亞胺培南對(duì)攜帶blaNDM-1耐藥基因的Escherichia coli耐藥性及內(nèi)膜secY、secE和secG轉(zhuǎn)錄水平的影響

吳兆猛　趙瓊　吳玲玲　王祖華　余春芳　金志雄

摘要：目的 探討亞胺培南（IPM）對(duì)blaNDM-1陽(yáng)性Escherichia coli耐藥性及其內(nèi)膜secY、secE和secG轉(zhuǎn)錄水平的影響。方法 以重組質(zhì)粒pET28a（+）-blaNDM-1轉(zhuǎn)化菌株E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1為研究對(duì)象，在梯度濃度增加或撤消IPM暴露下傳代培養(yǎng)菌株，檢測(cè)17種抗生素對(duì)IPM暴露菌株的MIC值；SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)NDM-1表達(dá)；蛋白活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NDM-1活性；qRT-PCR檢測(cè)blaNDM-1及內(nèi)膜secY、secE和secG轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果 12 μg/mL和020 μg/mL IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1菌株CFZ、CXM、FOX、CRO、CAZ、FEP等頭孢類(lèi)藥物的MIC值（≥8 μg/mL/≥8 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥64 μg/mL/= 32 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥32 μg/mL/= 8 μg/mL）與0 μg/mL IPM暴露MIC值（≤2 μg/mL、= 16 μg/mL、≤8 μg/mL、≤1 μg/mL、≤4 μg/mL、≤2 μg/mL）相比均顯著增高，而IPM和MEM的MIC值與0 μg/mL IPM暴露（≤1 μg/mL和≤1 μg/mL）相比也顯著增高（=8 μg/mL/=8 μg/mL和=4 μg/mL/=4 μg/mL）。12 μg/mL和020 μg/mL IPM暴露的E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株FOX、CRO、FEP等頭孢類(lèi)藥物的MIC值（≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥64 μg/mL/≥64 μg/mL、= 16 μg/mL/= 16 μg/mL） 與0 μg/mL IPM暴露（≤8 μg/mL、≤1 μg/mL、≤2 μg/mL）相比也均顯著增高，而IPM和MEM的MIC值與0 μg/mL IPM暴露（≤1 μg/mL和≤1 μg/mL）相比也均顯著增高（≥16 μg/mL/≥16 μg/mL和≥16 μg/mL/≥16 μg/mL）。SDS-PAGE顯示，隨12 μg/mL IPM暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株NDM-1水解IPM活性增加。qRT-PCR顯示，12 μg/mL IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）- blaNDM-1的blaNDM-1、secY、secE和secG轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)2.31/2.5、3.05/1.96、2.83/1.24和2.71/1.45倍。結(jié)論 IPM可使blaNDM-1陽(yáng)性E. coli由碳青霉烯類(lèi)敏感變?yōu)槟退幥冶３址€(wěn)定，細(xì)菌內(nèi)膜SecYEG跨膜通道蛋白參與菌株耐藥性調(diào)控，這為認(rèn)識(shí)抗生素壓力下腸桿菌科細(xì)菌耐藥性變化及指導(dǎo)臨床合理用藥提供理論支撐。

關(guān)鍵詞：亞胺培南；暴露；Escherichia coli；NDM-1；SecYEG

中圖分類(lèi)號(hào)： R378.2+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

The effects of imipenem on resistance to blaNDM-1 positive Escherichia coli and transcription levels of secY， secE and secG in intima

Wu Zhaomeng1， Zhao Qiong1， Wu Lingling2， Wang Zuhua3， Yu Chunfang1， and Jin Zhixiong1，2

（1 Department of Basic Medical Science， Hubei University of Medicine， Shiyan 442000;

2 Department of Clinical Laboratory， Dongfeng Hospital， Hubei University of Medicine， Shiyan， 442008;

3 Department of Blood Transfusion， Taihe Hospital， Hubei University of Medicine Shiyan， 442000）

Abstract Objective To investigate the effects of imipenem （IPM） on the resistance of blaNDM-1 positive Escherichia coli and the transcription levels of secY， secE and secG in intima. Method E. coli DH5α-blaNDM-1 and E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1 transformed by recombinant plasmid pET28a（+）-blaNDM-1 were used as the research objects， and subcultured under the condition that the gradient concentration was increased or IPM exposure was canceled. The MIC values of 17 kinds of antibiotics against the IPM exposed strains were detected. The expression of NDM-1 was detected by SDS-PAGE gel electrophoresis. NDM-1 activity was detected by the protein activity test.? The transcription levels of blaNDM-1， secY， secE and secG in intima were detected by qRT-PCR. Result The MIC values of CFZ， CXM， FOX， CRO， CAZ， FEP， and other cephalosporins on E. coli DH5α-blaNDM-1 strain exposed by 12 μg/mL

