膜蛋白靶向降解技術(shù)研究進(jìn)展

趙俗，張衡，李焱，王貞超③?

①貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；②深圳灣實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518000；③貴州大學(xué) 綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，貴陽(yáng) 550025

蛋白質(zhì)是由氨基酸經(jīng)過(guò)復(fù)雜的折疊和翻譯后修飾形成的具有特定三維空間結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)鏈多聚物。它們除了作為組成人體細(xì)胞和組織的主要成分，還參與到包括催化代謝反應(yīng)、DNA復(fù)制、響應(yīng)刺激、提供支撐骨架在內(nèi)的多種類(lèi)型細(xì)胞活動(dòng)中，因此其結(jié)構(gòu)、功能和數(shù)量的異常成為很多疾病產(chǎn)生的直接或重要原因。按照位置不同蛋白質(zhì)分為胞內(nèi)蛋白、膜蛋白和胞外蛋白，其中膜蛋白占全部編碼基因的30%左右，在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。膜蛋白功能的異常與多種疾病直接相關(guān)，例如受體酪氨酸激酶EGFR(epithelial growth factor receptor) 和HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) 在正常細(xì)胞表面高表達(dá)會(huì)造成細(xì)胞增殖和分化異常，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[2]。近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的免疫檢查點(diǎn)PD-L1/PD-1 (programmed cell death-ligand 1/programmed cell death protein 1) 分別在腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞表面高表達(dá)，二者的結(jié)合及相互作用抑制了T細(xì)胞的響應(yīng)和激活，從而造成腫瘤的免疫逃逸[3]。而鈉離子通道蛋白NaV1.7的三個(gè)氨基酸突變則造成慢性疼痛，因此，開(kāi)發(fā)阻斷其功能的藥物成為眾多制藥公司的目標(biāo)[4]。

目前靶向膜蛋白的藥物主要通過(guò)兩種途徑發(fā)揮作用：第一，作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制分子結(jié)合目的蛋白后阻斷其與天然底物的結(jié)合，如激酶抑制劑結(jié)合在目的蛋白的活性口袋或大分子抗體結(jié)合在胞外區(qū)占據(jù)其活性結(jié)合位點(diǎn)[5-6]；第二，作為別構(gòu)調(diào)節(jié)劑結(jié)合目的蛋白后改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，如ABL001 (Asciminib) 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酪氨酸激酶(tyrosine kinase) ABL的肉豆蔻?？诖?(Myristoyl pocket)，能夠有效克服ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑產(chǎn)生的激酶活性區(qū)域的各種突變[7]。生物學(xué)的發(fā)展為合理藥物設(shè)計(jì)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，由此開(kāi)發(fā)的藥物也極大地改善了臨床治療效果。然而，靶向膜蛋白的小分子抑制劑普遍存在特異性差、脫靶嚴(yán)重、易產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題，大分子抗體則由于只能結(jié)合在特定胞外區(qū)，無(wú)法徹底抑制膜蛋白的功能，往往難以發(fā)揮效應(yīng)[8]。

近年來(lái)新興的PROTAC (proteolysis targeting chimeras) 技術(shù)，通過(guò)“靶蛋白/蛋白酶體-雙親和”的小分子，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在蛋白酶體中的降解[9]。PROTAC分子無(wú)需通過(guò)結(jié)合在蛋白的特定活性位點(diǎn)來(lái)阻斷其功能，而是直接消除蛋白質(zhì)主體，使蛋白質(zhì)徹底喪失原有的功能。這種降解策略開(kāi)辟了小分子藥物研發(fā)的全新途徑，幾乎所有的重要蛋白都可以成為藥物靶點(diǎn)，而且傳統(tǒng)意義上無(wú)法成藥的靶點(diǎn)也有望產(chǎn)生新的治療藥物分子。美國(guó)Arvinas公司是PROTAC藥物研發(fā)的先驅(qū)，早期開(kāi)發(fā)的靶向雄激素受體 (androgen receptor, AR) 的ARV-110和靶向雌激素受體 (estrogen receptor, ER)的ARV-471已進(jìn)入臨床試驗(yàn)[10]。現(xiàn)有PROTAC技術(shù)開(kāi)發(fā)的藥物分子主要靶向胞內(nèi)蛋白的降解，對(duì)于膜蛋白這類(lèi)重要的藥物靶點(diǎn)只能通過(guò)靶向其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域來(lái)完成，而對(duì)于缺乏胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的膜蛋白的降解則面臨著巨大的困難。

