響應面法優(yōu)化辣木籽多肽飲料配方及其抗運動疲勞作用的研究

馬 麗，馬 英

（1.新疆巴音郭楞職業(yè)技術學院，新疆 庫爾勒 841000；2.新疆科技學院，新疆 庫爾勒 841000）

運動性疲勞指在長時間運動下，機體因產生疲勞感而不能維持既定的運動狀態(tài)。國內外研究均已表明，機體運動性疲勞可能與運動后體內氧化應激水平有關，當體內氧化與抗氧化平衡態(tài)勢被打破，高強度的肌肉收縮致使活性氧（Reactive oxygen species, ROS）/NO 濃度不斷提高，從而抑制骨骼肌的收縮能力和能量輸出，同時，血液流量下降，使得身體各組織、器官的供氧量降低，進一步加重疲勞感[1-2]。目前，國內外已有文獻顯示，小麥、豌豆、堇葉碎米薺等中的植物蛋白肽能增強體內抗氧化應激能力，大幅提升紅細胞的攜氧水平，避免過度運動造成的骨骼肌蛋白分解，同時，優(yōu)化細胞代謝水平，促使不平衡的機體環(huán)境回到穩(wěn)態(tài)，從而消除機體疲勞，延長運動時間[3-5]，開發(fā)與利用食源性活性肽的生物活性已成為當今食品領域的研究熱點之一。

辣木（Moringa oleifera）為辣木科辣木屬多年生熱帶落葉喬木，在我國南方多數省份均有種植，由于其具有較好的抗氧化活性[6-7]，我國衛(wèi)生部在2012 年批準其作為新資源食品，其籽、葉、花及根部等均可用于營養(yǎng)食品的開發(fā)。盡管目前辣木糕點、辣木面條、辣木蛋糕及辣木紅茶、辣木保健酒等常規(guī)食品被開發(fā)上市銷售，但對辣木的精細開發(fā)與深度利用仍有不足。辣木籽富含油脂、蛋白質、多糖及黃酮、多酚類物質等營養(yǎng)成分，蛋白質含量高達30%以上[8-9]。梁麗麗[10]和林戀竹等[11]均對辣木籽多肽進行了分離純化，發(fā)現該多肽對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羥基自由基等氧自由基清除作用較強，可提高細胞內抗氧化酶活性，保護體內氧化損傷的細胞，進而預測其對運動疲勞具有一定的潛在作用，但未進行深入研究。本文以辣木籽多肽為原料，通過單因素試驗與響應面分析，優(yōu)化辣木籽多肽飲料的最佳配方，并考察其在體內的抗運動疲勞活性，以期為辣木資源的深度利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

辣木籽（產自云南昆明），購于云南杞道農業(yè)科技發(fā)展有限公司；NS37071 蛋白酶（2×105U/g），丹麥諾維信公司；赤蘚糖醇、甜菊糖苷、檸檬酸、羧甲基纖維素鈉，均為食品級市售產品；乳酸（LA）、血尿素氮（BUN）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒，南京建成生物技術研究所；試驗用水均為蒸餾水；其余試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

實驗動物：普通級健康雄性小鼠100 只，體質量16～27 g，河南省實驗動物中心，動物許可證號為：SCXK（豫）2017-001。

1.1.2 儀器與設備

FA2204B型電子分析天平，山東博科生物產業(yè)有限公司；GL21M型離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；YTQG-100 型脫氣機，溫州市永康機械科技有限公司；YT-774 型均質機，湖北英拓智能裝備有限公司；752N型紫外-可見分光光度計，山東博科生物產業(yè)有限公司；DHG-9141A型恒溫干燥箱，上海精其儀器有限公司；pHS-3E型pH計，上海儀電分析儀器有限公司；NDJ-5S 型旋轉黏度計，上海方瑞儀器有限公司；NanoBrook 90Plus型激光粒度儀，美國Brookhaven公司；LGJ-12S型冷凍干燥機，南北儀器有限公司；HT711ATC型手持折光儀，濟寧辰信機械設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 辣木籽多肽制備