and 020 μg/mL IPM（ ≥8 μg/mL/≥8 μg/mL， ≥32 μg/mL/≥32 μg/mL， ≥32 μg/mL/≥32 μg/mL， ≥64 μg/mL/= 32 μg/mL， ≥32 μg/mL/≥32 μg/mL， ≥32 μg/mL/= 8 μg/mL） were significantly increased， compared with 0 μg/mL IPM-exposed strain（≤2 μg/mL， = 16 μg/mL， ≤8 μg/mL， ≤1 μg/mL， ≤4 μg/mL， and ≤2 μg/mL） ，and the MIC values of IPM and MEM were also significantly increased （=8 μg/mL/=8 μg/mL and =4 μg/mL/=4 μg/mL）， compared with 0 μg/mL IPM-exposed strain （≤1 μg/mL and ≤1 μg/mL）. The E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1 strain induced by 12 μg/mL and 020 μg/mL IPM （ ≥32 μg/mL/≥32 μg/mL， ≥64 μg/mL/≥64 μg/mL， =16 μg/mL/=16 μg/mL） were also significantly increased， compared with 0 μg/mL IPM-exposed strain （≤8 μg/mL， ≤1 μg/mL， ≤2μg/mL）. The MIC values of IPM and MEM were also significantly increased （≥16 μg/mL/≥16 μg/mL and ≥16 μg/mL/≥16 μg/mL）， compared with 0 μg/mL IPM-exposed strain （≤1 μg/mL and ≤1 μg/mL）. Compared with 0 μg/mL IPM-exposed strain， qRT-PCR showed the expression of blaNDM-1， secY， secE， and secG in E. coli DH5α-blaNDM-1 and E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1 induced by 12 μg/mL IPM were increased by 2.31/2.5， 3.05/1.96， 2.83/1.24 and 2.71/1.45 times respectively. Conclusion IPM can make blaNDM-1 positive E. coli changed from carbapenem sensitive to drug resistant and remained stable， and SecYEG transmembrane channel protein in bacterial intima participated in the regulation of bacterial resistance， which provided theoretical support for understanding the change of Enterobacteriaceae bacterial resistance under antibiotic pressure and guiding clinical rational drug use.

Key words Imipenem; Expose; Escherichia coli; NDM-1; SecYEG

碳青霉烯類(lèi)（carbapenems）是一類(lèi)不被細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶水解的主要用于對(duì)抗耐藥性細(xì)菌感染的非典型β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，如亞胺培南（imipenem，IPM）和美羅培南（meropenem，MEM）等。然而，自20世紀(jì)80年代英國(guó)和美國(guó)發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌以來(lái)，耐藥菌株遍布美洲、歐洲、亞洲和非洲等地區(qū)，碳青霉烯類(lèi)的治療效果受到耐藥株攜帶的編碼碳青霉烯酶基因的挑戰(zhàn)[1-3]。根據(jù)Ambler分類(lèi)法[4]（β-內(nèi)酰胺酶末端的氨基端序列特征），β-內(nèi)酰胺酶分為：A（TEM、SHV、CTX-M和KPC）、B（IMP、VIM、SPM、GIM、SIM和NDM）、C（CMY、DHA和ADC）和D（OXA）4種類(lèi)型[5-11]。A、C和D類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶的活性位點(diǎn)含有絲氨酸殘基。B類(lèi)酶又稱(chēng)金屬β-內(nèi)酰胺酶（metallo-β-lactamases， MBLs），由染色體和質(zhì)粒編碼，包括IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、NDM、Bc11、Cpha、FEZ等[12]，酶分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有高變異性，氨基酸序列的同源性低于23%[13-14]。依據(jù)氨基酸序列的同源性，MBLs分3個(gè)亞群B1、B2和B3。其中，B1亞群是最大的MBLs，酶分子氨基酸同源性大于23%。MBLs的活性依賴(lài)于二價(jià)金屬離子（多為Zn2+），其活性中心的二價(jià)金屬離子結(jié)合組氨酸和半胱氨酸并與β-內(nèi)酰胺環(huán)的羰基碳的酰胺鍵相互作用，水解青霉素類(lèi)、頭孢菌素、頭霉素類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)等抗生素。

