廣西北部灣來源植物內(nèi)生真菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒活性研究

王玉妃?余慧琳?王詩(shī)怡?孔凡棟?周麗曼?王聰

摘要：目的 從北部灣紅樹林區(qū)采集的植物樣品中分離真菌，并從中發(fā)現(xiàn)具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。方法 采用10倍稀釋法通過3種培養(yǎng)基分離北部灣紅樹林岸邊植物中的真菌，發(fā)酵后進(jìn)行化學(xué)成分分析，篩選優(yōu)先研究菌株，并采用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)對(duì)優(yōu)選菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，通過波譜方法和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比解析鑒定化合物結(jié)構(gòu)，采用CCK-8法進(jìn)行化合物細(xì)胞毒活性檢測(cè)。結(jié)果 從北部灣紅樹林區(qū)來源的4個(gè)植物樣品中共分離得到94株真菌，篩選出3株優(yōu)選菌株，從中分離的3個(gè)主產(chǎn)物，分別鑒定為phomoxanthone A（1）、isomeleagrin（2）和（-）-（6S， 1'S）-pestalotin（3）。細(xì)胞毒活性測(cè)試表明，化合物1和2具有多種細(xì)胞毒活性。結(jié)論 首次發(fā)現(xiàn)isomeleagrin對(duì)5637人膀胱癌細(xì)胞、DU145人前列腺癌細(xì)胞、A673人橫紋肌肉瘤細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒活性，紅樹林區(qū)來源真菌具有產(chǎn)生細(xì)胞毒活性化合物的潛力。

關(guān)鍵詞：廣西北部灣；真菌；次生代謝產(chǎn)物；細(xì)胞毒活性

中圖分類號(hào)：R978.1? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Endophytic fungi and their secondary metabolites from plants in Guangxi Beibu Gulf study on cytotoxic activity

Wang Yufei， Yu Huilin， Wang Shiyi， Kong Fandong， Zhou Liman， and Wang Cong

（Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products， State Ethnic Affairs Commission， Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products， Guangxi Collaborative Innovation Center for Chemistry and Engineering of Forest Products， Key Laboratory of Universities In Guangxi for Excavation and Development of Ancient Ethnomedicinal Recipes，

Guangxi Minzu University， Nanning 530006）

Abstract Objective Fungi were isolated from plant samples collected from the mangrove area of Beibu Gulf to find active secondary metabolites. Methods Fungi were isolated from mangrove riparian plants in Beibu Gulf by 10-fold dilution method using three media. After fermentation， the chemical composition analysis was carried out to screen the priority research strains. The secondary metabolites of the preferred strains were isolated and purified by modern chromatographic separation technology. The structures of the compounds were identified by spectral methods and literature data. The cytotoxic activity of the compounds was detected by CCK-8 method. Results A total of 94 strains of fungi were isolated from four plant samples from the mangrove area of Beibu Gulf， and three preferred strains were screened. Three main products were isolated and identified as phomoxanthone A（1）， isomeleagrin（2） and （-）-（6S， 1'S）-pestalotin（3）. Cytotoxic activity tests showed that compounds 1 and 2 had a variety of cytotoxic activities. Conclusion It was found for the first time that isomeleagrin had certain cytotoxic activity against 5637 human bladder cancer cells， DU145 human prostate cancer cells and A673 human rhabdomyosarcoma cells. Mangrove-derived fungi have the potential to produce cytotoxic active compounds.

Key words Beibu Gulf of Guangxi; Fungi; Secondary metabolites; Cytotoxic activity

紅樹林是一種由海洋向陸地過渡的特殊生境，包括紅樹植物及其生態(tài)下所有生物群落[1]，具有鹽漬化、沼澤化、厭氧、高溫、強(qiáng)紫外輻射、有機(jī)質(zhì)含量高的特點(diǎn)[2]。其極端的生態(tài)環(huán)境刺激相關(guān)微生物激活沉默基因，激發(fā)生物合成潛力，進(jìn)而產(chǎn)生具有顯著生物活性和新穎結(jié)構(gòu)的代謝物，包括肽類、萜類、酯類、酚類、聚酮類、多糖類等，它們具有抗癌、抗菌、抗炎、抗感染、抗病毒等特性[3-4]。近年來，紅樹林真菌在生物活性分子研究中的應(yīng)用日益廣泛[5]，被認(rèn)為是尋找藥物先導(dǎo)化合物的重要資源庫(kù)，是具有潛力的生物多樣性熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[6]。

