浙東白鵝種鵝多殺性巴氏桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

賈惠言，周 瀟，戴久麗，王 力，陳淑芳

（寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）是引起鵝巴氏桿菌病的主要病原體，該菌在自然界和畜禽體內(nèi)都有存在，其抵抗力較弱，在日光曝曬下能夠死亡，在無(wú)菌的生理鹽水以及蒸餾水中也會(huì)快速死亡，主要通過(guò)接觸性傳染的方式侵害雞、鴨、鵝等禽類[1-4]。鵝巴氏桿菌病一年四季均可發(fā)生，病鵝常常發(fā)生劇烈的腹瀉癥狀，所以又稱霍亂，通常主要侵害成年禽類，以性成熟后的禽類最為易感。如果沒(méi)有及時(shí)采取有效防治，病死率可高達(dá)70%～95%，該病一旦暴發(fā)，易導(dǎo)致鵝群大批死亡、生產(chǎn)性能低下，給養(yǎng)鵝業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，是危害現(xiàn)代養(yǎng)鵝業(yè)的疾病之一[5-7]。

鵝可通過(guò)外源性感染和自體感染發(fā)病[8]。外源性感染主要是由采食污染的飲水或者飼料引起，或者由消化道和呼吸道感染，也可以通過(guò)吸血昆蟲(chóng)和損傷的皮膚、黏膜等多種途徑感染[8,9]。一般來(lái)說(shuō)，健康鵝往往是通過(guò)外源性感染引起發(fā)病。另外，大部分動(dòng)物體內(nèi)都存在巴氏桿菌，是一種常見(jiàn)的條件性致病菌，主要在扁桃體和上呼吸道內(nèi)分布，由于具有較弱的毒力，當(dāng)機(jī)體健康狀況良好時(shí)不會(huì)出現(xiàn)發(fā)病，但在抵抗力下降時(shí)，該菌開(kāi)始大量繁殖，且毒力明顯增強(qiáng)，并侵入血液或者淋巴，從而導(dǎo)致自體感染[4]。病例主要表現(xiàn)為突然發(fā)病，出現(xiàn)敗血癥病狀，下痢，死亡率高，剖解特征：全身黏膜、漿膜小點(diǎn)出血，出血性腸炎及肝臟壞死[10]。目前關(guān)于巴氏桿菌病的報(bào)道主要集中在牛、羊、兔等畜類和雞鴨等家禽，而鵝的報(bào)道主要集中在其他種類的肉鵝，尚無(wú)關(guān)于浙東白鵝種鵝的報(bào)道。

2023 年3 月浙江省某浙東白鵝種鵝場(chǎng)的種鵝突然發(fā)病，死亡2 只。病鵝體溫明顯升高，臨床表現(xiàn)為精神萎靡，頸部彎曲，雙眼無(wú)神，羽毛雜亂，雙翅無(wú)力；食欲較差，不采食，但會(huì)喝水；鼻竇腫大，口鼻中均流黏液，張口呼吸；排白色或綠色稀便，糞便有腥臭，偶爾發(fā)現(xiàn)糞便混有血液，發(fā)病后期會(huì)有持續(xù)性出血性下??；體型偏瘦，伴有跛行和關(guān)節(jié)腫脹。剖檢主要病理變化為病死鵝的皮下與腹膜充血嚴(yán)重，并伴有小點(diǎn)狀出血；心包和胸膜粘連，心包膜有出血點(diǎn)，心包積液明顯，并滲出黃色液體，滲出液中帶有纖維蛋白塊；肝臟呈棕色，略腫大，肝臟表面發(fā)現(xiàn)出血點(diǎn)和壞死灶；肌胃出血明顯，大腸和小腸黏膜充血；脾臟柔軟，伴有腫大；肺臟明顯充血，伴有出血，呈暗紅色。因此，本試驗(yàn)對(duì)浙東白鵝種鵝樣本進(jìn)行致病菌的分離與鑒定，并通過(guò)藥敏試驗(yàn)對(duì)該病的用藥治療提供參考，以期為種鵝巴氏桿菌病的綜合防治提供參考。

1 試驗(yàn)器材與方法

1.1 試驗(yàn)材料

浙江省某浙東白鵝種鵝場(chǎng)患病種鵝1 只、死亡種鵝2 只。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

血瓊脂培養(yǎng)基（購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司）、麥康凱培養(yǎng)基（購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司）、SS 瓊脂培養(yǎng)基（購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司）、革蘭氏染色液、DNA marker DL2000（購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）、2×TransTaq-T PCR Supermix（購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）、瓊脂糖（購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）、E-Test 藥敏試紙條（購(gòu)自法國(guó)梅里埃）。

圖1 分離菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)