2009年，Timothy等[15]發(fā)現(xiàn)了一種新型MBLs即新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶（new delhi metallo-β-lactamase-1， NDM-1），NDM-1屬B1亞類(lèi)酶，可水解除氨曲南以外的全部β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物，包括碳青霉烯類(lèi)。編碼NDM-1的β-內(nèi)酰胺酶基因（blaNDM-1）含有一個(gè)813 bp的開(kāi)放閱讀框，GC含量為57%，有7個(gè)亞型，各亞型僅有1～2個(gè)氨基酸的差異，其水解酶活性差異不明顯。攜帶blaNDM-1質(zhì)粒類(lèi)型眾多（包括IncA/C、ColE、IncF、 IncFIA、IncFIB、 IncFII、IncHI1、IncHI3、IncL/M、IncN、IncN2、IncP、IncR、IncT、IncX1、IncX3、IncY等）（https：//cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/），blaNDM-1定位在轉(zhuǎn)座子、整合子或插入序列等移動(dòng)元件中心區(qū)，伴隨有遺傳元件ISEc33、ISSen4、IS26、IS930或ISCR1及其它耐藥酶如OXA-48、VIM、AMP、ESBL、16S rRNA甲基酶、大環(huán)內(nèi)脂酯酶和利福平修飾酶等基因，隨質(zhì)粒在不同腸桿菌的種屬細(xì)菌間傳播[16-17]。

blaNDM-1翻譯后的未折疊狀NDM-1前蛋白，依靠動(dòng)力蛋白SecA水解ATP提供的能量，穿過(guò)SecY、SecE和SecG蛋白構(gòu)成的跨膜蛋白通道（SecYEG）輸出到周質(zhì)[18] ，折疊并結(jié)合2個(gè)Zn2+成具有活性的NDM-1[19]，通過(guò)外膜囊泡運(yùn)至膜外[20]（圖1）。

目前，攜帶blaNDM-1的質(zhì)粒已經(jīng)在腸桿菌目細(xì)菌中廣泛傳播，包括肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）和解鳥(niǎo)氨酸烏拉爾菌（Raoultella ornithinolytica）等[21-23]。研究表明，抗生素壓力是細(xì)菌染色體基因發(fā)生突變或潛伏基因（存在于染色體或質(zhì)粒的低或無(wú)表達(dá)的基因）擴(kuò)散從而增強(qiáng)細(xì)菌的抗藥性和毒力的動(dòng)因[15， 24-26]。IPM暴露可促使blaNDM-1陽(yáng)性耐碳青霉烯類(lèi)菌株的耐藥性增強(qiáng)，且blaNDM-1的表達(dá)水平與IPM暴露濃度成正相關(guān)[27]。然而，IPM暴露菌株的耐藥穩(wěn)定性及其對(duì)細(xì)菌SecYEG跨膜通道蛋白的影響未見(jiàn)報(bào)道。為此，開(kāi)展了IPM對(duì)blaNDM-1陽(yáng)性E. coli耐藥性及其內(nèi)膜secY、secE和secG轉(zhuǎn)錄水平影響的研究。結(jié)果顯示，經(jīng)IPM暴露的blaNDM-1轉(zhuǎn)化菌E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1均表現(xiàn)出可穩(wěn)定傳遞的耐IPM表型和基因型特性，而且IPM與blaNDM-1、secY、secE和secG的表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)性，這為認(rèn)識(shí)抗生素壓力下的腸桿菌科細(xì)菌耐藥性變化及指導(dǎo)臨床合理用藥提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

K. pneumoniae TH-P12158（分離自湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院臨床患者痰液標(biāo)本，IPM的MIC? 1 μg/mL，碳青霉烯類(lèi)敏感）；E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）（購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司）；E. coli DH5α-blaNDM-1、E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1（攜帶blaNDM-1-pET28a（+）質(zhì)粒的菌株，由本課題組構(gòu)建并保存于湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）。

IPM（購(gòu)買(mǎi)自Merck Sharp&Dohme Corp.U.S.A）溶液配制：溶解于PBS中至需要濃度，0.22 ?m濾器除菌，分裝放于-20℃冰箱?？敲顾豙購(gòu)買(mǎi)自生工生物工程（上海）有限公司]溶液（100 mg/mL）配制：稱(chēng)取1 g卡那霉素，加入10 mL ddH2O中完全溶解，0.22 ?m濾器除菌，分裝放于-20℃冰箱。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）溶液（1 mol/L）配制：稱(chēng)取2.38 g IPTG，加入7 mL ddH2O中，溶解后加ddH2O至10 mL，0.22 ?m濾器除菌，放于-20℃冰箱。

1.2 菌株復(fù)活

分別取出-80℃冰箱保存的E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）、E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株，室溫靜置2 h。取菌液劃線(xiàn)接種至LB固體培養(yǎng)基上，37℃，過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)菌。

