搭載吉西他濱的SiO2@Fe3O4納米材料抑制裸鼠胰腺癌移植瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

全棋，管時(shí)偉，林泉，彭明暉，俞海波

溫州醫(yī)科大學(xué)定理臨床學(xué)院/溫州市中心醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325000

胰腺癌是目前世界上高度惡性腫瘤之一，盡管近年來(lái)胰腺癌患者的5 年生存率有所上升，但仍低于10%[1-2]。在免疫治療對(duì)胰腺癌療效并不顯著的現(xiàn)今，化療仍是胰腺癌臨床治療的重要手段[3-4]。吉西他濱（gemcitabine，GEM）在卵巢癌、膀胱癌和非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中取得了不錯(cuò)的效果。但在胰腺癌中，GEM的臨床療效面臨兩個(gè)巨大的問(wèn)題：GEM的毒副作用和GEM耐藥性。GEM的化療耐藥涉及多個(gè)方面，如藥物代謝途徑的改變、腫瘤微生物的影響和腫瘤微環(huán)境改變等[5-6]。如何改善GEM對(duì)胰腺癌的治療效果是一個(gè)值得深入研究的問(wèn)題。其中一種有效改善GEM耐藥的策略是采用納米材料包載GEM，提高其遞送效率和選擇性[7]。而基于SiO2包被的Fe3O4復(fù)合納米顆粒在彌補(bǔ)Fe3O4較不穩(wěn)定的缺點(diǎn)同時(shí)具有較好的水溶性，可作為一種具有應(yīng)用潛力的材料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

氨水（濃度為28%）、三氯化鐵（FeCl3）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、甲醇、乙二醇、乙酸銨、冰乙酸、鹽酸GEM、硅酸四乙酯（TEOS）購(gòu)自阿拉丁公司。1640 培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青霉素-鏈霉素購(gòu)自Gibco公司。二甲苯、酒精、中性樹(shù)膠購(gòu)自國(guó)藥公司。蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購(gòu)自Solarbio公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自碧云天公司。PANC02小鼠胰腺癌細(xì)胞和PaEC小鼠胰腺上皮細(xì)胞購(gòu)自普諾賽公司，Balb/c裸鼠購(gòu)自斯貝福公司。實(shí)驗(yàn)的實(shí)施得到溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批號(hào)：xmsq2023-1361）。

1.2 SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒制備和表征

SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒的制備分為兩步（圖1）。（1）將1.5 g FeCl3、1 g PVP和2 g乙酸鈉加入乙二醇中，攪拌至完全溶解并加熱，洗滌烘干后得Fe3O4微球。（2）稱取0.2 g Fe3O4分散于無(wú)水乙醇∶水（5∶1）溶液中，隨后滴加TEOS與氨水的溶液，洗滌烘干后得SiO2@Fe3O4微球。透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）照片由美國(guó)FEI Talos F200S型高分辨透射電子顯微鏡測(cè)得；采用布魯克Tensor Ⅱ型傅立葉紅外光譜儀測(cè)試樣品的特征吸收峰及表面基團(tuán)的變化，掃描范圍為4 000～400 cm-1進(jìn)行分析。

圖1 SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒制備流程示意圖

1.3 搭載GEM的SiO2@Fe3O4納米復(fù)合材料的制備及載藥性能研究

取SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒分散于無(wú)水乙醇中，加入GEM，避光磁力攪拌。得到產(chǎn)物裝于透析袋中透析24 h。精密稱定GEM對(duì)照品，配制成1.0 mg/mL貯備液，用超純水稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。將GEM-SiO2@Fe3O4溶液置于透析袋中透析24 h。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液過(guò)濾后注入HPLC系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得GEM標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。取透析介質(zhì)過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得游離GEM含量，計(jì)算包封率、載藥率。

1.4 藥物體外釋放實(shí)驗(yàn)

稱定GEM對(duì)照品適量，配制成1.0 mg/mL貯備液，用超純水稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱定1.0 mg GEM-SiO2@Fe3O4和0.1 mg GEM干燥粉末，分別溶于1 mL PBS緩沖液中。以恒定速率振蕩，分別在1、2、4、6、8、12、18、24、36、48 h時(shí)取出1 mL緩沖溶液，并補(bǔ)加相對(duì)應(yīng)體積的緩沖溶液。取10 μL緩沖溶液通過(guò)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后注入HPLC系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得緩沖溶液的峰面積，結(jié)合GEM標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的藥物釋放量，繪制體外藥物釋放曲線。體外藥物釋放曲線計(jì)算公式如下：