1.3 試驗(yàn)儀器

手術(shù)剪和手術(shù)刀等解剖器械、接種環(huán)和培養(yǎng)皿等細(xì)菌培養(yǎng)耗材、注射器、BCE3202-1CCN 電子分析天平（北京賽多利斯制造）、IBAO 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（施都凱儀器設(shè)備有限公司）、SQ810C 型自動(dòng)高壓滅菌鍋（雅馬拓科技貿(mào)易有限公司制造）、生化培養(yǎng)箱（施都凱儀器設(shè)備有限公司）、燒瓶、5810 型臺(tái)式高速離心機(jī)（eppendorf）、SW-CJ-IF 型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰技術(shù)公司制造）、NE910 正置顯微鏡（寧波永新光學(xué)有限公司）、S1000 型梯度PCR 儀（BIO-RAD生命醫(yī)學(xué)有限公司）、SubcellGT 核酸電泳儀（BIO-RAD 生命醫(yī)學(xué)有限公司）、ChemDocMP 凝膠成像儀（BIO-RAD 生命醫(yī)學(xué)有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 取樣

病死鵝用消毒水表面消毒后，將鵝腹部朝上置于手術(shù)臺(tái)，首先稍微清理一下腹部羽毛，而后提起下腹部表皮用手術(shù)剪剪開(kāi)一個(gè)小口，沿剪開(kāi)的小口撕開(kāi)腹部表皮。觀察并記錄皮下與肌肉的出血情況；剪開(kāi)胸腹腔，觀察并記錄臟器病變情況；向上剪開(kāi)頸部表皮，觀察并記錄頸部的皮下出血情況、食管與氣管的出血情況；向下剪開(kāi)消化道，觀察并記錄肌胃、腺胃、腸道組織的病變情況和內(nèi)容物滲出情況。對(duì)病死鵝或患病鵝的內(nèi)臟組織和眶下竇進(jìn)行無(wú)菌采樣。

2.2 細(xì)菌分離與鑒定

2.2.1 培養(yǎng)基的制備

血瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和SS 瓊脂培養(yǎng)基按照說(shuō)明書(shū)用超純水進(jìn)行配制。配好的培養(yǎng)基121℃滅菌30min，晾涼后倒入平板，4℃冰箱內(nèi)倒置保存。

2.2.2 分離培養(yǎng)與生化鑒定

在無(wú)菌條件下，將肝、脾、眶下竇等病料分別接種于血瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和SS 瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。觀察菌落生長(zhǎng)狀況與形態(tài)。無(wú)菌挑選分離純化后的單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落，對(duì)被檢病料作觸片或涂片，片子在環(huán)境中自然干燥后用酒精燈火焰進(jìn)行固定，固定后進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察菌落的顏色和形態(tài)。根據(jù)微量生化發(fā)酵管說(shuō)明書(shū)分別接種葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、蕈糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、肌醇、甘露醇、硫化氫、尿素酶、賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸等生化管[11]。

2.2.3 單菌落鑒定

對(duì)菌株進(jìn)行16SrDNA 的擴(kuò)增測(cè)序及序列分析。以分離到的純菌落作為模板，進(jìn)行菌落PCR。該P(yáng)CR 的反應(yīng)體系為50μL：模板2μL、dNTP4μL、上游引物與下游引物各0.5μL、Taq酶0.5μL、10XBuffer5μL 以及ddH2O37.5μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性5min（95℃），變性1min（95℃），退火1min（55℃），延伸2min（72℃），35 個(gè)循環(huán)；終延伸8min（72℃）。在PCR 產(chǎn)物中取5μL，在1%瓊脂糖凝膠中電泳；剩余的PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)分析。

2.3 藥敏試驗(yàn)

2.3.1 配制菌液

以下操作均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，無(wú)菌條件下用無(wú)菌的接種環(huán)挑取多殺性巴氏桿菌純菌落2個(gè)，2 個(gè)菌落加入滅菌PBS 后，用漩渦混勻器充分混合，制成多殺性巴氏桿菌菌懸液。

2.3.2 藥敏試紙條的放置

用無(wú)菌棉簽沾取菌懸液，涂布于血瓊脂平板，用無(wú)菌鑷將E-test 試紙條放置其上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，記錄各E-test 試紙條讀數(shù)。參照抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

3 試驗(yàn)結(jié)果分析

3.1 病原菌分離培養(yǎng)、菌落形態(tài)特征及生化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)病死鵝肝、脾及眶下竇進(jìn)行無(wú)菌采樣，分別接種于血瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和SS 瓊脂培養(yǎng)基，37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。在血瓊脂上形成灰白色露珠樣小菌落（圖1a），在TSA 培養(yǎng)基上形成透明的露珠樣小菌落（圖1b），在麥康凱培養(yǎng)基（圖1c）和SS 培養(yǎng)基（圖1d）上不生長(zhǎng)。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株可發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、蕈糖和山梨醇；不發(fā)酵乳糖、菊糖、麥芽糖、衛(wèi)矛醇、肌醇和甘露醇；硫化氫、尿素酶、賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸反應(yīng)陰性。