2020年以來(lái)陸續(xù)報(bào)道了LYTAC (lysosometargeting chimaeras)[11]、AbTAC (antibody-based PROTACs)[12]、GlueTAC (covalent nanobodybased PROTAC)[13]和KineTAC (cytokine receptortargeting chimeras)[14]等蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)，它們可以通過(guò)特異性結(jié)合受體蛋白胞外區(qū)或自身內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)膜蛋白的降解。內(nèi)化途徑包括溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的主動(dòng)運(yùn)輸、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞和穿膜肽介導(dǎo)的內(nèi)吞等，復(fù)合物最終大多在溶酶體中降解。相對(duì)于PROTAC技術(shù)，上述技術(shù)均采用抗體可變區(qū)作為靶向結(jié)構(gòu)域，而單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展為其提供了豐富的選擇，大大拓展了蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)的應(yīng)用范圍。本文將集中介紹這些代表性的蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)在膜蛋白降解中的機(jī)制與應(yīng)用。

1 PROTAC技術(shù)

自2001年Crews教授及其合作者首次提出蛋白質(zhì)靶向降解的概念并報(bào)道第一個(gè)具有蛋白質(zhì)靶向降解功能的PROTAC分子以來(lái)，PROTAC作為蛋白質(zhì)降解領(lǐng)域的代表已經(jīng)對(duì)藥物研發(fā)領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響[15]。PROTAC通常是利用可募集胞內(nèi)E3連接酶的配體引起胞內(nèi)蛋白質(zhì)的泛素化降解，如圖1所示。但其在膜蛋白降解方面的研究較少，技術(shù)上尚未取得重大突破，其中最大的阻礙之一在于E3連接酶。人基因組編碼了超過(guò)600種E3連接酶，但不同的E3連接酶在人體不同組織中的表達(dá)水平有所差異。為了降低PROTAC的脫靶效應(yīng)，只有在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)且在正常組織中低表達(dá)的E3連接酶才能用于抗腫瘤PROTAC的設(shè)計(jì)，而目前所發(fā)現(xiàn)的符合條件的E3連接酶卻少之又少[15]。

圖1 基于E3連接酶的膜蛋白降解技術(shù)的作用機(jī)制：PROTAC利用雙功能小分子同時(shí)結(jié)合膜蛋白與胞內(nèi)E3連接酶(CRBN或VHL)形成多元復(fù)合物，拉近二者之間的距離，對(duì)膜蛋白進(jìn)行泛素化標(biāo)記，將其運(yùn)送至蛋白酶體中降解；AbTAC利用雙特異性抗體同時(shí)結(jié)合膜蛋白與跨膜E3連接酶(RNF43或ZNRF3)形成多元復(fù)合物，內(nèi)化至溶酶體中降解，或?qū)δさ鞍走M(jìn)行泛素化標(biāo)記后運(yùn)送至蛋白酶體中降解

PROTAC最常用的兩種胞質(zhì)E3泛素連接酶是CRBN (Cereblon) 與VHL (Von Hippel-Lindau)。2018年，金堅(jiān)團(tuán)隊(duì)利用泊馬度胺(Pomalidomide)為靶向CRBN的配體，并以色瑞替尼(Ceritinib)作為靶向間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK) 的配體，兩個(gè)配體用不同長(zhǎng)度的連接子(linker)連接，成功構(gòu)建了一種靶向降解ALK的PROTAC分子——MS4077和MS4078。細(xì)胞層面的降解實(shí)驗(yàn)表明，MS4077和MS4078均能顯著降解細(xì)胞中的ALK融合蛋白，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴(lài)的特點(diǎn)。它們?cè)谛∈篌w內(nèi)表現(xiàn)出相似的活性與優(yōu)異的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)[16]。招募跨膜E3泛素連接酶的MS4077和MS4078兩個(gè)分子的構(gòu)建，無(wú)疑為PROTAC技術(shù)在膜蛋白降解中的應(yīng)用帶來(lái)了新的希望。2020年，姜標(biāo)團(tuán)隊(duì)同樣以泊馬度胺作為靶向CRBN的配體，以卡奈替尼 (Canertinib) 作為靶向EGFR的配體，開(kāi)發(fā)了能夠靶向降解吉非替尼耐藥的突變型EGFRL858R/T790M的兩種PROTAC分子。研究表明在EGFR-TKI (epithelial growth factor receptortyrosine kinase inhibitor) 耐藥肺癌細(xì)胞系中，二者均能選擇性地降解非小細(xì)胞肺癌 (H1975) 細(xì)胞突變型EGFRL858R+T790M和人肺癌細(xì)胞 (PC9) 中的外顯子19缺失型EGFREx19del，表現(xiàn)出強(qiáng)效抗腫瘤活性[17]。除了基于CRBN的PROTAC之外，基于VHL的PROTAC也取得了一定的進(jìn)展。2021年，Crews團(tuán)隊(duì)以維莫非尼 (Vemurafenib)為靶向絲氨酸/蘇氨酸激酶BRAF蛋白的配體設(shè)計(jì)了基于VHL的PROTAC分子，在多種細(xì)胞系中均能有效地誘導(dǎo)BRAF-V600E及其他多種突變體的降解，而不會(huì)誘導(dǎo)野生型的BRAF蛋白降解，但目前還未能解釋為什么該降解子既能選擇性降解BRAF-V600E，也能夠降解BRAF蛋白的其他突變型[18]。