式中Q，累積釋藥百分率；Ct，各時(shí)間點(diǎn)緩沖溶液中的藥物濃度（μg/mL）；V0，緩沖溶液總體積（mL）；V，取出的緩沖溶液的體積（mL）；W，透析袋中的藥物含量（mg）。

1.5 SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒適量，分別用PBS（pH=7.4）緩沖液和RPMI-1640 培養(yǎng)基稀釋至0.1 mg/mL，使用Malvern Zetasizer納米粒度儀在1、2、3、4、5、6和7 d的時(shí)間內(nèi)測(cè)量粒徑，取3個(gè)讀數(shù)的平均值作為結(jié)果。

1.6 細(xì)胞活性檢查

采用CCK-8 法。將PANC02 小鼠胰腺癌細(xì)胞和PaEC小鼠胰腺上皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及傳代并制備細(xì)胞懸液。在計(jì)數(shù)板每孔加入100 μL 5 000個(gè)細(xì)胞。過(guò)夜貼壁后，分別給予不同濃度的SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒溶液，并設(shè)定僅加細(xì)胞不加任何刺激的空白對(duì)照組和僅加培養(yǎng)液的溶劑對(duì)照組，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，分別避光培養(yǎng)48 和72 h。培養(yǎng)結(jié)束，棄去原培養(yǎng)液，加入100 μL含10% CCK8試劑的無(wú)血清培養(yǎng)液。1 h后在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值。

1.7 胰腺癌移植瘤裸鼠制備及體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

PANC02 細(xì)胞用胰酶消化后洗去胰酶并制備細(xì)胞懸液。選擇Balb/c雄性裸鼠皮下接種PANC02細(xì)胞。將24 只裸鼠隨機(jī)分為4 組，前三組分別經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水（空白對(duì)照組/NS組）、5 mg/kg的GEM（GEM組）和以5 mg/kg GEM計(jì)的GEM-SiO2@Fe3O4（GEM-SiO2@Fe3O4組）。最后一組注射以5 mg/kg GEM計(jì)GEM-SiO2@Fe3O4后麻醉并在體外接近靶區(qū)腫瘤部位施加磁場(chǎng)2 h（GEM-SiO2@Fe3O4-M組）。每次間隔3 d給藥一次并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算相對(duì)腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)將動(dòng)物處死，測(cè)量并計(jì)算腫瘤體積。將腫瘤制作組織切片，進(jìn)行病理分析。游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)（a）和最短（b）部位。腫瘤體積（V）按以下公式計(jì)算：

1.8 藥物組織分布實(shí)驗(yàn)

PANC02 細(xì)胞接種于裸鼠皮下。將36 只裸鼠按照體質(zhì)量均分為3 組：尾靜脈注射5 mg/kg GEM（GEM組），以5 mg/kg GEM計(jì)的GEM-SiO2@Fe3O4（GEM-SiO2@Fe3O4組）和以5 mg/kg GEM計(jì)的GEMSiO2@Fe3O4，麻醉后在體外接近靶區(qū)部位施加磁場(chǎng)（GEM-SiO2@Fe3O4-M組）。于給藥或外加磁場(chǎng)處理后0.5、1、2、4 h各取3只裸鼠解剖并取心、肝、脾、肺、腎及腫瘤組織，稱定質(zhì)量。

將GEM貯備液稀釋制備得到的對(duì)照品溶液用于計(jì)算校準(zhǔn)曲線。吸取裸鼠各組織勻漿200 μL，加入GEM標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，制成一系列濃度組織勻漿樣品。離心后，將有機(jī)相蒸發(fā)干燥，殘?jiān)芙夂蠡旌想x心。取10 μL上清過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。各組織加入3倍量生理鹽水，用勻漿器制備組織勻漿液，用相同的方法得到上清液。利用校準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中GEM的濃度。

1.9 腫瘤組織切片制作

用生理鹽水沖洗組織后，干燥后放入10%甲醛固定。觀察形態(tài)學(xué)變化后，石蠟包埋，連續(xù)切片?？酒蠼?jīng)過(guò)脫蠟-蒸餾水沖洗-蘇木素和2%伊紅染色-梯度酒精脫水-二甲苯透明-中性樹(shù)膠封片等過(guò)程，得到組織切片。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒的FT-IR和TEM分析結(jié)果

