，4 組反應(yīng)器內(nèi)顆粒污泥經(jīng)過馴化培養(yǎng)后種群豐度均有所下降，可能是因?yàn)閷?shí)現(xiàn)了部分菌群的富集。

為進(jìn)一步研究不同碳源馴化對(duì)污泥中微生物群落的影響，對(duì)各反應(yīng)器中污泥樣品進(jìn)行基于OTUs的微生物多樣性分析，結(jié)果見圖5。

圖5 基于OTUs 的微生物多樣性分析Fig.5 Microbial diversity analysis based on OUTs

PCoA（Principal coordinates analysis）分析給出了各組樣本污泥在OTUs 水平上的遠(yuǎn)近親疏關(guān)系。由圖5（a）可知，4 組除磷顆粒污泥與原始接種污泥均相距較遠(yuǎn)，說明在后期馴化的過程中，污泥的微觀特性均有一定改變，而S1 與S2、S3 與S4 分別相對(duì)聚攏，可以推測上述兩對(duì)樣品分別存在較多的相似菌群。

根據(jù)Heatmap 可進(jìn)一步看出各樣本間的親疏關(guān)系。由圖5（b）可知，各樣本與原始接種污泥的親近關(guān)系為S4＞S3＞S2＞S1。在OTUs 水平上，以蔗糖為碳源培養(yǎng)的S4 污泥樣本與S1、S2 最為疏遠(yuǎn)，且S3 與S4樣本較之S1 與S2 樣本更為接近。

Venn 圖可以通過各樣本中OTUs 關(guān)系來判斷樣本間的物種相似性。由圖5（c）可知，5 個(gè)樣品共獲得了1 275 個(gè)OTUs，S0、S1、S2、S3、S4 所單獨(dú)特有的OTUs 分別為517、11、55、52、57，分別占總數(shù)的40.55%、0.86%、4.31%、4.07%、4.47%。而5 個(gè)樣本的共同OTUs 為71，占各樣品OTUs 總數(shù)的8.72%、23.67%、15.33%、16.51%、18.68%。說明經(jīng)過不同碳源馴化培養(yǎng)出的除磷顆粒污泥中微生物的種類發(fā)生了較大變化。因此，不同碳源馴化的顆粒污泥對(duì)各污染物的去除效果不同，這也符合前文2.1 章節(jié)的分析。

2.3 微生物功能菌群結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步探究不同碳源對(duì)微生物群落的影響，分別在門、屬水平上對(duì)5 個(gè)樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6。

圖6 微生物功能菌群分布Fig.6 Distribution of functional microbial community

由圖6（a）可知，Proteobacteria、Bacteroidota、Actinobacteriota、Chloroflexi 均為污水處理中常見的門類，他們普遍存在于活性污泥〔6〕、生物膜〔7〕、海底泥〔7〕、厭氧顆粒污泥〔8〕和好氧顆粒污泥中〔9〕，在試驗(yàn)的5 組樣本中，其和占比分別為78.63%、96.99%、92.60%、91.24%、95.40%。相較于接種污泥而言，具有反硝化功能的2 大門Proteobacteria 與Bacteroidota所占比例顯著增加，從30.71%分別增加至93.61%、86.94%、74.23%、65.71%。其中Proteobacteria 的變化相對(duì)明顯，在S1 占比最多，S4 占比最小，而從一些相關(guān)研究中可知，Proteobacteria 是一種常見的優(yōu)勢菌群所屬菌門，同時(shí)也是生物除磷的關(guān)鍵菌群，所以可以推測a 反應(yīng)器中PAOs 含量最高。

從屬水平上進(jìn)行分析，可以更為準(zhǔn)確地了解各污泥樣本中起到主要作用的微生物種屬。由圖6（b）可以發(fā)現(xiàn)，5 組污泥樣本中的微生物在屬水平上差異較大，優(yōu)勢菌群也各有不同。在S1 中，所測得的優(yōu)勢菌屬為Accumulibacter，占比30.99%，而其余各組占比均不高于5%。通過分子生物技術(shù)，可以確定Candidatus_Accumulibacter是生物除磷顆粒污泥中的優(yōu)勢PAOs〔10〕，這也進(jìn)一步解釋了a 反應(yīng)器具有優(yōu)異除磷效果的原因。此外，S1 樣本內(nèi)所占比例較高的微生物菌屬還有Pseudomonas，占比為15.60%。Pseudomonas是一種反硝化PAOs，這也說明了a 反應(yīng)器內(nèi)的顆粒污泥結(jié)構(gòu)緊實(shí)，即使在好氧條件下，顆粒內(nèi)部也可以保持缺氧狀態(tài)，為反硝化脫氮除磷創(chuàng)造了良好環(huán)境。Rhodobacter是一種異養(yǎng)反硝化細(xì)菌〔11〕，可以將水中的硝態(tài)氮還原為氣態(tài)氮，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)水中氮的去除，在S1、S2 樣本中占比分別為9.94%、1.56%。