3.2 革蘭氏染色結(jié)果

從AST 平板挑單菌落進(jìn)行涂片，片子固定后進(jìn)行革蘭氏染色，如圖2 所示，顯微鏡觀察結(jié)果顯示革蘭氏染色為陰性，鏡下可見(jiàn)橢圓形短小桿菌，該菌兩極染色深、兩端為鈍圓。

圖2 分離菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（1000x）

3.3 分離菌株16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取分離菌DNA，PCR 擴(kuò)增其16S rDNA 基因，引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得1500bp 條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖3）。

表1 細(xì)菌16S rDNA 基因通用引物

圖3 分離菌株16S rDNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3.4 分離菌株16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增片段測(cè)序及序列分析

將分離到的純菌落送至浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行菌落測(cè)序，返回測(cè)序結(jié)果后，在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中與已有的多殺性巴氏桿菌序列進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)。如表2 所示，分離菌株與多殺性巴氏桿菌同源性高達(dá)99.93%，判定該分離株為多殺性巴氏桿菌。

表2 細(xì)菌16S rDNA 基因通用引物

3.5 藥敏試驗(yàn)

選取慶大霉素、美羅培南、氨芐西林、阿莫西林、紅霉素、復(fù)方新諾明、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、粘菌素這9 種抗生素，根據(jù)說(shuō)明書(shū)用E-test法對(duì)分離菌株進(jìn)行最小抑菌濃度檢測(cè)。參照抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）進(jìn)行結(jié)果判定[12]，如表3 所示，慶大霉素的最小抑菌濃度為1μg/mL，2023 版CLSI 中對(duì)慶大霉素敏感的最小抑菌濃度折點(diǎn)為小于等于2μg/mL，該菌對(duì)慶大霉素敏感；美羅培南的最小抑菌濃度小于0.008μg/mL，CLSI 中對(duì)美羅培南敏感的最小抑菌濃度折點(diǎn)為小于等于1μg/mL，該菌對(duì)美羅培南敏感；氨芐西林的最小抑菌濃度為0.064μg/mL，CLSI 中對(duì)氨芐西林敏感的最小抑菌濃度折點(diǎn)為小于等于8μg/mL，該菌對(duì)氨芐西林敏感；阿莫西林的最小抑菌濃度為0.064μg/mL，CLSI 中對(duì)阿莫西林敏感的最小抑菌濃度折點(diǎn)為小于等于8μg/mL，該菌對(duì)阿莫西林敏感；紅霉素的最小抑菌濃度為8μg/mL，CLSI 中對(duì)紅霉素敏感的最小抑菌濃度折點(diǎn)為小于等于0.5μg/mL，對(duì)紅霉素耐藥的最小抑菌濃度折點(diǎn)為大于等于8μg/mL，中介范圍為1～4μg/mL，因此該菌對(duì)紅霉素耐藥；復(fù)方新諾明的最小抑菌濃度小于0.064μg/mL，CLSI中對(duì)復(fù)方新諾明敏感的最小抑菌濃度折點(diǎn)為小于等于2/38μg/mL，該菌對(duì)復(fù)方新諾明敏感；頭孢曲松的最小抑菌濃度為0.064μg/mL，CLSI 中對(duì)頭孢曲松敏感的最小抑菌濃度折點(diǎn)為小于等于1μg/mL，該菌對(duì)頭孢曲松敏感；環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度小于0.032μg/mL，CLSI 中對(duì)環(huán)丙沙星敏感的最小抑菌濃度折點(diǎn)為小于等于0.25μg/mL，該菌對(duì)環(huán)丙沙星敏感；粘菌素的最小抑菌濃度小于0.5μg/mL，CLSI 中對(duì)粘菌素敏感的最小抑菌濃度折點(diǎn)為小于等于1μg/mL，該菌對(duì)粘菌素敏感。

表3 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

巴氏桿菌病的發(fā)生流行與氣候變化、飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)狀況、興奮、損傷以及潛伏性疾病等有關(guān)[4]。暴發(fā)季節(jié)主要在夏季、秋季和冬季，該病在發(fā)病禽舍舍飼時(shí)很難完全清除，可以在同一場(chǎng)地連續(xù)發(fā)生。雖然目前已有多殺性巴氏桿菌疫苗，對(duì)降低禽霍亂造成的損失有一些保護(hù)作用，但多殺性巴氏桿菌存在血清型多、交叉免疫力差和保護(hù)期短等問(wèn)題，導(dǎo)致疫苗的免疫效果不理想，使該病在鴨群中仍時(shí)有發(fā)生[13,14]。近年來(lái)隨著鵝產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，鵝巴氏桿菌病的診治和藥敏報(bào)道不斷增加[15,16]。