1.3 菌株傳代

挑選E. coli DH5α-blaNDM-1的單菌落于MH液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，培養(yǎng)12 h，然后將E. coli DH5α-blaNDM-1菌液按照1：100的比例加入到含有0 （不含IPM的對(duì)照）、0.25、0.5、1、2、4、8和12 μg/mL IPM的5 mL MH液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，按照增加的IPM濃度依次進(jìn)行菌株的傳代培養(yǎng)（8～12 h內(nèi)A600=1.5～2.0進(jìn)行下一濃度傳代）。取12 μg/mL的IPM暴露的最后一代菌株，在無(wú)IPM液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)20代，本文中用020 μg/mL表示， A600=1.5～2.0。

E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株傳代方法同上。

2 藥物敏感性

2.1 抗菌活性

分別取E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1經(jīng)0和12 μg/mL的IPM暴露的最后一代細(xì)菌及020 μg/mL條件下的第20代細(xì)菌菌液的離心沉淀物（4℃， 3000 r/min）適量，1.5×108 CFU/mL。依據(jù)VITEK-2 compact微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)操作規(guī)程，檢測(cè)17種抗生素（包括IPM和MEM）的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentation， MIC）。依據(jù)CLSI M100抗微生物藥物敏感性的標(biāo)準(zhǔn)（2022年第32版），抗菌活性結(jié)果判斷為敏感（susceptible， S）、中介（intermediate， I）和耐藥（resistant， R）。其中，亞胺培南的MIC≤1 μg/mL為敏感，1＜MIC＜4 μg/mL為中介，MIC≥4 μg/mL為耐藥。

同上述方法檢測(cè)17種抗生素抑制E. coli DH5α和E. coli BL21（DE3）生長(zhǎng)的MIC值。

2.2 NDM-1的表達(dá)、分離和純化

取0和12 μg/mL IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1、E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株進(jìn)行NDM-1的表達(dá)、分離和純化。所有培養(yǎng)基中都加入終濃度為100 ?g/mL的卡那霉素（保證無(wú)雜菌生長(zhǎng)）。

取12 ?g/mL IPM暴露的E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌液1 mL接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，培養(yǎng)12 h。取菌液10 mL接種至1000 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min，培養(yǎng)細(xì)菌至A600=0.4～0.6（約2 h），加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，16℃，200 r/min，培養(yǎng)20 h。4℃，12000 r/min離心10 min，保留菌體，加入15 mL PBS清洗2次，加入25 mL裂解緩沖液重懸菌體。冰浴。超聲30 min（200 W， 超聲3 s停5 s）。4℃，12000 r/min離心30 min，將上清轉(zhuǎn)移到離心管中，0.22 ?m濾器過(guò)濾，得細(xì)菌總蛋白。依據(jù)Ni NTA Beads 6FF說(shuō)明書(shū)進(jìn)行鎳柱親和層析純化NDM-1，用BCA測(cè)定試劑盒檢測(cè)純化后NDM-1濃度。取總蛋白和純化后的NDM-1進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

其他濃度IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1、E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株NDM-1的表達(dá)、分離和純化方法同上。

2.3 NDM-1的活性

以K. pneumoniae TH-P12158為受試菌株，檢測(cè)12 μg/mL IPM下E. coli DH5α-blaNDM-1、E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1產(chǎn)生的NDM-1水解IPM的能力。依據(jù)BCA測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明，檢測(cè)菌液NDM-1濃度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如圖2所示。

False K. pneumoniae TH-P12158菌液：1.5×108 CFU/mL。NDM-1溶液：E. coli DH5α-blaNDM-1為5.31 mg/mL，E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1為2.87 mg/mL。IPM溶液：以無(wú)菌生理鹽水為溶劑、IPM干粉為溶質(zhì)配制640、320、160、80、40、20、10、5、2.5和1.25 μg/mL系列濃度的IPM溶液。

NDM-1活性實(shí)驗(yàn)，NDM-1為30 μg，總體系為200 μL。實(shí)驗(yàn)組：分別在10個(gè)孔中加入上述配制的不同濃度的IPM 20 μL，每孔加入E. coli DH5α-blaNDM-1的NDM-1溶液約5.65 μL（E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1的NDM-1溶液約10.45 μL），最終加入K. pneumoniae TH-P12158菌液100 μL，加入MH液體培養(yǎng)基補(bǔ)足體積。對(duì)照組：每孔分別加入10個(gè)濃度的IPM 20 μL和K. pneumoniae TH-P12158菌液100 μL，加入MH液體培養(yǎng)基補(bǔ)足體積。每個(gè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。37℃條件下進(jìn)行孵育，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A600的變化，每隔4 h檢測(cè)一次，間隔4 h連續(xù)檢測(cè)6次（即4、8、12、16、20和24 h），計(jì)算IPM對(duì)K. pneumoniae TH-P12158的MIC值變化。