將干燥脫殼后的辣木籽粉碎成末，過80目篩，在料液比1∶6（g/mL）條件下，將一定質量的辣木籽粉末置于60 ℃水中，調節(jié)pH 至8.0，恒溫攪拌1 h 后加入NS37071 蛋白酶，添加量為辣木籽粉質量的2.5%，降溫至55 ℃進行酶解，24 h后將其置于沸水浴中滅活，冷卻至室溫，離心（10 000 r/min，10 min），清除上層油相，取上清液減壓濃縮。向濃縮液中加入一定體積的無水乙醇，使溶液中乙醇體積分數達到60%，攪拌均勻靜置過夜后離心（4 500 r/min，10 min），收集醇沉組分，減壓干燥去除乙醇，冷凍干燥，即得辣木籽多肽[11]。

1.2.2.2 飲料調配

向一定量水中加入辣木籽多肽，攪拌溶解均勻，依次加入復合甜味劑（赤蘚糖醇與甜菊糖苷質量比1∶1）與檸檬酸，調節(jié)溶液酸甜度，并加適量羧甲基纖維素鈉，提高溶液穩(wěn)定性。

1.2.2.3 均質、脫氣灌裝

將調配完成的混合溶液置于均質機中，于55～60 ℃下均質，90～95 kPa 下脫氣處理，灌裝于潔凈的玻璃瓶內。

1.2.2.4 滅菌、冷卻

將灌裝后的產品置于滅菌柜內，于115 ℃下滅菌10 min，冷卻至室溫，即得成品。

1.2.3 感官評價

根據相關多肽飲料的感官評價方法[12-13]，選擇氣味、口感、色澤與穩(wěn)定性作為感官評價指標，挑選10位具有評價經驗的人員，按照表1評價標準對不同飲料樣品進行評價，去掉最高分和最低分后的平均值即為該飲料的感官評分結果。

表1 多肽飲料的感官評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria of the polypeptide beverage

1.2.4 單因素試驗設計

固定辣木籽多肽添加量50 g/L、復合甜味劑添加量40 g/L、檸檬酸添加量3 g/L、羧甲基纖維素鈉添加量0.6 g/L，分別考察不同辣木籽多肽添加量（10、30、50、70、90 g/L）、復合甜味劑添加量（20、40、60、80、100 g/L）、檸檬酸添加量（1、2、3、4、5 g/L）及羧甲基纖維素鈉添加量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）對飲料感官品質的影響。

1.2.5 響應面試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，利用Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以辣木籽多肽添加量（A）、復合甜味劑添加量（B）、檸檬酸添加量（C）和羧甲基纖維素鈉添加量（D）為影響因素，以感官評分為評價指標，進行響應面試驗，因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment單位：g/L

1.2.6 測定項目與方法

可溶性固形物含量：參照NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法》[14]，使用折射儀測定飲料中可溶性固形物含量；pH：使用pH計測定；蛋白質含量：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[15]，采用凱氏定氮法測定飲料中蛋白質含量；多肽含量：參照GB/T 22492—2008《大豆肽粉》[16]中TCA-NSI法檢測飲料中多肽含量；黏度：利用旋轉黏度計測定飲料的黏度；粒徑：使用激光粒度儀測定冷藏后飲料的分散質粒徑分布；微生物指標：分別參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[17]和GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》[18]檢測多肽飲料的細菌總數及大腸菌群。

1.2.7 抗運動疲勞研究

1.2.7.1 試驗設計

所有實驗動物經適應性喂養(yǎng)5 d后，隨機均分為5組，參考《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》[19]要求，隨機選取3組動物分別經口灌胃0.1、0.2、0.4 mL·g-1多肽飲料，作為飲料的低、中、高劑量組，另選擇1組動物作為陰性對照組，灌胃不含辣木籽多肽的飲料溶液，劑量為0.4 mL·g-1，余下動物為空白對照組，灌胃等量的生理鹽水，所有動物均每日灌胃1次，連續(xù)灌胃30 d。

1.2.7.2 負重游泳時間

各組動物隨機選擇10 只小鼠，于鼠尾綁系相同質量的重物，置于恒溫（25±2）℃泳池內，記錄小鼠自入水至沉沒10 s無法浮出水面的時間，即為負重游泳時間[20]，并計算各劑量組動物較空白對照組的負重游泳時間延長率，計算公式如下：