Defluviicoccus在S2～S4 這3 組樣本中占有較大比例，分別為17.44%、11.68%、12.01%，而在S1 中占比較小，為1.12%。在S2 樣本中還存在Competibacter菌屬，占比為16.05%，Defluviicoccus與Competibacter屬于GAOs，由此可以看出碳源對(duì)GAOs 與PAOs 的影響很大，丙酸鈉可能更適合用于PAOs 的篩選富集。在S1～S4 這4 組污泥樣本中，具有脫氮能力的Flavobacterium黃桿菌屬〔12〕也占有一定比例，分別為3.04%、11.82%、0.87%、0.34%，其中在乙酸鈉中占比最大。此外，Amaricoccus在S3、S4 這兩組樣本內(nèi)分別占比1.32%、17.43%，Amaricoccus被認(rèn)為可在厭氧階段吸收有機(jī)基質(zhì)，但不參與磷酸鹽的釋放〔13〕，是PAOs 的競爭菌種，這也可以解釋d 反應(yīng)器對(duì)磷酸鹽去除效果差的現(xiàn)象。

為了可以更加直觀地看出在不同碳源馴養(yǎng)下污泥中微生物種群結(jié)構(gòu)的差異性，將S0～S4 這5 組樣本的前50 個(gè)屬繪成熱圖來進(jìn)一步分析，見圖6（c）?？梢钥闯鲴Z化后的顆粒污泥與接種污泥在屬水平上差別較大，且PAOs 菌屬在S1～S4 這4 組樣本中占比呈遞減趨勢。GAOs 菌屬在S2 中含量最多，其次分別為S3、S1，S4 中占比最小，即吸收有機(jī)基質(zhì)的PAOs 與GAOs 在S4 中的占比最小，這也闡明了以蔗糖為碳源的d 組對(duì)COD 及TP 去除率均較低的原因。較之接種污泥，S1～S4 中Flavobacterium菌屬的含量大大增加，這也說明經(jīng)過馴化后的污泥具備一定的脫氮能力。

3 結(jié)論

以丙酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖作為反應(yīng)器進(jìn)水碳源，保證其他變量不變，探究了以不同碳源對(duì)除磷顆粒污泥進(jìn)行馴化和運(yùn)行時(shí)，對(duì)污水處理效能的影響，并對(duì)包括原始接種污泥在內(nèi)的5 個(gè)污泥樣本進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)變化分析，結(jié)論如下：

1）碳源類型對(duì)生物除磷顆粒污泥去除水中污染物效能的影響較大。在進(jìn)水TP、COD 分別為20、500 mg/L 的條件下，丙酸鈉是去除TP、COD 的最佳碳源；蔗糖組反應(yīng)器對(duì)各污染物的去除能力最弱，與丙酸鈉差距較大。

2）以Venn 圖、PCoA 圖以及樣本距離Heatmap在OUTs 水平上對(duì)各反應(yīng)器污泥樣本進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過培養(yǎng)馴化后的生物除磷顆粒污泥與接種污泥的微生物菌落存在很大差異。相對(duì)而言，以丙酸鈉、乙酸鈉培養(yǎng)的生物除磷顆粒污泥相似性較高，以葡萄糖、蔗糖培養(yǎng)的生物除磷顆粒污泥相似性較高。

3）碳源類型對(duì)生物除磷顆粒系統(tǒng)的微生物種群結(jié)構(gòu)具有顯著影響。在門水平上丙酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖培養(yǎng)的微生物種群類似，以Proteobacteria門為主。在屬水平上產(chǎn)生巨大差別，以丙酸鈉為碳源的系統(tǒng)中，除磷優(yōu)勢菌種Accumulibacter占比較大，為30.99%，而其余各組中占比均不高于5%；而以乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖為碳源的系統(tǒng)中所含PAOs的競爭菌種Defluviicoccus占比較大，分別為17.44%、11.68%、12.01%，在丙酸鈉系統(tǒng)中占比僅為1.12%。