山東某地區(qū)產(chǎn)氣莢膜梭菌的分子型別與耐藥特征

鐘佳鑫?王媛媛?白璐璐?鄭浩然?周海健?吳媛?盧金星

摘要：目的 分析山東省某地區(qū)臨床及動(dòng)物中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌的分子型別及耐藥特征。方法 對(duì)山東省56株產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行PFGE、MLST分子分型、藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測，比較分析同一來源菌株內(nèi)部和不同來源菌株間的型別和耐藥特征。結(jié)果 56株產(chǎn)氣莢膜梭菌分為53個(gè)PFGE型，有50株菌表現(xiàn)出獨(dú)特的型別。MLST分型將其分為46個(gè)ST型，其中40種ST型僅包含一株菌。本研究中菌株均對(duì)萬古霉素，美羅培南和頭孢西丁表現(xiàn)為敏感；對(duì)甲硝唑、青霉素、莫西沙星和氯霉素的耐藥率相對(duì)比較低，分別為3.57%、7.14%、8.93%和1.79%；然而，對(duì)克林霉素的耐藥率高達(dá)53.57%，人類來源菌株與動(dòng)物來源菌株的耐藥譜呈現(xiàn)出較為明顯的差異?；谌蚪M的耐藥基因分析顯示，所有56株產(chǎn)氣莢膜梭菌均攜帶mprF基因，其次是tetA（P） （98.21%），tetB（P） （87.5%）以及ermQ （51.79%）。結(jié)論 我國山東某地區(qū)臨床來源與動(dòng)物來源產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥譜存在顯著差異，同一地區(qū)的菌株分子型別具有很強(qiáng)的多樣性。需要開展更全面的的系統(tǒng)監(jiān)測為制定控制措施提供流行病學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌；脈沖場凝膠電泳分型；多位點(diǎn)序列分型；抗菌藥物敏感性；耐藥基因；分子流行病學(xué)

中圖分類號(hào)：R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Molecular typing and drug resistance characteristics of Clostridium perfringens in Shandong Area

Zhong Jiaxin， Wang Yuanyuan， Bai Lulu， Zheng Haoran ， Zhou Haijian ， Wu Yuan， and Lu Jinxing

（State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control， Institute of Infectious Disease Prevention and Control， Chinese Center for Disease Control and Prevention， Beijing 102206）

Abstract? ?Objective? ?To analyze the molecular type and drug resistance characteristics of Clostridium perfringens isolated from clinics and animals in a region of Shandong Province. Methods? ?The molecular typing of PFGE and MLST， drug sensitivity tests， and drug resistance gene detection were performed on 56 strains of Clostridium perfringens in Shandong Province， and the phenotypic and drug resistance characteristics within and between strains of the same origin were compared and analyzed. Results? ? The 56 Clostridium perfringens strains were classified into 53 PFGE types， with 50 strains exhibiting unique phenotypes. The MLST typing classified them into 46 ST types， with 40 ST types containing only one strain. All strains in this study showed sensitivity to vancomycin， meropenem， and cefoxitin. Resistance rates to metronidazole， penicillin， moxifloxacin and chloramphenicol were relatively low. The resistance rates were 3.57%， 7.14%， 8.93%， and 1.79% respectively. However， resistance rates to clindamycin were as high as 53.57%， showing a more pronounced difference in the resistance profiles of strains of human versus animal origin. Genome-wide resistance gene analysis showed that all 56 Clostridium perfringens strains carried the mprF gene， followed by tetA（P） （98.21%）， tetB（P） （87.5%）， and ermQ （51.79%）. Conclusion? ? There are significant differences in the drug resistance profiles of Clostridium perfringens from clinical and animal sources in one region of Shandong， China. Molecular strains showed high diversity in the same region. More comprehensive and systematic surveillance is needed to provide an epidemiological basis for control measures.