廣西北部灣地處熱帶和亞熱帶區(qū)域，擁有多個(gè)海草床生長(zhǎng)區(qū)和國(guó)內(nèi)最大紅樹林區(qū)[7-8]，具有豐富的微生物類群和進(jìn)行藥物研發(fā)的獨(dú)特資源優(yōu)勢(shì)。自2002—2022年，已發(fā)現(xiàn)87種新化合物和50種已知活性化合物，其中不乏結(jié)構(gòu)新穎和活性顯著的化合物，近年來已成為微生物資源與化學(xué)研究的熱點(diǎn)區(qū)域之一[9-10]。

本研究采用10倍稀釋法從廣西北部灣欽州紅樹林區(qū)采集的4種植物樣品水龍、黃嬋、丁香蓼和蓮子草中進(jìn)行真菌分離，共獲得94株真菌，使用2種培養(yǎng)基對(duì)獲得的菌株進(jìn)行發(fā)酵并對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，結(jié)合HPLC化學(xué)篩選，確定了3株優(yōu)先研究菌株，分離鑒定了其主要次級(jí)代謝產(chǎn)物分別為phomoxanthone A（1）、isomeleagrin（2）、（-）-（6S，1'S）-pestalotin（3）。用CCK-8法對(duì)3個(gè)化合物分別進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測(cè)，結(jié)果表明化合物1和2都具有多種細(xì)胞毒活性，其中首次發(fā)現(xiàn)化合物2對(duì)5637人膀胱癌細(xì)胞的增殖抑制活性較強(qiáng)，對(duì)A673、L-02、DU145細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

水龍（Ludwigia adscendens （L.） Hara）、黃嬋（Allamanda schottii Pohl）、丁香蓼（Ludwigia prostrata Roxb.）、蓮子草（Alternanthera Sessilis （Linn.） DC.）共4個(gè)植物樣品均采自廣西北部灣欽州。水龍（21°54'2''，108°36'45''）、黃嬋（21°54'8''，108°36'22''）、丁香蓼（21°53'56''，108°36'51''）、蓮子草（21°54'5''，108°36'50''）。

1.1.2 分離培養(yǎng)基（添加氯霉素為5 mg/100 mL）

PDA培養(yǎng)基（g/100 mL）：葡萄糖2.0，馬鈴薯20.0，瓊脂2.0，海水素3.3。

真菌2號(hào)培養(yǎng)基（g/100 mL）：味精1.0，磷酸二氫鉀0.05，海水素3.3，酵母膏0.3，瓊脂2.0，麥芽糖2.0，葡萄糖1.0，甘露醇2.0。

孟加拉紅培養(yǎng)基（g/100 mL）：孟加拉紅3.6，瓊脂2.0，海水素3.3，pH 7.0。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

真菌2號(hào)培養(yǎng)基（g/100 mL）：味精1.0，磷酸二氫鉀0.05，海水素3.3，酵母膏0.3，瓊脂2.0，麥芽糖2.0，葡萄糖1.0，甘露醇2.0。

大米培養(yǎng)基：大米80 g，海水120 mL。

1.1.4 試劑和儀器

Brucker AVANCE 400 MHz核磁共振波譜儀（美國(guó)Brucker公司）；HCB-1300V潔凈工作臺(tái) （青島海爾特種電器有限公司）；AL104分析天平（瑞士梅特勒公司）；硅膠板（青島海洋化工廠）；YXQ-LS-75SII高壓滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；CR-080R春霖超聲波清洗機(jī)（深圳市春霖清洗設(shè)備有限公司）；半制備C18柱（Nacalai tesque公司）；Varian 330檢測(cè)器（Varian公司）；LRH-500A生化培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）；MAGNA-1R550傅里葉變換紅外光譜（Thermo公司）；SCI-VS混勻儀（美國(guó)塞洛捷克）；MCO-18AC二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（PHCbi公司）；NIB-100顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司）；MS105DU十萬分之一天平（Mettler Toledo公司）；WZZ-2S/2SS自動(dòng)旋光儀（上海申光儀器儀表有限公司）；SHIMADZU SCL-10A HPLC（日本島津公司）；200～300目正相硅膠（青島海洋化工集團(tuán)公司）。