采用傅里葉變換紅外光譜法（FT-IR）對(duì)Fe3O4、SiO2和Fe3O4@SiO2納米顆粒進(jìn)行了鑒定，得到的FTIR如圖2A所示。FT-IR結(jié)果顯示Fe3O4中570 cm-1處有鐵氧鍵的伸縮振動(dòng)峰[8]。SiO2中807 cm-1處是Si-OSi的伸縮振動(dòng)峰，1 047cm-1處是Si-OH的不對(duì)稱振動(dòng)峰，SiO2@Fe3O4復(fù)合納顆米粒中既有鐵氧鍵特征峰又有Si-O-Si和Si-OH特征峰，這說(shuō)明SiO2成功包覆在Fe3O4納米顆粒上[9]。

圖2 Fe3O4、SiO2及SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒的FT-IR（A）和Fe3O4納米顆粒及SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒TEM結(jié)果（B）

從TEM中可見(jiàn)制得的Fe3O4顆粒為球形，粒徑大小均勻（200 nm）。此外，TEM示SiO2@Fe3O4粒徑220～260 nm，中間部分顏色較深，證明Fe3O4被包覆在里面，外層相對(duì)明亮的部分具有介孔SiO2結(jié)構(gòu)，說(shuō)明Fe3O4與SiO2復(fù)合顆粒制備成功（圖2B）。

2.2 SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒對(duì)GEM的載藥性能

載藥率是指單位質(zhì)量或單位體積微球/納米顆粒所負(fù)載的藥量，其中能釋放的藥量為有效載藥量。除藥物與基質(zhì)發(fā)生不可逆結(jié)合外，載藥量可看成是微球/納米顆粒的含藥量。包封率是指被包裹物質(zhì)在納米顆粒懸液中占藥物總量的百分量。它是納米顆粒質(zhì)量控制的一個(gè)重要的指標(biāo)，反映了藥物被載體包封的程度。因此我們計(jì)算了SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒對(duì)GEM的載藥量和包封率。我們利用HPLC法，測(cè)定不同濃度的GEM標(biāo)曲溶液，記錄峰面積，建立的回歸方程為：

結(jié)合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出（圖3），GEM的包封率為84.8%，載藥率為7.8%。

圖3 GEM標(biāo)準(zhǔn)溶液在HPLC系統(tǒng)中測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.3 GEM-SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒的藥物體外釋放情況

與游離GEM相比，GEM-SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒12 h內(nèi)的GEM釋放率達(dá)到30%，24 h左右達(dá)到50%左右，隨后維持在60%左右，而游離GEM在12 h內(nèi)釋放率即達(dá)約75%（圖4）。

圖4 GEM-SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒和GEM的藥物體外釋放曲線

2.4 SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆的穩(wěn)定性及生物相容性

SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，隨著時(shí)間的變化，該納米材料的徑粒在PBS 或RPMI-1640 培養(yǎng)基中均無(wú)明顯變化，說(shuō)明制備的納米顆粒具有一定的穩(wěn)定性（圖5A）。為了進(jìn)一步評(píng)估空載體SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒對(duì)PANC02胰腺癌細(xì)胞和PaEC小鼠胰腺上皮細(xì)胞的增殖影響，我們使用CCK8 檢測(cè)了細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞的活性均高于80%（圖5B）。這表明細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和數(shù)量未受到SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒本身材料的影響。這表明制備的納米復(fù)合顆粒無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，生物相容性良好。

圖5 SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒的穩(wěn)定性及生物相容性

2.5 GEM-SiO2@Fe3O4聯(lián)合磁場(chǎng)治療對(duì)裸鼠胰腺癌移植瘤的作用及安全性

從裸鼠胰腺癌移植瘤組織大體標(biāo)本上看，GEM組和GEM-SiO2@Fe3O4組的裸鼠胰腺癌移植瘤體積均小于NS組，但與GEM組相比，GEM-SiO2@Fe3O4組的胰腺癌腫瘤體積更?。▓D6A）。此外，比較裸鼠胰腺癌組織質(zhì)量和體積時(shí)，GEM組和GEM-SiO2@Fe3O4組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，圖6B、6C）。外加磁場(chǎng)作用下的GEM-SiO2@Fe3O4與GEM組相比，顯示GEM-SiO2@Fe3O4組的胰腺癌腫瘤組織的質(zhì)量和體積更少（均P＜0.05）。這表明，SiO2@Fe3O4能將GEM富集在附加磁場(chǎng)附近釋放，并產(chǎn)生顯著療效。各組心、肝、脾、肺和腎HE染色沒(méi)有顯示明顯的器官損傷跡象，表明該材料具有良好的生物相容性。與NS組相比，GEM組和GEM-SiO2@Fe3O4組腫瘤組織出現(xiàn)局部壞死，而GEM-SiO2@Fe3O4-M組的腫瘤組織壞死更廣泛（圖7）。