3 qRT-PCR

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)blaNDM-1、secY、secE和secG的CDS序列并用Oligo 7.0設(shè)計(jì)其熒光定量引物（表1），采用TIANGEN RNA prep pure培養(yǎng)細(xì)菌/細(xì)胞總RNA提取試劑盒，分別提取0和12 μg/mL IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1的總RNA。使用Toyobo反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并將其作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR （quantitative real-time PCR，qRT-PCR），檢測(cè)blaNDM-1、secY、secE和secG的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad 7.0和SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)均不少于3次，結(jié)果用x±s表示。組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5 結(jié)果

5.1 抗菌活性

抗菌活性結(jié)果如表2所示，E. coli DH5α和E. coli BL21（DE3）對(duì)臨床常用17種抗生素均敏感，而接受了重組質(zhì)粒blaNDM-1-pET28a（+）的E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株顯示出頭孢類(lèi)藥物MIC值增加，如前者的CXM （MIC=16 μg/mL， I）和后者的CFZ（MIC≥8μg/mL， R）、CXM（MIC≥32 μg/mL，R）、CAZ（MIC≥32 μg/mL， R）等。

表2顯示，與0 IPM暴露的菌株相比，12 μg/mL和020 μg/mL的IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1菌株頭孢類(lèi)藥CFZ、CXM、FOX、CRO、CAZ、FEP（第一代到第四代）的MIC值均分別增高為≥8 μg/mL/≥8 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥32 μg/mL/≥

32 μg/mL、≥64 μg/mL/=32 μg/mL、≥32 μg/mL/≥

32 μg/mL、≥32 μg/mL/ = 8 μg/mL。同時(shí)，IPM和MEM的MIC值均分別增高為8 μg/mL/4 μg/mL和

8 μg/mL/4 μg/mL。E.coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株MIC值（≥8 μg/mL/≥8 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥64 μg/mL/≥64 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、=16 μg/mL/= 16μg/mL）也均顯著增高，而IPM和MEM的MIC值也均顯著增高

（≥16 μg/mL/≥16 μg/mL和≥16 μg/mL/≥16 μg/mL）。

5.2 NDM-1的表達(dá)、分離與純化

圖3顯示，在25～48 kDa之間，E. coli DH5α-blaNDM-1或E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1蛋白圖譜的豐富度和含量均較E. coli DH5α或E. coli BL21（DE3）明顯增強(qiáng)，12 μg/mL IPM暴露菌株相比較0 IPM暴露菌株又有顯著增強(qiáng)。同時(shí)，12 μg/mL IPM暴露的E.coli DH5α-blaNDM-1或E.coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株均顯示32 kD蛋白條帶，而0 IPM暴露菌株均未表達(dá)出NDM-1條帶。

5.3 NDM-1的活性

NDM-1存在下，IPM對(duì)K. pneumoniae TH-P12158的MIC值變化如表3所示，12 ?g/mL的IPM暴露E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1分泌 NDM-1水解IPM，使后者的MIC值均由反應(yīng)4 h時(shí)的4 ?g/mL增加至24 h時(shí)的16 ?g/mL，這說(shuō)明純化得到的NDM-1的活性較好。

5.4 qRT-PCR

菌株blaNDM-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平如圖4所示，12 μg/mL IPM暴露E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株的blaNDM-1轉(zhuǎn)錄水平分別是0 IPM的2.3倍（P<0.001）和2.5倍（P<0.01）。2株E. coli在12 μg/mL IPM的暴露下，blaNDM-1mRNA轉(zhuǎn)錄水平都有顯著上調(diào)，這預(yù)示NDM-1表達(dá)量有明顯增加。

隨著IPM濃度由0增加到12 μg/mL，E. coli DH5α-blaNDM-1的secY增加了3.05倍（P<0.05）（圖5A）、secE增加了2.83倍（P<0.05）（圖5B）和secG增加了2.71倍（P<0.05）（圖5C）；E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1的secY增加了1.96倍（P<0.05）（圖5D）、secE增加了1.24倍（P< 0.05）（圖5E）和secG增加了1.45倍（P< 0.05） （圖5F）。