1.2 樣品預(yù)處理與菌株分離

植物樣品的預(yù)處理：將植物樣品用無菌海水沖洗干凈，用吸水紙吸干表面水分，用75%酒精進(jìn)行表面消毒，無菌海水沖洗4～5次后取其根、莖、葉、花各部位的一小部分加入適量無菌海水進(jìn)行研磨，用無菌槍頭吸取10 mL于離心管作為母液。取1 mL母液加9 mL無菌海水混合即得10倍稀釋液。

采用稀釋涂布法分離純化樣品真菌，分別取1 mL母液或稀釋液，均勻地涂布在3種分離培養(yǎng)基平板（PDA培養(yǎng)基、真菌2號(hào)培養(yǎng)基，孟加拉紅培養(yǎng)基），每個(gè)稀釋度涂布兩個(gè)平板，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)基中出現(xiàn)的單菌落進(jìn)行純化，若發(fā)現(xiàn)不純應(yīng)挑取此菌落做進(jìn)一步劃線分離，重復(fù)以上操作直至獲得純菌株。將分離純化得到的單菌落進(jìn)行保藏（斜面保藏：菌株接入斜面培養(yǎng)基，置于4 ℃冰箱；甘油管保藏：菌株接入含20%甘油的液體培養(yǎng)基，每個(gè)菌株保存4管，凍存管標(biāo)注菌種保藏號(hào)及保藏日期，于-20 ℃冰箱保藏）。

1.3 菌株的篩選

1.3.1 菌株發(fā)酵

菌株采用兩種培養(yǎng)基（真菌2號(hào)培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基）進(jìn)行靜置發(fā)酵，發(fā)酵周期為27 d。

1.3.2 菌株鑒定

植物來源的真菌MDCW-567、MDCW-415、MDCW-441的菌株鑒定包括基因組DNA提取、擴(kuò)增、純化、測(cè)序等工作由上海生工生物工程股份有限公司完成，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比真菌的ITS序列，并采用軟件MEGA（Version 7.0）完成菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制[11]。

1.3.3 浸膏提取

發(fā)酵液用兩倍體積的乙酸乙酯反復(fù)萃取3次，濃縮乙酸乙酯萃取液即得粗浸膏。

1.3.4 細(xì)胞增殖抑制活性

使用CCK-8法檢測(cè)抗腫瘤活性，其原理是CCK-8試劑含2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽（WST–8），其在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原成高水溶性黃色甲臜產(chǎn)物（formazan），甲臜產(chǎn)物數(shù)目與活細(xì)胞數(shù)目成正比。細(xì)胞增殖越多越快則顏色越深；化合物的細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。

CCK-8法抗腫瘤活性測(cè)試：采用10%胎牛血清培養(yǎng)液將細(xì)胞配成單個(gè)細(xì)胞懸液，96孔板每孔板接種100 μL 5×104/mL細(xì)胞，在5% CO2、37 ℃的條件下預(yù)培養(yǎng)24 h。用DMSO溶解樣品，基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液）稀釋樣品后，吸出孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，每孔添加100 μL用新鮮培養(yǎng)基配制樣品溶液（終濃度20 μmol/L）進(jìn)行初篩，每個(gè)樣品設(shè)定1個(gè)濃度和3個(gè)復(fù)孔，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分為空白組（blank）、對(duì)照組（control）和藥物組（drug）。吸出舊培養(yǎng)基，每孔直接加入稀釋十倍的100 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h（避光操作，實(shí)時(shí)觀察）。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下吸光度作為原始數(shù)據(jù)結(jié)果。將Excel軟件用于原始數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理，初篩通過每孔A值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率作為初篩結(jié)果，公式=（AControl-ADrug）/（AControl-ABlank）×100%，統(tǒng)計(jì)抑制率。IC50通過GraphPad Prism 8（版本8.0.2，GraphPad Software Inc）計(jì)算，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s為單位。陽(yáng)性對(duì)照樣品中：鹽酸阿霉素doxorubicin（Dox）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