圖6 不同實(shí)驗(yàn)條件下的裸鼠胰腺癌移植瘤的大小、生長(zhǎng)曲線及質(zhì)量

圖7 不同實(shí)驗(yàn)條件下裸鼠心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織病理圖片（HE，×200）

2.6 GEM、GEM-SiO2@Fe3O4 和GEM-SiO2@Fe3O4-M的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布

GEM-SiO2@Fe3O4的從0時(shí)到最終可定量時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0-t）、從0到無(wú)窮大時(shí)間的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0-∞）升高（均P＜0.01），平均駐留時(shí)間（MRT0-∞）、末端消除半衰期（t1/2β）延長(zhǎng)（均P＜0.05），清除率（CL）顯著降低（P＜0.001），表明該材料可延長(zhǎng)GEM的半衰期并延長(zhǎng)其在體內(nèi)的作用時(shí)間。表觀分布容積（Vd）顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明藥物在全身分布且有可能在某臟器濃集（表1）。游離GEM在裸鼠肝、腎組織內(nèi)分布較多，GEM-SiO2@Fe3O4除在肝腎中分布外，在腫瘤組織中的分布有增加，且消除較慢（圖8）。在外加磁場(chǎng)的作用下，GEM在腫瘤組織中富集更明顯。

表1 GEM組、GEM-SiO2@Fe3O4組和GEM-SiO2@Fe3O4-M組的藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

圖8 GEM組、GEM-SiO2@Fe3O4組和GEM-SiO2@Fe3O4-M組中的GEM在不同時(shí)間下心、肝、脾、肺、腎和腫瘤中的分布濃度

3 討論

在本研究中，我們通過(guò)TEM和FT-IR對(duì)SiO2@Fe3O4的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果顯示SiO2成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)Fe3O4顆粒的包被。既往研究已表明裸露的Fe3O4顆粒結(jié)構(gòu)在有氧環(huán)境中極不穩(wěn)定，而SiO2具有低毒性、高親水性等特點(diǎn)[10-11]。基于SiO2包被的Fe3O4納米顆粒具有較好的水溶性，并且部分彌補(bǔ)了Fe3O4較不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，為改善GEM的化療耐藥提供了實(shí)踐基礎(chǔ)[12]。

此前研究表明，SiO2@Fe3O4可與藥物聯(lián)合治療腫瘤。Shahabadi等[9]的研究表明，F(xiàn)e3O4@SiO2復(fù)合納米顆?？勺鳛橐环N有效載體，提高阿糖胞苷的生物利用度，增強(qiáng)其對(duì)早幼粒細(xì)胞白血病的療效。此外，GEM-SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒的維持時(shí)間較游離GEM長(zhǎng)。這表明我們?cè)O(shè)計(jì)的GEM-SiO2@Fe3O4可以持久地釋放。這可以減少突釋效應(yīng)的同時(shí)起到藥物緩釋的作用。為了降低GEM的毒性，提高其治療效果，其中一種方法是通過(guò)納米載體包載GEM，提高其遞送效率和選擇性[7]。本研究初步證明SiO2@Fe3O4納米顆粒在體外具有一定的穩(wěn)定性及組織相容性。并且相較于游離GEM，有附加磁場(chǎng)下的GEMSiO2@Fe3O4有更好的抗腫瘤效果，并且不會(huì)損傷正常組織。但附加磁場(chǎng)下的GEM-SiO2@Fe3O4抗腫瘤效果與游離GEM相比未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。部分原因可能是由于納米顆粒粒度小，使得納米顆粒易穿出血管而滯留于腫瘤組織，因此藥物相對(duì)富集，但被動(dòng)靶向的作用有限。此外，藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，SiO2@Fe3O4可延長(zhǎng)GEM在體內(nèi)的作用時(shí)間，并增加GEM在腫瘤組織中的濃度。但關(guān)于SiO2@Fe3O4納米材料在體內(nèi)的副反應(yīng)和毒性仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，搭載GEM的SiO2@Fe3O4在裸鼠內(nèi)的毒副反應(yīng)也需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。本研究中，我們依據(jù)SiO2@Fe3O4復(fù)合納米顆粒設(shè)計(jì)了一種全新的GEM藥物遞送材料，初步證實(shí)其在胰腺癌移植瘤裸鼠中發(fā)揮GEM的治療效果的同時(shí)，也展示了良好的生物安全性。本研究結(jié)果為后續(xù)胰腺癌的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為將來(lái)胰腺癌治療的策略提供借鑒。