6 討論

K. pneumoniae和E. coli是社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌，也是常見(jiàn)的多重耐藥性細(xì)菌。K. pneumoniae和E. coli普遍攜帶多種類(lèi)型的β-內(nèi)酰胺酶基因如blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、blaKPC和blaNDM-1等，這些基因存在于染色體或質(zhì)粒上，賦予細(xì)菌耐藥特性[21，29-32]。攜帶blaNDM-1基因的質(zhì)粒通常大于100 kb，質(zhì)粒類(lèi)型包括IncA/C、IncX3或IncF等[33]。有研究認(rèn)為，宿主兼容性使blaNDM-1質(zhì)粒多見(jiàn)于K. pneumoniae，很少存在E. coli中[29]。E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1是2株自然轉(zhuǎn)接blaNDM-1-pET28a （+）質(zhì)粒的菌株，在無(wú)IPM壓力下（IPM，0），2株菌顯示出部分頭孢類(lèi)藥物MIC值增高（如CXM、CFZ和CAZ等）（表2），這提示blaNDM-1在E. coli中進(jìn)行了低水平不足于引起臨床耐藥的NDM-1表達(dá)。同時(shí)，blaNDM-1-pET28a （+）質(zhì)粒構(gòu)建菌株在普通培養(yǎng)基中顯示出快速的生長(zhǎng)狀態(tài)，這體現(xiàn)了blaNDM-1質(zhì)粒在E. coli中較強(qiáng)的宿主兼容性和水平傳播的能力。

抗生素被認(rèn)為是加速耐藥基因轉(zhuǎn)移的最重要推動(dòng)力，它們對(duì)細(xì)菌施加的選擇性壓力促使染色體基因發(fā)生突變或潛伏基因擴(kuò)散，從而增強(qiáng)細(xì)菌的抵抗力和毒力[24，26，30，34]。研究表明[27，31，35]，低于MIC值的IPM可使blaNDM-1陽(yáng)性菌的耐藥表型（MIC）和基因型（blaNDM-1）增加。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度IPM（0.25、0.5、1和2 μg/mL）暴露的菌株初始生長(zhǎng)緩慢（12～24 h），3～4次傳代后生長(zhǎng)迅速（8～12 h）；高濃度IPM（4、8和12 μg/mL）暴露的菌株初次生長(zhǎng)極為緩慢（＞48 h），需要傳代10～12次才能正常生長(zhǎng)（10～12 h）（數(shù)據(jù)未顯示）。MIC值、NDM-1和blaNDM-1轉(zhuǎn)錄水平等數(shù)據(jù)顯示（表2、圖3～4），12 μg/mL的IPM顯著提高blaNDM-1表達(dá)及NDM-1水解IPM能力。表2也顯示，撤消IPM并不影響12 μg/mL IPM暴露菌株的耐藥性。無(wú)論是12或020 μg/mL，IPM暴露菌株均產(chǎn)生了交叉耐藥性，而且這種耐藥性存在可遺傳特性。交叉耐藥性是一種對(duì)特定藥物產(chǎn)生耐藥性同時(shí)導(dǎo)致對(duì)另一種藥物產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象[32]。E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1對(duì)IPM和其它未暴露抗生素表現(xiàn)出強(qiáng)的耐藥性（表2），如12 μg/mL IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株對(duì)MEM（碳青霉烯類(lèi)）、CFZ、CXM、FOX、CRO、CAZ、FEP（第一、第二、第三、第四代）的MIC值均顯著增高。此外，撤消IPM后菌株保持二十代耐藥譜不變。綜合分析IPM暴露細(xì)菌的生長(zhǎng)、耐藥表型和基因型數(shù)據(jù)，認(rèn)為IPM暴露促使菌株適應(yīng)壓力環(huán)境、增強(qiáng)耐藥酶活性，而撤消IPM并不影響菌株持久的、不可逆的耐藥性，其可能原因是產(chǎn)生染色體基因突變和blaNDM-1高表達(dá)菌株。有研究者認(rèn)為[36]，存在于E. coli內(nèi)的NDM-1前蛋白可以通過(guò)SecYEG跨膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)，其blaNDM-1也可以通過(guò)此方式進(jìn)行運(yùn)輸，blaNDM-1和NDM-1都被外膜囊泡包裹后轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)菌外膜上，這不能排除囊泡內(nèi)的blaNDM-1促使基因水平傳播的可能。