采用10倍稀釋法從水龍、黃嬋、丁香蓼、蓮子草等4種植物樣品中分離獲得94株真菌（圖1）。

水龍（57株）：MDCW-333～MDCW-338，MDCW-340～MDCW-341，MDCW-343～MDCW-350，MDCW-352～MDCW-353，MDCW-355，MDCW-359，MDCW-362～MDCW-363，MDCW-366，MDCW-369，MDCW-381，MDCW-383，MDCW-385，MDCW-387，MDCW-391～MDCW-416，MDCW-419，MDCW-422～MDCW-424。

黃嬋（14株）：MDCW-339，MDCW-364，MDCW-365，MDCW-372，MDCW-373，MDCW-382，MDCW-386，MDCW-389，MDCW-390，MDCW-407，MDCW-417，MDCW-418，MDCW-420，MDCW-421。

丁香蓼（21株）：MDCW-342，MDCW-351，MDCW-354，MDCW-356，MDCW-357，MDCW-358，MDCW-360，MDCW-361，MDCW-367，MDCW-368，MDCW-370，MDCW-371，MDCW-374，MDCW-375，MDCW-376，MDCW-377，MDCW-378，MDCW-379，MDCW-380，MDCW-384，MDCW-388。

蓮子草（2株）：MDCW-441，MDCW-567。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株MDCW-567

菌株MDCW-567的ITS序列的PCR擴(kuò)增序列的長(zhǎng)度為512 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支。故將菌株MDCW-567（GenBank號(hào) OQ 627405）初步鑒定為高粱附球菌菌株（圖2）。對(duì)其形態(tài)特征作進(jìn)一步觀察，結(jié)果符合高粱附球菌菌株形態(tài)特征。故初步鑒定菌株MDCW-567為高粱附球菌菌株，并命名為Epicoccum sorghinum MDCW-567。

2.2.2 菌株MDCW-415

菌株MDCW-415的ITS序列的PCR擴(kuò)增序列的長(zhǎng)度為549 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的青霉屬（Penicillium sp.）菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支。故將菌株MDCW-415（GenBank號(hào) OQ 629792）初步鑒定為青霉屬菌株（圖3）。對(duì)其形態(tài)特征作進(jìn)一步觀察，結(jié)果符合青霉屬形態(tài)特征。故初步鑒定菌株MDCW-415為青霉菌，并命名為Penicillium sp. MDCW-415。

2.2.3 菌株MDCW-441

菌株MDCW-441的ITS序列的PCR擴(kuò)增序列的長(zhǎng)度為512 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的高粱附球菌菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支。故將菌株MDCW-441（GenBank號(hào)OQ 641371）初步鑒定為高粱附球菌菌株（圖4）。對(duì)其形態(tài)特征作進(jìn)一步觀察，結(jié)果符合高粱附球菌菌株形態(tài)特征。故初步鑒定菌株 MDCW-441為高粱附球菌菌株，并命名為Epicoccum sorghinum MDCW-441。

2.3 化合物的分離與鑒定

對(duì)Epicoccum sorghinum MDCW-567（蓮子草；孟加拉紅培養(yǎng)基；10倍稀釋菌液即樣品研磨液通過10倍稀釋后得到的菌液）大米培養(yǎng)基中的單一次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離，通過凝膠柱色譜以二氯甲烷：甲醇=1：1洗脫，TLC檢測(cè)合并，通過HPLC半制備（C18半制備柱，乙腈：酸水=40：60，流量4 mL/min）純化，得到化合物1（8 mg，tR＝9.2 min），通過MS和NMR鑒定該化合物為phomoxanthone A（圖5）。對(duì)Penicillium sp. MDCW-415（水龍；PDA培養(yǎng)基；母液即樣品研磨液）真菌2號(hào)培養(yǎng)基中的單一次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離，通過凝膠柱色譜以二氯甲烷：甲醇=1：1洗脫，TLC檢測(cè)合并，通過HPLC半制備（C18半制備柱，甲醇：水=55：45，流量4 mL/min）純化得到化合物2