1.2.7.3 LA與BUN含量測定

將各組剩余小鼠分別置于恒溫泳池內，游泳20 min后取出，休息10 min，眼眶采血制備血清，通過試劑盒檢測LA與BUN含量[21]。

1.2.7.4 SOD與CAT活性測定

將處死后小鼠的肝臟組織加入鹽水，制成10%肝臟勻漿后，通過試劑盒檢測SOD與CAT活性[22]。

1.2.8 數據處理

所有飲料配方研究試驗均平行測定5次，結果以x±s表示，通過SPSS 18.0軟件對動物實驗組間結果進行t檢驗，P＜0.05 表示差異具有顯著性，P＜0.01 表示差異具有極顯著性。

2 結果與分析

2.1 辣木籽多肽添加量的篩選

圖1為不同添加量的辣木籽多肽對飲料感官評分的影響。由圖1可見，隨著辣木籽多肽添加量的增多，飲料的感官評分先緩慢增加，后明顯減小，當添加量為50 g/L時，感官評分達到85.9分。增大多肽添加量有利于提高飲料的植物蛋白風味，但添加量過大，多肽分子易聚集形成粒徑較大的顆粒，造成溶液體系不穩(wěn)定，靜置一段時間后，沉淀明顯增加并出現結塊，這與張強[23]研究枸杞大豆蛋白復配飲料的結果相近。因此，選擇辣木籽多肽添加量30、50、70 g/L作為后續(xù)響應面分析考察水平。

圖1 辣木籽多肽添加量對飲料感官評分的影響Fig.1 Effects of Moringa oleifera seed polypeptides additions on sensory scores of the beverage

2.2 復合甜味劑添加量的篩選

圖2為不同添加量的復合甜味劑對飲料感官評分的影響。由圖2可見，隨著復合甜味劑添加量增加至40 g/L，飲料的感官評分達到最高，隨后開始下降。赤蘚糖醇作為新型甜味劑具有熱量小、甜度低、溶解性好等特點，而甜菊糖苷的熱量遠低于蔗糖，且對熱穩(wěn)定，其與赤蘚糖醇復配具有增強甜度的效果[24]，但二者的混合物添加量過多會造成飲料的口感失衡，掩蓋了辣木籽特有的風味。因此，選擇復合甜味劑添加量20、40、60 g/L作為后續(xù)響應面分析考察水平。

圖2 復合甜味劑添加量對飲料感官評分的影響Fig.2 Effects of compound sweetener additions on sensory scores of the beverage

2.3 檸檬酸添加量的篩選

圖3為不同添加量的檸檬酸對飲料感官評分的影響。隨著飲料中檸檬酸添加量的增加，多肽飲料的感官評分呈先增加后減小的趨勢，當檸檬酸添加量為3 g/L 時，飲料的感官評分最高。檸檬酸作為飲料常用的酸味劑，適量的添加有利于豐富飲料的酸甜口味，并伴有清涼的口感，但若添加量過多會使酸味過于突出，酸澀感明顯。因此，選擇檸檬酸添加量2、3、4 g/L作為后續(xù)響應面分析考察水平。

圖3 檸檬酸添加量對飲料感官評分的影響Fig.3 Effects of critic acid additions on sensory scores of the beverage

2.4 羧甲基纖維素鈉添加量的篩選

圖4與圖5 分別為不同添加量的羧甲基纖維素鈉對飲料感官評分、黏度和分散質粒徑的影響。隨著飲料中羧甲基纖維素鈉添加量的增多，多肽飲料的感官評分先增大后減小，分散質粒徑卻先減小后增大，而黏度不斷增大，當添加量為0.6 g/L 時，飲料感官評分最高，分散質粒徑最小。羧甲基纖維素鈉作為飲料常用陰離子穩(wěn)定劑，在酸性環(huán)境中，易與多肽分子表面靜電吸附，可通過空間位阻效應避免多肽聚沉，若添加量過多，會在多肽分子表面造成多層吸附，使得飲料中分散質的粒徑與溶液黏度增大，從而影響飲料的組織形態(tài)及口感[25]。因此，選擇羧甲基纖維素鈉添加量0.4、0.6、0.8 g/L 作為后續(xù)響應面分析考察水平。

圖4 羧甲基纖維素鈉添加量對飲料感官評分的影響Fig.4 Effects of sodium carboxymethylcellulose additions on sensory scores of the beverage

圖5 羧甲基纖維素鈉添加量對飲料黏度與分散質粒徑的影響Fig.5 Effects of sodium carboxymethylcellulose additions on viscosity and particle sizes of the beverage