2023 年3 月在浙江省象山縣種鵝場(chǎng)獲得患鼻竇炎的種鵝病料，為確證感染鼻竇炎的細(xì)菌種類，本研究從發(fā)病浙東白鵝的種鵝無(wú)菌采集肝、脾及眶下竇，分離并純化到1 株細(xì)菌，通過(guò)在4種培養(yǎng)基上觀察培養(yǎng)特性、革蘭氏染色性質(zhì)、顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定試驗(yàn)等方法，發(fā)現(xiàn)該菌株與多殺性巴氏桿菌的特性基本一致，初步認(rèn)為純化到的菌株為多殺性巴氏桿菌。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)菌的分離鑒定早已有很多報(bào)道使用PCR 方法作為鑒定的輔助方法，可以從序列上更加準(zhǔn)確地確定病原[3]。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道利用多殺性巴氏桿菌中的標(biāo)志基因建立鑒定多殺性巴氏桿菌的PCR 方法[17]。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，用16S rDNA PCR 的方法來(lái)確證，用巴氏桿菌的序列設(shè)計(jì)引物后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到一個(gè)1500bp 的條帶，與預(yù)想的一致。將該單菌落進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中多殺性巴氏桿菌已有的序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，同源性達(dá)99.93%，從DNA 序列的層面證實(shí)了分離到的菌株為多殺性巴氏桿菌。

大量監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，畜牧業(yè)中抗菌藥物仍存在使用不當(dāng)?shù)那闆r，這種不當(dāng)?shù)氖褂梅浅Ｈ菀资辜?xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性后，容易形成找藥困難或無(wú)藥可醫(yī)的局面，從而造成該細(xì)菌快速傳播，對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，不可濫用抗生素，需根據(jù)藥敏的結(jié)果，選擇敏感藥物按常規(guī)劑量和療程對(duì)畜禽進(jìn)行治療。本研究對(duì)分離到的菌株進(jìn)行了藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果表明，分離菌株對(duì)慶大霉素、美羅培南、氨芐西林、阿莫西林、紅霉素、復(fù)方新諾明、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、粘菌素8 種抗生素均敏感，對(duì)紅霉素耐藥。

針對(duì)本次在浙東白鵝種鵝場(chǎng)發(fā)現(xiàn)巴氏桿菌引起的生病與病死情況，除去采樣的試驗(yàn)病死鵝（試驗(yàn)病死鵝采樣后也進(jìn)行無(wú)害化處理），病死鵝立即采取無(wú)害化處理，病鵝采取隔離飼養(yǎng)，同時(shí)對(duì)運(yùn)動(dòng)場(chǎng)地、飼養(yǎng)圈舍、飼養(yǎng)用具以及被污染的場(chǎng)地進(jìn)行全面消毒滅源，每天2 次，疫情得到控制后每周進(jìn)行1 次消毒[18]；病鵝及時(shí)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果將藥物與水混合均勻后任其飲水；健康鵝群每只翅下注射2mL 禽霍亂組織滅活苗，應(yīng)注重健康鵝的生活環(huán)境，盡量保證鵝舍的通風(fēng)，保持鵝舍的干燥，糞便應(yīng)及時(shí)處理，定期抽血檢查，爭(zhēng)取發(fā)現(xiàn)早、治療早，避免造成巨大損失。

畜禽產(chǎn)業(yè)疫病重在防控，多殺性巴氏桿菌易感染成年鵝，種鵝要做好防范措施，后備種鵝應(yīng)在70 日齡接種鵝巴氏桿菌滅活苗，經(jīng)產(chǎn)種鵝應(yīng)在每年7 月份開(kāi)產(chǎn)前接種鵝巴氏桿菌滅活苗。需要注意疫苗的保存溫度和保質(zhì)期，并且在開(kāi)封后盡快使用。

5 結(jié)論

此次在浙江省某浙東白鵝種鵝場(chǎng)患病鵝與病死鵝體內(nèi)分離到單一致病菌，該菌在形態(tài)學(xué)和生化反應(yīng)等方面均符合多殺性巴氏桿菌的特征，菌落PCR 的結(jié)果顯示該致病菌16S rDNA 序列與多殺性巴氏桿菌的DNA 序列同源性高達(dá)99.93%，進(jìn)一步確證了本次分離到的致病菌為多殺性巴氏桿菌。此次分離到的致病菌對(duì)慶大霉素、美羅培南、氨芐西林、阿莫西林、復(fù)方新諾明、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、粘菌素等8 種敏感，可為單獨(dú)用藥或聯(lián)合用藥治療提供參考，但該菌對(duì)紅霉素耐藥，應(yīng)避免使用。