Key words Clostridium perfringens; Pulsed-field gel electrophoresis typing; Multilocus sequence typing; Antimicrobial susceptibility; Drug resistance genes; Molecular epidemiology

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種在自然界中廣泛存在的革蘭陽性厭氧菌。該細(xì)菌在動(dòng)物和人類中都能引起氣性壞疽、腸道疾病和食物中毒，是全球公認(rèn)的最重要的胃腸道病原體之一[1]。其重要的致病機(jī)制是產(chǎn)生多種毒素和酶[2]?？股叵嚓P(guān)性腹瀉（antibiotic-associated diarrhea，AAD）在住院患者和社區(qū)中仍然是一個(gè)主要的醫(yī)療問題，住院患者中產(chǎn)氣莢膜梭菌作為AAD相關(guān)細(xì)菌的患病率為14.9%，位于第二[3-4]。近年來，產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥性有所增加[5]，一些調(diào)查表明，大多數(shù)動(dòng)物來源的產(chǎn)氣莢膜梭菌為多重耐藥菌株（MDR）[6]。人類來源的產(chǎn)氣莢膜梭菌多重耐藥菌株比例很低[7]。然而，對(duì)中國產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性的研究尚且不足。

脈沖場凝膠電泳（PFGE）是最重要的檢測細(xì)菌基因型多樣性分子分型方法之一，由于其結(jié)果能夠檢測90%以上的細(xì)菌基因組，并且適用于廣泛的病原體，因此依舊被公認(rèn)為是食源性病原菌分型的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。本研究收集了2013—2020年山東地區(qū)一家三級(jí)綜合醫(yī)院從臨床標(biāo)本中分離的菌株及山東地區(qū)3家養(yǎng)殖場分離的56株產(chǎn)氣莢膜梭菌，以脈沖場凝膠電泳（PFGE）和多位點(diǎn)序列分型（MLST）為分子工具并結(jié)合抗菌藥物敏感性檢測，旨在了解山東地區(qū)人與動(dòng)物源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株的異同。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源及基本情況

56株產(chǎn)氣莢膜梭菌來源于2017—2020年山東省某醫(yī)院抗生素相關(guān)腹瀉患者和山東某三家養(yǎng)殖場中的豬、牛和羊，人來源樣本按照AAD病例定義由臨床實(shí)驗(yàn)室收集；動(dòng)物來源樣本采集自新鮮的動(dòng)物糞便；樣本均帶回本課題組實(shí)驗(yàn)室檢測，經(jīng)16S rRNA測序?qū)Ψ蛛x菌株進(jìn)行鑒定。PFGE標(biāo)準(zhǔn)Marker菌株H9812由國家致病菌識(shí)別網(wǎng)PulseNet China提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

藥敏試驗(yàn)采用E-test條法，E-test條購自公司利飛馳，質(zhì)控菌株產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124購自美國模式菌種收集中心，細(xì)菌基因組DNA的提取使用天根生化科技有限公司的試劑盒，DNA Marker、Premix Taq購于北京奧科生物工程有限公司，PCR儀（德國Senso Quest Labcycler公司），PFGE圖像形成使用Bio-Rad公司的脈沖場凝膠電泳儀和Gel Doc XR+ 凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定及細(xì)菌基因組DNA提取

在血瓊脂平板上按照三區(qū)劃線原則進(jìn)行接種，置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃±1℃）在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)18～24 h，采用16S rRNA測序進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定。采用DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取菌株DNA。

1.2.2 PFGE實(shí)驗(yàn)和分析

參照國家致病菌識(shí)別網(wǎng)實(shí)驗(yàn)室使用的革蘭陽性菌標(biāo)準(zhǔn)化PFGE分子分型方法，對(duì)分離純化的產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行DNA膠塊的制備，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行脈沖場凝膠電泳分型。電泳條件：電壓6V/cm，脈沖參數(shù)0.5～40 s，電泳22 h。利用BioNumerics軟件讀取并聚類分析PFGE電泳圖譜。

1.2.3 多位點(diǎn)序列分型

8個(gè)管家基因引物序列colA、groEL、sodA、plc、gyrB、sigK、pgk和nadA參照PubMLST數(shù)據(jù)庫（https：//pubmlst.org/organisms/clostridium-perfringens）。引物序列由北京奧科生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體積為25 μL，Premix Taq 12.5 μL，前后引物各0.5 μL，模板1.5 μL，無菌水10 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，一個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min，1個(gè)循環(huán)[9]。取4 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物陽性的，送至北京奧科生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序，將序列提交到PubMLST官網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（https：//pubmlst.org/organisms/clostridium-perfringens）進(jìn)行比對(duì)，確定每株菌株的等位基因號(hào)與序列型（ST）并提交新的等位基因與ST型。

1.2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)