（8.2 mg，tR＝7.0 min），通過MS和NMR鑒定該化合物為isomeleagrin。對(duì)Epicoccum sorghinum? MDCW-441（蓮子草；PDA培養(yǎng)基；10倍稀釋菌液即樣品研磨液通過10倍稀釋后得到的菌液）大米培養(yǎng)基中的單一次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離，通過凝膠柱色譜以二氯甲烷：甲醇=1：1洗脫，TLC檢測(cè)合并，通過HPLC半制備（C18半制備柱，甲醇：水=55：45，流量4 mL/min）純化得到化合物3（12.7 mg，tR＝8.8 min），通過MS和NMR鑒定該化合物為（-）-（6S， 1'S）-pestalotin。

化合物1：黃色粉末；ESI-MS m/z 773.2 [M+Na]+，分子式C38H38O16，[α]25D=+69.0 （c=0.60，CH2Cl2）。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：14.09（1H，s，8-OH），11.51（1H，s，1-OH），7.38（1H，d，J=8.8 Hz，H-3），6.56（1H，d，J=8.8 Hz，H-2），5.40（1H，s，H-5），4.28（1H，d，J=12.8 Hz，H-12），4.17（1H，d，J=12.8 Hz，H-12），2.44（2H，m，H-7），2.34（1H，m，H-6），2.31（2H，m，H-7），2.06（3H，s，5-OC（O）CH3），1.88（3H，s，12-OC（O）CH3），1.00（3H，d，J=5.9 Hz，H-11）；13C NMR（CDCl3，100 MHz）δ： 187.9（s，C-9），177.8（s，C-8），170.2（s，12-OC（O）CH3），169.7（s，5-OC（O）CH3），161.7（s，C-1），154.0（s，C-4a），141.3（d，C-3），115.5（s，C-4），109.6（d，C-2），106.4（s，C-9a），100.3（s，C-8a），80.5（s，C-10a），70.5（d，C-5），64.7（t，C-12），33.4（t，C-7），27.7（d，C-6），20.8（q，5-OC（O）CH3），20.6（q，12-OC（O）CH3），17.6（q， C-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，故鑒定化合物1為phomoxanthone A。

化合物2：黃色粉末；ESI-MS m/z 434.2 [M+H]+，分子式C23H23N5O4，[α]25D=-45.0 （c=0.50，MeOH）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ： 8.81（1H，s，H-18），8.25（1H，s，H-15），7.90（1H，s，H-20），7.63（1H，d，J=7.8 Hz，H-4），7.30（1H，t，J=7.7 Hz，H-6），7.10（1H，t，J=7.7 Hz，H-5），7.03（1H，d，J=7.8 Hz，H-7），6.06（1H，br s，H-22），5.49（1H，s，H-8），3.75（3H，s，1-OCH3），1.31（3H，s，H-24），1.29（3H，s，H-25）；13C NMR（CD3OD，100 MHz） δ： 166.5（s，C-13），161.1（s，C-10），147.9（s，C-7a），144.2（s，C-9），143.6（d，C-22），135.2（d，C-18），131.0（s，C-12），129.7（s，C-16），129.5（d，C-6），127.0（s，C-3a），126.0（d， C-4），124.8（d，C-5），122.1（d，C-20），113.8（t，C-23），113.0（d，C-7），111.7（d，C-8），104.2（d，C-15），103.3（s，C-2），65.7（q，1-OCH3），54.3（s，C-3），43.5（s，C-21），23.8（q，C-24），23.8（q，C-25）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故鑒定化合物2為isomeleagrin。