2.5 響應面試驗分析與優(yōu)化

2.5.1 回歸模型的建立與分析

以多肽飲料中辣木籽多肽、復合甜味劑、檸檬酸及羧甲基纖維素鈉的添加量為考察因素，多肽飲料的感官評分為響應值，進行四因素三水平響應面優(yōu)化試驗，試驗設計方案與結果見表3。

表3 響應面試驗設計方案與結果Table 3 Design scheme and results of response surface experiment

采用Design Expert 8.0軟件對回歸模型進行方差分析，結果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

對表3中的數據進行回歸分析，得到各考察因素對響應值的二次多項回歸模型：Y=85.14+1.03A+3.22B+1.70C+2.08D-2.33AB-0.62AC+0.67AD+0.62BC+0.45BD+1.89CD-2.09A2-4.96B2-5.06C2-4.94D2。由表4可知，該回歸模型的P＜0.01，表明該模型回歸效果極顯著，試驗結果可靠性高，由模型的失擬項P＞0.05可知，該模型能夠準確反映各考察因素與感官評分之間的關系，另外，模型的決定系數為0.961 1，校正決定系數為0.918 9，可知該模型擬合度高，從而可利用其預測多肽飲料的最佳配方。該模型所有一次項和二次項、辣木籽多肽添加量與復合甜味劑添加量交互項、檸檬酸添加量與羧甲基纖維素鈉添加量交互項對響應值均有極顯著影響（P＜0.01），而其他交互作用的影響均不顯著。各考察因素對多肽飲料感官評分的影響順序為：復合甜味劑添加量（B）＞羧甲基纖維素鈉添加量（D）＞檸檬酸添加量（C）＞辣木籽多肽添加量（A）。

2.5.2 響應曲面交互作用分析與最佳配方驗證

響應曲面是響應值對各考察因素的函數圖形，可直觀反映各考察因素之間的交互作用。由圖6 可知，辣木籽多肽添加量與復合甜味劑添加量交互曲面、檸檬酸添加量與羧甲基纖維素鈉添加量交互曲面的陡度較高，表明飲料的感官評分受其交互作用影響較大。同時可見，隨著各交互因素值的增加，響應值呈先增大后減小的趨勢。

圖6 各因素交互作用對飲料感官評分影響的響應面圖Fig.6 Response surfaces plots showing the interaction effects of each factor on the sensory scores of the beverage

采用Design Expert 8.0軟件對該模型進行極值分析，得出辣木籽多肽飲料的最佳配方為：辣木籽多肽添加量50.7 g/L，復合甜味劑添加量47.1 g/L，檸檬酸添加量3.2 g/L，羧甲基纖維素鈉添加量0.7 g/L，為便于實際配制，采用如下條件：辣木籽多肽添加量50 g/L，復合甜味劑添加量47 g/L，檸檬酸添加量3.2 g/L，羧甲基纖維素鈉添加量0.7 g/L，制得的飲料感官評分為（89.4±1.1）分，與預測值（86.9分）接近，表明該模型預測結果準確可靠。

2.6 多肽飲料品質分析

根據確定的飲料最佳配方配制成的辣木籽多肽飲料溶液透亮，酸甜適宜，伴有辣木籽特有風味，組織均一，無明顯沉淀。辣木籽多肽飲料pH為4.2，可溶性固形物含量為10.2%，蛋白質含量為4.1%，多肽含量為2.8%，黏度為18.5 mPa·s，菌落總數＜100 CFU/mL，大腸桿菌未檢出。

2.7 抗運動疲勞效果

2.7.1 負重游泳時間比較

由表5 可見，與空白對照組相比，隨著多肽飲料灌胃量的增多，各組動物的負重游泳時間逐漸延長，延長率分別為9.1%、14.3%、20.1%，中、高劑量組與空白對照組之間有極顯著性差異（P＜0.01），表明辣木籽多肽飲料具有較好的抗運動疲勞作用，有助于提高小鼠的運動耐力，動物負重游泳時間的長短與飲料的灌胃量呈一定的劑量依賴性。另外，陰性對照組與空白對照組的負重游泳時間無顯著性差異，表明飲料中其他組分對小鼠運動耐力的提高無幫助。