采用E-test條法，以美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）M100-S30， 2020文件和歐洲抗菌藥物敏感性測試委員會(huì)（EUCAST）v.10.0， 2020文件作為折點(diǎn)判讀標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)克林霉素、氯霉素、萬古霉素、頭孢西丁、美羅培南、甲硝唑、青霉素和莫西沙星8種抗菌藥物的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）進(jìn)行檢測（萬古霉素的MIC在CLSI中未標(biāo)明，以EUCAST中的折點(diǎn)作為判讀標(biāo)準(zhǔn)。其余7種抗菌藥物的MIC均以CLSI為為折點(diǎn)判讀標(biāo)準(zhǔn)。克林霉素（≥8 ?g/mL）、氯霉素（≥32 ?g/mL）、利福平（≥64 ?g/mL）、美羅培南（≥16 ?g/mL）、甲硝唑（≥32 ?g/mL）、青霉素（≥2 ?g/mL）、莫西沙星（≥2 ?g/mL）、萬古霉素（>2 ?g/mL）。質(zhì)控菌株為產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

挑取單克隆菌株接種于血瓊脂平板，37℃厭氧狀態(tài)下培養(yǎng)18～24 h，于布氏肉湯中將菌液濃度調(diào)整為3×108 CFU/mL。用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布在添加5%羊血、5 mg/L氯化血紅素和1 mg/L維生素K1的布氏平板上，待平板表面水分吸收后，貼E-test試條。置于37℃厭氧狀態(tài)下培養(yǎng)18～24 h后取出，進(jìn)行結(jié)果判讀，培養(yǎng)基表面水滴狀抑菌環(huán)指向的濃度值為檢測的MIC。

1.2.5 基于全基因組的耐藥基因分析

在注釋時(shí)，使用CARD數(shù)據(jù)庫中的工具軟件rgi將基因的蛋白序列分別數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，找出比對(duì)上的數(shù)據(jù)庫中對(duì)應(yīng)序列，并得到對(duì)應(yīng)的耐藥基因和耐藥基因相關(guān)信息。并設(shè)置參數(shù)“ ≥80% identity and ≥50% coverage”，比對(duì)上的基因描述于文中。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

耐藥譜構(gòu)成比差異使用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。最終使用Fisher確切概率法檢驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PFGE聚類分析

56株山東地區(qū)產(chǎn)氣莢膜梭菌共分為53個(gè)型別，其中3個(gè)型別包含2株菌，50個(gè)型別僅包含1株菌，即有50株菌表現(xiàn)出獨(dú)特的型別（圖1）。56株菌的PFGE圖譜相似性指數(shù)為35.6％～100％。通過PFGE分析，將56株菌分為2個(gè)主要類群即：“A”（19株）和“B”（37株），見圖1。這些菌株并沒有呈現(xiàn)出耐藥菌株聚為某一特定克隆群或抗生素相關(guān)性腹瀉菌株聚為某一克隆群，整體聚類特征表現(xiàn)出較強(qiáng)的多樣性。

這56株菌中37株來源于抗生素相關(guān)性腹瀉患者，共有36種帶型，Group 1包含兩個(gè)重復(fù)出現(xiàn)的帶型，在菌株17SD342和菌株17SD363中共有；19株來源于養(yǎng)殖場中的豬、牛和羊，Group 2（菌株SDY010與菌株SDY011）和Group 3（菌株SDY009與菌株SDY014）分別包含兩個(gè)重復(fù)出現(xiàn)的帶型?？股叵嚓P(guān)性腹瀉患者來源菌株和動(dòng)物來源菌株并沒有存在相同的帶型。

通過菌株的背景信息和基因指紋圖譜結(jié)合分析，分離自兩位抗生素相關(guān)性腹瀉患者的菌株（17SD342、17SD363）具有100%的遺傳相似性，代表同一種PFGE型別，且前一組同屬ST466。這一組條帶完全一致的菌株分離自山東一家醫(yī)院，且兩位患者的就醫(yī)時(shí)間接近，懷疑在就醫(yī)過程中產(chǎn)氣莢膜梭菌存在潛在的傳播。分離自山東綿羊的菌株（SDY010和SDY011）與（SDY009和SDY014）同屬于ST479，分別具有100%的遺傳相似性，這兩組條帶完全一致的菌株來自同一家綿羊養(yǎng)殖場，提示在養(yǎng)殖場內(nèi)可能存在產(chǎn)氣莢膜梭菌的傳播。