化合物3：白色固體；ESI-MS m/z 237.1 [M+Na]+，分子式C11H18O4，[α]25D=-32.6 （c=0.10，MeOH）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ： 5.17（1H，d，J=1.7 Hz，H-3），4.36（1H，dt，J=12.9 Hz，3.6 Hz，H-6），3.80（3H，s，4-OCH3），3.60（1H，m，H-1'），2.84（1H，ddd，J=17.2 Hz，12.9，1.7 Hz，Ha-5），2.30（1H，dd，J=17.2 Hz，3.8 Hz，Hb-5），1.62（2H，m，H-2'），1.38（2H，m，H-3'），1.29（2H，m，H-4'），0.94（3H，t，J=7.1 Hz，H-5'）；13C NMR（CD3OD，100 MHz）δ： 176.5（s，C-4），170.3（s，C-2），90.1（d，C-3），80.2（d，C-6），72.6（d，C-1'），57.0（q，4-OCH3），33.3（t，C-2'），30.2（t，C-5），29.1（t，C-3'），23.7（t，C-4'），14.4（q，C-5'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物3為（-）-（6S， 1'S）-pestalotin。

2.4 化合物的細(xì)胞增殖抑制活性

對(duì)化合物1～3進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試，檢測(cè)化合物對(duì)人胃癌細(xì)胞MKN-45在內(nèi)的17種腫瘤細(xì)胞與人慢性髓原白血病細(xì)胞K-562、人正常肝細(xì)胞L-02、人胚腎細(xì)胞293-T的影響。對(duì)初篩顯示出細(xì)胞增殖抑制活性的化合物1和化合物2進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，IC50結(jié)果見表2，鹽酸阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，化合物1對(duì)于MKN-45、HCT 116、5637、L-02細(xì)胞的增殖抑制活性較強(qiáng)，IC50值分別為2.2、3.5、5.0和2.5 μmol/L?；衔?對(duì)于5637細(xì)胞的增殖抑制活性較強(qiáng)，IC50值為5.0 μmol/L，對(duì)A673、L-02、DU145細(xì)胞的增殖抑制活性次之，IC50值分別為17.0、17.0和19.7 μmol/L。化合物3對(duì)所測(cè)的20種細(xì)胞沒有表現(xiàn)出細(xì)胞增殖抑制活性。

3 討論

真菌被認(rèn)為是天然活性產(chǎn)物的重要來源，部分植物內(nèi)生真菌已進(jìn)化出生產(chǎn)與宿主植物具有同等或類似生物活性物質(zhì)的能力[15]。北部灣位于熱帶和亞熱帶交界處，是中國(guó)生物多樣性最高的海域之一，從古到今有多種海洋植物藥用經(jīng)驗(yàn)[16]，是藥物研發(fā)的資源寶庫(kù)。

本研究通過10倍稀釋法從來源于廣西北部灣紅樹林區(qū)的4種植物水龍、黃嬋、丁香蓼、蓮子草中分離獲得了94株真菌，采用10倍稀釋法分別獲得了適應(yīng)高濃度和低濃度菌液的種類豐富的真菌[17]，其中母液分離真菌數(shù)量多于10倍稀釋液。本研究從94株植物內(nèi)生真菌中篩選了3株含有單一次級(jí)代謝產(chǎn)物的菌株，分別是分離自蓮子草的Epicoccum sorghinum MDCW-567、Epicoccum sorghinum MDCW-441和分離自水龍的Penicillium sp. MDCW-415。經(jīng)過分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定從Epicoccum sorghinum MDCW-567獲得化合物1為phomoxanthone A，從Penicillium sp.MDCW-415獲得化合物2為isomeleagrin，從Epicoccum sorghinum MDCW-441獲得化合物3為（-）-（6S， 1'S）-pestalotin?；衔?和2對(duì)5637、L-02細(xì)胞系表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，此外化合物1還對(duì)MKN-45、HCT116細(xì)胞系表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，化合物2還對(duì)DU145、A673細(xì)胞系表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，化合物3對(duì)所測(cè)20株細(xì)胞系均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。

擬莖點(diǎn)霉酮A（phomoxanthone A）可視為鄰位二取代的聯(lián)芳基衍生物，曾從印尼紅樹植物Rhizhopora mucronata的內(nèi)生真菌Phomopsis sp. IM 41-1中分離鑒定[18]，研究表明它對(duì)菌核菌、貴腐霉菌、金黃色葡萄球菌均有不同程度抗菌活性。還有研究表明其對(duì)于抗稻瘟病菌、人口腔表皮樣癌細(xì)胞（KB cells）、人淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞（BC-1 cells）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero cells）有活性[19]。本研究進(jìn)一步證明了該化合物對(duì)另外四種細(xì)胞系（5637、L-02、HCT 116、MKN-45）有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。