無(wú)論blaNDM-1協(xié)同其它耐藥基因或blaNDM-1單一基因，細(xì)菌內(nèi)膜SecYEG跨膜通道是NDM-1前蛋白易位至周質(zhì)的關(guān)鍵孔道?，F(xiàn)有研究無(wú)法確定IPM是否特異性促使blaNDM-1表達(dá)或者只是一種抗生素壓力因子，但I(xiàn)PM對(duì)SecYEG跨膜通道產(chǎn)生了一定的影響。本研究顯示，相比較0、12 μg/mL IPM暴露E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）- blaNDM-1的secY、secE和secG轉(zhuǎn)錄水平分別增加了3.05/1.96、2.83 /1.24和2.71/1.45倍（P<0.05）（圖5）。推測(cè)IPM可能促使菌株mRNA轉(zhuǎn)錄改變提高SecY、SecE和SecG蛋白量或功能促使更多的NDM-1前蛋白快速到達(dá)周質(zhì)結(jié)合Zn2+，增強(qiáng)NDM-1酶的水解能力，但是，這需要進(jìn)一步深入探究。

面對(duì)blaNDM-1在全世界的廣泛傳播性及其對(duì)抗生素的多重耐藥性的現(xiàn)狀，控制blaNDM-1的傳遞、NDM-1表達(dá)及其活性將十分關(guān)鍵。我們的研究顯示IPM暴露下的blaNDM-1、NDM-1和SecYEG跨膜通道等三者之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，這為選擇抗菌藥物靶點(diǎn)提供了新思路。

參 考 文 獻(xiàn)

楊修文， 崔俊昌， 趙進(jìn)， 等. 碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌血流感染的臨床特征與死亡危險(xiǎn)因素分析[J].中國(guó)感染與化療雜志， 2018， 18（2）： 142-149.

Iovleva A， Doi Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae[J]. Clin Lab Med， 2017， 37（2）： 303-315.

Mills M C， Lee J. The threat of carbapenem-resistant bacteria in the environment： Evidence of widespread contamination of reservoirs at a global scale[J]. Environ Pollut， 2019， 255（1）： 113-143.

Ambler R P. The structure of beta-lactamases[J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci， 1980， 289（1036）： 321-331.

Tooke C L， Hinchliffe P， Bragginton E C， et al. Beta-lactamases and beta-lactamase inhibitors in the 21st century[J]. J Mol Biol， 2019， 431（18）： 3472-3500.

Yigit H， Queenan A M， Anderson G J， et al. Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase， KPC-1， from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2001， 45（4）： 1151-1161.

Majiduddin F K， Palzkill T. Amino acid sequence requirements at residues 69 and 238 for the SME-1 beta-lactamase to confer resistance to beta-lactam antibiotics[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2003， 47（3）： 1062-1067.

Smith C A， Nossoni Z， Toth M， et al. Role of the conserved disulfide bridge in class A carbapenemases[J]. J Biol Chem， 2016， 291（42）： 22196-22206.

Fonseca F， Chudyk E I， Van Der Kamp M W， et al. The basis for carbapenem hydrolysis by class A beta-lactamases： A combined investigation using crystallography and simulations[J]. J Am Chem Soc， 2012， 134（44）： 18275-18285.

Rasussen B A， Bush K， Keeney D， et al. Characterization of IMI-1 beta-lactamase， a class A carbapenem-hydrolyzing enzyme from Enterobacter cloacae[J]. Antimicrob Agents Chemother， 1996， 40（9）： 2080-2086.

Rodriguez-Martinez J M， Poirel L， Nordmann P. Extended-spectrum cephalosporinases in Pseudomonas aeruginosa[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2009， 53（5）： 1766-1771.

Mendes R E， Bell J M， Turnidge J D， et al. Carbapenem-resistant isolates of Klebsiella pneumoniae in China and detection of a conjugative plasmid （blaKPC-2 plus qnrB4） and a blaIMP-4 gene[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2008， 52（2）： 798-799.

Rasmussen B A， Bush K. Carbapenem-hydrolyzing beta-lactamases[J]. Antimicrob Agents Chemother， 1997， 41（2）： 223-232.

Walsh T R， Toleman M A， Poirel L， et al. Metallo-beta-lactamases： The quiet before the storm[J]？? Clin Microbiol Rev， 2005， 18（2）： 306-325.

李子堯， 魯炳懷. 耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制及其分子檢測(cè)[J]. 中國(guó)臨床新醫(yī)學(xué)， 2021， 14（3）： 256-261.

Xu Y， Gu B， Huang M， et al. Epidemiology of carbapenem resistant Enterobacteriaceae （CRE） during 2000—2012 in Asia[J]. J Thorac Dis， 2015， 7（3）： 376-385.

Petrosillo N， Giannella M， Lewis R， et al. Treatment of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae： The state of the art[J]. Expert Rev Anti Infect Ther， 2013， 11（2）： 159-177.