然而，整體PFGE結(jié)果提示不同宿主來源，差異較大，具有較強(qiáng)的遺傳多樣性。即使是分離自同一所醫(yī)院患者的菌株或分離自同一家養(yǎng)殖場的菌株也具有很強(qiáng)的遺傳多樣性。

本研究結(jié)果表明，PFGE和MLST在產(chǎn)氣莢膜梭菌分型方面均具有較高的分辨力。PFGE 類型與ST型別之間的一對(duì)一相關(guān)性表明，屬于同一ST型的一些分離株具有不同的PFGE型別，例如SDY009、SDY010、SDY011和SDY014同屬于ST479但被分為兩種不同的PFGE型別（圖1）；18SD078與SDY012同屬ST221但被分為兩種不同的PFGE型別；17SD155，17SD152，17SD154同屬ST62，但被分為3種不同的PFGE型別。而研究中相同PFGE分子型別的3組菌株（Group 1、Group 2、Group 3）分別屬于相同的ST型別（ST466、ST479、ST479）。因此，對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌來說，PFGE分型可能具有更高的分辨力，更適合用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的溯源研究。

2.2 MLST分型

56株產(chǎn)氣莢膜梭菌MLST分型共發(fā)現(xiàn)46個(gè)ST型，具有很強(qiáng)的遺傳多樣性，其中33株分離株出現(xiàn)新序列型，共27個(gè)新序列型，占分離株的58.93％。優(yōu)勢(shì)型別為ST479（5株），ST62（3株），ST221（2株），ST315（2株），ST372（2株），ST466（2株），其余40種ST型各1株。動(dòng)物來源菌株和人來源菌株的分布并沒有呈現(xiàn)出明顯的差異或聚為不同的克隆群。其中動(dòng)物來源的分離株優(yōu)勢(shì)型別為ST479（5株），人類來源的分離株優(yōu)勢(shì)型別為ST62（3株）。

使用BioNumerics軟件分析，得到最小生成樹（MST）（圖2）。根據(jù)參數(shù)（相鄰等位基因差異個(gè)數(shù)≤5，所包含的ST型≥3）[10]，本研究中屬于不同STs的山東來源產(chǎn)氣莢膜梭菌大部分（36株）聚在一起，表明按照此參數(shù)大部分山東地區(qū)的菌株相對(duì)親緣關(guān)系較近。其余菌株（20株）圍繞該克隆群呈散在分布，彼此之間存在較遠(yuǎn)的遺傳距離（管家基因差異≥6）。但如果縮小相鄰等位基因差異個(gè)數(shù)，例如將參數(shù)調(diào)為相鄰等位基因差異個(gè)數(shù)≤3，所包含的ST型≥3，則呈現(xiàn)出多個(gè)克隆群，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的多樣性。

2.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌的藥敏情況和耐藥基因檢測

所有試驗(yàn)菌株均對(duì)萬古霉素，美羅培南和頭孢西丁表現(xiàn)為完全敏感；對(duì)甲硝唑、青霉素、莫西沙星和氯霉素的耐藥率相對(duì)比較低，分別為3.57%、7.14%、8.93%和1.79%；然而，對(duì)克林霉素的耐藥率高達(dá)53.57%（圖3A）。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，山東地區(qū)人類來源菌株與動(dòng)物來源菌株的耐藥譜存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.006）（圖3B）。人類來源的部分菌株對(duì)莫西沙星、克林霉素、氯霉素耐藥，而動(dòng)物來源的部分菌株對(duì)甲硝唑、青霉素、莫西沙星、克林霉素耐藥。按動(dòng)物與人類來源分組的產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥譜見圖3B，無論物種，大多數(shù)菌株（63.16%與48.65%）都對(duì)克林霉素耐藥。對(duì)于人類來源的分離株，均對(duì)萬古霉素、美羅培南、甲硝唑、青霉素和頭孢西丁敏感，莫西沙星（5.41%）和氯霉素（2.70%）的耐藥率較低，而克林霉素的耐藥率（48.65%）則處于相對(duì)較高的水平。對(duì)于動(dòng)物來源的分離株，均對(duì)萬古霉素、美羅培南、頭孢西丁和氯霉素敏感，對(duì)測試抗生素耐藥率由高到低依次為克林霉素（63.16%）、青霉素（21.05%）、莫西沙星（15.79%）、甲硝唑（10.53%）。本研究中菌株的多重耐藥率較低，多重耐藥菌株（對(duì)大于等于3類抗菌藥物耐藥[11]）的比例為3.57%（2/56），分別從綿羊（SDY007）和腹瀉患者（JN4）中分離得到，屬于ST479與ST443，SDY007對(duì)甲硝唑、莫西沙星、克林霉素；JN4對(duì)莫西沙星、克林霉素、氯霉素3種抗生素耐藥（圖1）。沒有分離株對(duì)4種及以上的抗生素有耐藥性（圖1）。