Isomeleagrin于2022年被首次從廣西有毒藥用植物娃兒藤的內(nèi)生青霉Penicillium commune Charles Thom（Trichocomaceae）中分離出[13]。Meleagrin是一種具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的異戊烯化吲哚生物堿[20]，通常有防污、抗癌、抗蟲、抗菌等活性[21-22]。Melegrin通過異構(gòu)化作用形成Isomelegrin，其選擇性抑制HGC 27細(xì)胞的增殖，IC50值為2.01 μmol/L[13]。本研究首次發(fā)現(xiàn)Isomeleagrin對(duì)于5637細(xì)胞系具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，對(duì)于L-02、DU145和A673具有一定的細(xì)胞毒活性。

（-）-（6S， 1'S）-pestalotin是一種吡喃酮衍生物，大多來源于內(nèi)生真菌擬盤多毛孢屬真菌中[23]，以往研究發(fā)現(xiàn)（-）-（6S， 1'S）-pestalotin可以作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，沒有抗氧化、抗真菌、免疫抑制活性[24]。本文進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)20株細(xì)胞系的抑制活性，發(fā)現(xiàn)此化合物對(duì)其增殖均無影響。

目前對(duì)于廣西北部灣來源的紅樹林區(qū)植物內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物活性研究相對(duì)較少，以前的研究多數(shù)停留在菌株分離、篩選和鑒定上，對(duì)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究尚不深入[25]。本文從采集自北部灣的四株植物中分離真菌并對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)phomoxanthone A對(duì)5637、L-02、HCT 116和MKN-45細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。同時(shí)，本文首次發(fā)現(xiàn)isomeleagrin對(duì)于5637人膀胱癌細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，豐富了吲哚生物堿類物質(zhì)作為抗癌活性成分的研究。天然產(chǎn)物是新藥設(shè)計(jì)與研發(fā)的重要源泉，通過挖掘特色天然新資源為創(chuàng)新藥物的研究提供有價(jià)值的先導(dǎo)化合物，對(duì)于促進(jìn)新藥創(chuàng)制研發(fā)有重大意義[26]。

參 考 文 獻(xiàn)

何子邦， 李順蓮， 吳友浪， 等. 廣西沿海紅樹林土壤放線菌多樣性、新穎性及抗菌活性研究[J]. 中國(guó)抗生素雜志， 2022， 47（5）： 463-473.

Elena A， Georgios D， Peter P. Lead compounds from mangrove-associated microorganisms[J]. Mar Drugs， 2018， 16（9）： 319.

Zhu Y H， Jiang X B， Hu B， et al. Advances in the study of the structures and bioactivities of metabolites isolated from mangrove-derived fungi in the South China Sea[J]. Mar Drugs， 2013， 11（10）： 3601-3616.

Hong K， Gao A H， Xie Q Y， et al. Actinomycetes for marine drug discovery isolated from mangrove soils and plants in China[J]. Mar Drugs， 2009， 7： 24-44.

Sunil K D， Manish K G， Ved P M， et al. Mangrove-associated fungi： A novel source of potential anticancer compounds[J]. J Fungi， 2018， 4（3）： 101.

Cai R L， Jiang H M， Mo Y L. Ophiobolin-type sesterterpenoids from the mangrove endophytic fungus Aspergillus sp. ZJ-68[J]. J Nat Prod， 2019， 82（8）： 2268-2278.

Wu J， Xiao Q， Xu J， et al. Natural products from true mangrove flora： source， chemistry and bioactivities[J]. Nat Prod Rep， 2008， 25（5）： 955-981.

Li M Y， Xiao Q， Pan J Y， et al. Natural products from semi-mangrove flora： source， chemistry and bioactities[J]. Nat Prod Res， 2009， 26（2）： 281-298.

王聰， 蘇艷， 高諭康， 等. 廣西北部灣來源抗菌活性真菌菌株的分離篩選及活性產(chǎn)物鑒定[J]. 國(guó)際藥學(xué)研究雜志， 2019， 46（04）： 270-276.