表5 各組小鼠的負重游泳時間Table 5 Weight loading swimming time of mice in different groups

2.7.2 LA與BUN含量比較

機體劇烈運動一段時間后，體內碳水化合物會以無氧酵解方式提供能量，產生較多的乳酸，大量乳酸的積累一方面可造成肌肉收縮能力下降，另一方面使得血液pH 值下降，影響體內循環(huán)系統(tǒng)的正常工作，增加疲勞感[26]。同時，當體內碳水化合物不足，無法正常供能時，蛋白質與氨基酸分解以滿足能量需求，其代謝產物BUN含量逐漸升高[27]。

表6 為運動后小鼠的LA與BUN含量。與空白對照組相比，低、中、高劑量組小鼠的LA與BUN含量均明顯下降，其中低劑量組LA與BUN分別減小0.7 mmol/L和0.4 mmol/L，較空白對照組無顯著性差異，中劑量組LA與BUN含量分別減小1.2 mmol/L和0.9 mmol/L，具有顯著性差異（P＜0.05），而高劑量組LA含量比空白對照組低1.5 mmol/L，二者具有極顯著性差異（P＜0.01），BUN 含量較空白對照組低1.2 mmol/L，二者具有顯著性差異（P＜0.05），綜上可知，多肽飲料的灌胃量越多，小鼠的LA與BUN含量下降幅度越大，因此，辣木籽多肽飲料有助于延緩體內LA的生成或加快其代謝，減少BUN 的生成，從而提高機體的運動耐力。這與張強[23]研制的枸杞大豆多肽復配飲料的動物實驗結果相近。另外，陰性對照組的LA與BUN含量較空白對照組無顯著性差異，表明多肽飲料中其他組分對體內LA與BUN含量無影響。

表6 運動后各組小鼠的LA與BUN含量Table 6 LA and BUN contents of mice in different groups after exercise單位：mmol·L-1

2.7.3 SOD與CAT活性比較

SOD 與CAT 均為體內重要的抗氧化酶，可以幫助減輕劇烈運動下活性氧自由基對細胞的氧化損傷，其中SOD 能夠歧化超氧自由基生成過氧化氫和氧氣，而CAT則可分解過氧化氫生成氧氣與水，避免劇烈運動下體內過多的超氧自由基累積[28]。表7 為運動后小鼠的SOD 與CAT 活性。與空白對照組相比，低、中、高劑量組小鼠的SOD 與CAT 活性均明顯增加，其中SOD 活性分別升高10.0、33.1、45.4 U/mg，CAT 活性分別升高5.4、7.7、9.8 U/mg，低劑量組SOD活性與空白對照組之間無顯著性差異，但CAT 活性與空白對照組之間具有顯著性差異（P＜0.05），中、高劑量組的SOD、CAT 活性與空白對照組之間均具有極顯著性差異（P＜0.01）。因此，辣木籽多肽飲料可增強機體的SOD 與CAT 活性，從而減輕體內的氧化應激反應，緩解機體的運動疲勞感，但陰性對照組的SOD、CAT 活性與空白對照組之間無顯著性差異，表明多肽飲料中其他組分對體內SOD 與CAT 活性無影響。

表7 運動后各組小鼠的SOD與CAT活性Table 7 SOD and CAT activities of mice in different groups after exercise單位：U·mg-1

3 結論

本研究以辣木籽多肽為原料，通過單因素與響應面試驗確定辣木籽多肽飲料的配方，并利用動物實驗考察其抗運動性疲勞作用。根據響應面試驗建立多元回歸模型的極值分析結果，確定了辣木籽多肽飲料的最佳配方為：辣木籽多肽添加量50 g/L，復合甜味劑添加量47 g/L，檸檬酸添加量3.2 g/L，羧甲基纖維素鈉添加量0.7 g/L，采用該配方制得的飲料感官評分為（89.4±1.1）分，與預測值接近，所得飲料溶液透亮，酸甜適宜，伴有辣木籽特有風味，組織均一，無明顯沉淀。另外，從動物實驗結果可知，與空白對照組相比，中、高劑量（0.2、0.4 mL·g-1）的多肽飲料有助于加快運動生成的LA 代謝，減少機體蛋白質與氨基酸的分解，提高體內SOD與CAT活性，且與空白對照組間具有顯著性差異（P＜0.05），因此具有良好的抗運動疲勞效果，但其具體的抗運動疲勞機制仍有待進一步研究。