耐藥基因檢測結(jié)果顯示，56株產(chǎn)氣莢膜梭菌中肽類抗生素中mprF基因攜帶率最高，為100%（56/56），其他基因未攜帶；氨基糖苷類抗生素中AAC（6'）-Ie-APH（2"）-Ia基因攜帶率最高，為33.93%（19/56）；ANT（6）-Ib基因攜帶率為21.43%（12/56），其他基因未攜帶；大環(huán)內(nèi)酯類/林可酰胺類/鏈陽霉素類（MLS）抗生素中ermQ基因攜帶率最高，為51.79%（29/56），ermA、ermB、ermT基因攜帶率分別為1.79%（1/56），8.93%（5/56），1.79%（1/56），其他基因未攜帶；林可酰胺抗生素中l(wèi)nuP基因攜帶率為26.78%（15/56），其他基因未攜帶；酚類抗生素中fexA基因攜帶率為1.79%（1/56），其他基因未攜帶；惡唑烷酮類抗生素、苯酚類抗生素中optrA基因攜帶率1.79%（1/56），其他基因未攜帶；四環(huán)素類抗生素中tetA（P）、tetB（P）和tet44基因的攜帶率為98.21%（55/56）、87.5%（49/56）、21.43%（12/56），均存在較高的攜帶率。

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種重要的食源性傳播病原體，是食物中毒最常見原因之一[4]。在美國產(chǎn)氣莢膜梭菌每年導(dǎo)致近100萬例食物中毒。同時(shí)研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌存在于健康的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中，如雞、牛、豬和羊等，并且可在零售市場的肉制品中分離出來[12-13]。因此，產(chǎn)氣莢膜梭菌是1種全球公認(rèn)的食源性傳播的人畜共患病原體，食源性傳播和動(dòng)物源性傳播是人類感染的主要來源。然而在中國對(duì)于不同宿主中的產(chǎn)氣莢膜梭菌分子特征研究依舊相對(duì)缺乏，需要利用PFGE和MLST分析其遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)，以提高對(duì)該病原體的全面認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步的監(jiān)測和調(diào)查研究提供前提。

在本研究的PFGE分析中，確定了兩個(gè)水平的多樣性：一方面，56株來自臨床患者與經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖動(dòng)物的樣本共分為53個(gè)型別，這表明產(chǎn)氣莢膜梭菌在不同的宿主中具有極強(qiáng)的遺傳多樣性；另一方面，17株健康綿羊中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌共分為15種不同的PFGE型別（圖1），37株臨床抗生素相關(guān)性腹瀉患者中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌共分為36種不同的PFGE型別，這表明產(chǎn)氣莢膜梭菌在同一宿主內(nèi)也具有很強(qiáng)的基因組多樣性。