張艷婷， 彭帥， 黃炳耀， 等. 1株珊瑚共附生真菌Talaromyces verruculosus GXIMD 02504的次級(jí)代謝產(chǎn)物及抑菌活性研究[J]. 中國(guó)抗生素雜志， 2022， 47（10）： 1045-1050.

王聰， 王玉妃， 孫建， 等. 海洋曲霉Aspergillus ruber TX-M4-1的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究[J]. 中草藥， 2022， 53（18）： 5600-5606.

Isaka M， Jaturapat A， Rukseree K， et al. Phomoxanthones A and B， novel xanthone dimers from the endophytic fungus Phomopsis species[J]. J Nat Prod， 2001， 64（8）： 1015-1018.

Cao H Y， Zhao J Y， Yi C， et al. Undescribed meleagrin alkaloids from the endophytic fungus Penicillium commune[J]. Phytochem Lett， 2022， 204： 113441.

Nalin R G R， Savitri K N， Jayasinghe L， et al. Secondary metabolites produced by an endophytic fungus Pestalotiopsis microspora[J]. Natur Prod & Bioprosp， 2019， 9（6）： 411-417.

Zhang Y， Mu J， Feng Y， et al. Broad-spectrum antimicrobial epiphytic and endophytic fungi from marine organisms： isolation， bioassay and taxonomy[J]. Mar Drugs， 2009， 7（2）： 97-112.

高程海， 夏家朗， 梁考云， 等. 北部灣海洋植物及其共附生微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展[J]. 廣西植物， 2022， 42（8）： 1259-1272.

王聰， 杜為勝， 楊朝龍， 等. 潿洲島火山口真菌的分離及次級(jí)代謝產(chǎn)物鑒定[J]. 菌物學(xué)報(bào)， 2023， 42（2）： 553-561.

Yoshihito S， Takehiro S， Fumiaki S， et al. Isolation of a Phomoxanthone A derivative， a new metabolite of tetrahydroxanthone， from a Phomopsis sp. Isolated from the mangrove， Rhizhopora mucronata[J]. Nat Prod Commun， 2013， 8（12）： 1735-1737.

Els?sser B， Krohn K， Fl?rke U， et al. X‐ray structure determination， absolute configuration and biological activity of phomoxanthone A[J]. Eur J Org Chem， 2005， 0（21）： 4563-4570.

He F， Han Z， Peng J， et al. Antifouling indole alkaloids from two marine derived fungi[J]. Nat Prod Commun， 2013， 8（3）： 329-332.

Tibrewal N， Tang Y. Biocatalysts for natural product biosynthesis[J]. Annu Rev Chem Biomol， 2014， 5： 347-366.

Vala A K. Marine-derived fungi： Potential candidates for anticancer compounds[M]. Marine Niche： Applications in pharmaceutical sciences， 2020： 145-158.

Nalin R G R， Savitri K N， Jayasinghe L， et al. Secondary metabolites produced by an endophytic fungus Pestalotiopsis microspora[J]. J Nat Prod， 2019， 9（6）： 411-417.

Zhang W F， Ma J K， Zhang X X， et al. Immunosuppressive polyketides from the mangrove endophytic fungus Pestalotiopsis sp. HHL-14[J]. Chem Nat Compd， 2021， 57（6）： 1130-1133.

張艷， 藍(lán)桃菊， 廖仕同， 等. 廣西北部灣紅樹植物內(nèi)生真菌多樣性[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2017， 44（4）： 783-794.

陳士林， 孫奕， 萬會(huì)花， 等. 中藥與天然藥物2015～2020年研究亮點(diǎn)評(píng)述[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2020， 55（12）： 2751-2776.

收稿日期：2023-03-22

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金（No. 2021GXNSFBA075036，No. 2021GXNSFBA220040）；廣西民族大學(xué)相思湖青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No. 2021RSCXSHQN01）；廣西民族大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（No. 2020KJQD09）；廣西高等學(xué)校千名中青年骨干教師培育計(jì)劃；廣西碩士研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（No. YCSW2023255）

作者簡(jiǎn)介：王玉妃，女，生于1999年，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笏幬锘瘜W(xué)。E-mail： Wyf19991126@126.com

*通信作者，E-mail： wangcong123206@163.com