Corey R A， Allen W J， Komar J， et al. Unlocking the bacterial secY translocon[J]. Structure， 2016， 24（4）： 518-527.

Moran-Barrio J， Limansky A S， Viale A M. Secretion of GOB metallo-beta-lactamase in Escherichia coli depends strictly on the cooperation between the cytoplasmic DnaK chaperone system and the Sec machinery： Completion of folding and Zn（II） ion acquisition occur in the bacterial periplasm[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2009， 53（7）： 2908-2917.

Li L， Park E， Ling J， et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel[J]. Nature， 2016， 531（7594）： 395-399.

Yong D， Toleman M A， Giske C G， et al. Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene， bla（NDM-1）， and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2009， 53（12）： 5046-5054.

Yu C， Wei X， Wang Z， et al. Occurrence of two NDM-1-producing Raoultella ornithinolytica and Enterobacter cloacae in a single patient in China： Probable a novel antimicrobial resistance plasmid transfer in vivo by conjugation[J]. J Glob Antimicrob Resist， 2020， 22： 835-841.

Du N， Liu S， Niu M， et al. Transmission and characterization of blaNDM-1 in Enterobacter cloacae at a teaching hospital in Yunnan， China[J]. Ann Clin Microbiol Antimicrob， 2017， 16（1）： 58.

Charpentier X， Polard P， Claverys J P. Induction of competence for genetic transformation by antibiotics： Convergent evolution of stress responses in distant bacterial species lacking SOS[J]？ Curr Opin Microbiol， 2012， 15（5）： 570-576.

Nordmann P， Poirel L， Walsh T R， et al. The emerging NDM carbapenemases[J]. Trends Microbiol， 2011， 19（12）： 588-595.

Neu H C. The crisis in antibiotic resistance[J]. Science， 1992， 257（5073）： 1064-1073.

馮偉， 歐陽(yáng)凈， 程林， 等. 細(xì)菌NDM-1質(zhì)粒耐藥表型與其表達(dá)的相關(guān)性研究[J].中國(guó)抗生素雜志， 2020， 45（05）： 477-481.

吳玲玲. 耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌耐藥基因分析及木犀草苷抗blaNDM-1多耐藥菌的機(jī)制研究[D]. 湖北： 湖北醫(yī)藥學(xué)院， 2021.

Gottig S， Riedel-Christ S， Saleh A， et al. Impact of blaNDM-1 on fitness and pathogenicity of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae[J]. Int J Antimicrob Agents， 2016， 47（6）： 430-435.

Brink A J. Epidemiology of carbapenem-resistant Gram-negative infections globally[J]. Curr Opin Infect Dis， 2019， 32（6）： 609-616.

Revitt-Mills S A， Robinson A. Antibiotic-induced mutagenesis： Under the microscope[J]. Front Microbiol， 2020， 11： 585175.

Suzuki S， Horinouchi T， Furusawa C. Prediction of antibiotic resistance by gene expression profiles[J]. Nat Commun， 2014， 5： 5792.

An J， Guo L， Zhou L， et al. NDM-producing Enterobacteriaceae in a Chinese hospital， 2014—2015： Identification of NDM-producing Citrobacter werkmanii and acquisition of blaNDM-1-carrying plasmid in vivo in a clinical Escherichia coli isolate[J]. J Med Microbiol， 2016， 65（11）： 1253-1259.

Prudhomme M， Attaiech L， Sanchez G， et al. Antibiotic stress induces genetic transformability in the human pathogen Streptococcus pneumoniae[J]. Science， 2006， 313（5783）： 89-92.

Poirel L， Dortet L， Bernabeu S， et al. Genetic features of blaNDM-1-positive Enterobacteriaceae[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2011， 55（11）： 5403-5407.

Gonzalez L J， Bahr G， Nakashige T G， et al. Membrane anchoring stabilizes and favors secretion of New Delhi metallo-beta-lactamase[J]. Nat Chem Biol， 2016， 12（7）： 516-522.

收稿日期：2022-11-14

基金項(xiàng)目：湖北省衛(wèi)生健康委項(xiàng)目（No. WJ2021F049）；“十四五”湖北省高等學(xué)校優(yōu)勢(shì)特色學(xué)科群（生物與醫(yī)藥）項(xiàng)目資助

（No. 2022BMXKQY1）

作者簡(jiǎn)介：吳兆猛，男，生于1998年，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)榧?xì)菌耐藥機(jī)制與院內(nèi)感染控制，E-mail： wuzhaomeng2833@163.com

*通信作者，E-mail： Jzx8801150@126.com