從傳播鏈的角度來看，PFGE結(jié)果顯示，個(gè)別動(dòng)物來源與人類來源菌株的親緣關(guān)系范圍較近，相似度高達(dá)90%，如18SD099和SDY013，18SD153和SDY022，17SD242和SDY012，推測這種病原體可能存在養(yǎng)殖動(dòng)物和人類之間的傳播。同一家醫(yī)院中分離的菌株和同一家綿羊養(yǎng)殖場中分離的菌株分別出現(xiàn)了相同的PFGE分子型別，并且對(duì)應(yīng)相同的MLST分子型別，推斷在小范圍區(qū)域內(nèi)（AAD人群中和養(yǎng)殖綿羊中）可能存在菌株的克隆傳播。PFGE結(jié)果并不支持不同宿主（人與動(dòng)物來源）之間鏈條傳播，但是鑒于時(shí)間間隔性和地域間隔性，日后可再進(jìn)行一次大規(guī)模采集反映更加真實(shí)的情況。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種多重耐藥病原體。近年來的國內(nèi)外的研究表明在經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖動(dòng)物中，多重耐藥菌比例都極高[6，14]。青霉素已被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)作為食品性動(dòng)物生產(chǎn)的生長促進(jìn)劑，并已用于控制革蘭陽性菌，包括產(chǎn)氣莢膜梭菌；甲硝唑雖不允許用于動(dòng)物生產(chǎn)，但已明確收入國標(biāo)31650中允許動(dòng)物治療使用，這些飼養(yǎng)過程抗生素的添加可能是菌株耐藥率升高的原因。然而，在本研究中僅發(fā)現(xiàn)1株動(dòng)物來源多重耐藥菌，這可能與本研究所選抗生素多偏向臨床用藥相關(guān)，也可能是由于不同地區(qū)養(yǎng)殖場抗生素使用情況不同。對(duì)于臨床分離株而言，抗生素的使用情況不同是不同地區(qū)產(chǎn)氣莢膜桿菌耐藥率具有較大差異的主要驅(qū)動(dòng)因素。國外的耐藥情況較為樂觀。例如，在匈牙利、斯洛文尼亞和臺(tái)灣北部的一些研究表明，頭孢西丁、美羅培南和甲硝唑成功應(yīng)用于產(chǎn)氣莢膜菌感染治療，只有少數(shù)菌株對(duì)青霉素（2.6%）或克林霉素（3.8%）耐藥。然而，在本研究中，發(fā)現(xiàn)在山東地區(qū)的人源性菌株對(duì)克林霉素有很高的耐藥性（48.65%）。此外，最近來自意大利的數(shù)據(jù)顯示，克林霉素的耐藥性在梭菌屬中超過20%[6-14]。事實(shí)上，克林霉素一直被認(rèn)為是治療產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的一線藥物。因此，產(chǎn)氣莢膜梭菌高克林霉素耐藥研究結(jié)果表明克林霉素作為經(jīng)驗(yàn)治療應(yīng)引起重視。

本研究中，四環(huán)素耐藥基因（tet）和抗防御素基因（mprF）在產(chǎn)氣莢膜梭菌中檢出率極高，這與近年來的研究結(jié)果相一致[15]。四環(huán)素耐藥基因是該病原體中唯一廣泛傳播的AMR特異性基因，自20世紀(jì)80年代以來，編碼四環(huán)素外排蛋白的tetA（P）和tetB（P）是產(chǎn)氣莢膜梭菌中最常攜帶的抗性基因[15]。mprF基因（參與抗人類防御素）在所有產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組中都是保守的，這與其在宿主腸道定植的能力有關(guān)。其同源物可以抑制氨基糖苷類臨床抗生素，如萬古霉素和慶大霉素，然而本研究中菌株對(duì)于萬古霉素完全敏感，這些菌株攜帶耐藥基因，但無耐藥表型，可作為耐藥基因的“儲(chǔ)存庫”。另外值得關(guān)注的是，產(chǎn)氣莢膜梭菌可從其所在的環(huán)境（如腸道）獲得新的AMR基因，前抗生素時(shí)代的菌株基因組并沒有編碼tet[16]，這揭示了產(chǎn)氣莢膜梭菌在過去80年的進(jìn)化史上的抗生素選擇壓力。

然而，本研究依舊存在一些不足之處，還需不斷加大監(jiān)測力度，補(bǔ)充菌株以擴(kuò)大數(shù)據(jù)庫，將PFGE分子型別、MLST分子型別和產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，以期發(fā)現(xiàn)耐藥菌株是否存在優(yōu)勢(shì)PFGE分子型別與MLST分子型別，進(jìn)而預(yù)測菌株的耐藥流行趨勢(shì)并控制耐藥菌的傳播。

長期以來，由于產(chǎn)氣莢膜梭菌屬于條件致病菌，并未受到臨床重視，然而近年來該菌耐藥性逐步升高，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致院內(nèi)的暴發(fā)感染，導(dǎo)致嚴(yán)峻的的公共衛(wèi)生問題[17-18]，醫(yī)院應(yīng)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥菌監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查給予重視，本研究通過對(duì)山東地區(qū)的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株進(jìn)行PFGE與MLST分型并結(jié)合耐藥表型和耐藥基因分析以期對(duì)臨床和動(dòng)物養(yǎng)殖中在預(yù)防和治療該類細(xì)菌感染時(shí)有所幫助。

參 考 文 獻(xiàn)

Kiu R， Hall L J. An update on the human and animal enteric pathogen Clostridium perfringens[J]. Emerg Microb Infect， 2018， 7（1）： 1-15.

Rood J I， Adams V， Lacey J， et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme[J]. Anaerobe， 2018， 53： 5-10.

Carman R J. Clostridium perfringens in spontaneous and antibiotic-associated diarrhoea of man and other animals[J]. Rev Med Microbiol， 1997， 8： S46.

Motamedi H， Fathollahi M， Abiri R， et al. A worldwide systematic review and meta-analysis of bacteria related to antibiotic-associated diarrhea in hospitalized patients[J]. PLoS One， 2021， 16（12）： e260667.

Azimirad M， Gholami F， Yadegar A， et al. Prevalence and characterization of Clostridium perfringens toxinotypes among patients with antibiotic-associated diarrhea in Iran[J]. Scient Rep， 2019. doi： 10.1038/s41598-019-44281-5.

Bendary M M， Abd El-Hamid M I， El-Tarabili R M， et al. Clostridium perfringens associated with foodborne infections of animal origins： Insights into prevalence， antimicrobial resistance， toxin genes profiles， and toxinotypes[J]. Biology， 2022， 11（4）： 551.

Lopez-Canovas L， Martinez Benitez M B， Herrera Isidron J A， et al. Pulsed field gel electrophoresis： Past， present， and future[J]. Analyt Biochem， 2019， 573： 17-29.

Deguchi A， Miyamoto K， Kuwahara T， et al. Genetic characterization of type A enterotoxigenic Clostridium perfringens strains[J]. PLoS One， 2009， 4（5）： e5598.

Xiao Y， Wagendorp A， Moezelaar R， et al. A wide variety of Clostridium perfringens type A food-borne isolates that carry a chromosomal cpe gene belong to one multilocus sequence typing cluster[J]. Appl Environm Microbiol， 2012， 78（19）： 7060-7068.

M100-S11， Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[J]. Clin Microbiol Newsl， 2001， 23（6）： 49.

Verma A K， Abdel-Glil M Y， Madesh A， et al. Multilocus sequence typing of Clostridium perfringens strains from neonatal calves， dairy workers and associated environment in India[J]. Anaerobe， 2020， 63： 102212.

Lin Y T， Labbe R. Enterotoxigenicity and genetic relatedness of Clostridium perfringens isolates from retail foods in the United States[J]. Appl Environ Microbiol， 2003， 69（3）： 1642.

Xiu L， Liu Y， Wu W， et al. Prevalence and multilocus sequence typing of Clostridium perfringens isolated from 4 duck farms in Shandong province， China[J]. Poultry Sci， 2020， 99（10）： 5105-5117.

Sarvari K P， Schoblocher D. The antibiotic susceptibility pattern of gas gangrene-forming Clostridium spp. clinical isolates from south-eastern hungary[J]. Infect Dis （Lond）， 2020， 52（3）： 196-201.

Kiu R， Caim S， Alexander S， et al. Probing genomic aspects of the multi-host pathogen Clostridium perfringens reveals significant pangenome diversity， and a diverse array of virulence factors[J]. Front Microbiol， 2017， 8： 2485.

Lyras D， Rood J I. Genetic organization and distribution of tetracycline resistance determinants in Clostridium perfringens[J]. Antimicrob Agents Chemother， 1996， 40（11）： 2500-2504.

Maslanka S E， Kerr J G， Williams G， et al. Molecular subtyping of Clostridium perfringens by pulsed-field gel electrophoresis to facilitate food-borne-disease outbreak investigations[J]. J Clin Microbiol， 1999， 37（7）： 2209-2214.

Brzychczy-W?och M， Bulanda M. Analysis of genetic similarities between Clostridium perfringens isolates isolated from patients with gas gangrene and from hospital environment conducted with the use of the PFGE method. [J]. Polski Przegl Chirurg， 2014， 86（3）： 141-146.

收稿日期：2022-11-16

基金項(xiàng)目：傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究課題（No. 2021SKLID207）

作者簡介：鐘佳鑫，女，生于1997年，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)楫a(chǎn)氣莢膜梭菌分子流行病學(xué)，疾病預(yù)防與控制，E-mail：

zhongjiaxin97@163.com

*通信作者，E-mail： lujinxing@icdc.cn