目前PROTAC在靶向膜蛋白降解方面的研究依然是圍繞CRBN與VHL兩個(gè)重要的E3連接酶，二者在理化性質(zhì)上(如親脂性)的差異將決定其不同的應(yīng)用范圍。盡管目前處于臨床試驗(yàn)中的基于CRBN的PROTAC降解劑數(shù)量明顯多于基于VHL，但有越來(lái)越多的研究數(shù)據(jù)表明基于VHL的PROTAC的未來(lái)是光明的，并將會(huì)有更多的臨床研究數(shù)據(jù)來(lái)證明這一點(diǎn)[19]。

2 LYTAC技術(shù)

2020年，Bertozzi團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了溶酶體靶向嵌合體LYTAC技術(shù)用于降解膜蛋白和胞外蛋白，該技術(shù)通過(guò)陽(yáng)離子非依賴(lài)性甘露糖-6-磷酸受體(cation-independent mannose-6-phosphate receptor, CI-M6PR) 將靶蛋白運(yùn)送到溶酶體中降解[11]。CI-M6PR在體內(nèi)的主要功能是將特定糖基化的蛋白質(zhì)裝入內(nèi)體，并傳遞至溶酶體中降解。糖蛋白通過(guò)表面的糖與CI-M6PR結(jié)合，進(jìn)而內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞中。在晚期內(nèi)體中，較低的pH值使得糖蛋白與受體解離進(jìn)入溶酶體，而受體則被循環(huán)回細(xì)胞膜或高爾基體[20]。

研究者巧妙地利用了CI-M6PR的這一特點(diǎn)，將合成的不可水解的6-磷酸甘露糖(M6Pn)糖肽通過(guò)點(diǎn)擊(Click)反應(yīng)修飾到靶向抗體上，使得抗體結(jié)合抗原后形成的復(fù)合物可以結(jié)合CI-M6PR并進(jìn)入溶酶體中降解，如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LYTAC能夠在CI-M6PR高表達(dá)的細(xì)胞中高效地降解加速神經(jīng)退行性病變的靶點(diǎn)載脂蛋白E (APOliprotein E, ApoE)、免疫檢查點(diǎn)(PD-L1)和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)[11]。遺憾的是，CIM6PR組織分布較為廣泛，導(dǎo)致LYTAC在機(jī)體內(nèi)容易被非靶細(xì)胞攝取，生物利用度較低。為了解決這一問(wèn)題，研究者進(jìn)一步選擇了只在肝細(xì)胞中表達(dá)的唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor, ASGPR)作為輸運(yùn)蛋白。基于ASGPR的配體N-乙酰半乳糖胺制備得到的GalNAc-LYTAC，同樣能夠高效地內(nèi)化至肝癌細(xì)胞HepG2中，并降解其表面的抗原蛋白EGFR[21]。盡管上述兩種LYTAC技術(shù)僅在體外細(xì)胞水平上獲得了驗(yàn)證，但其重要意義在于開(kāi)辟了胞外及膜蛋白靶向降解的新途徑。在此研究基礎(chǔ)之上，Spiegel團(tuán)隊(duì)[22]進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了雙功能小分子MoDE-As (molecular degraders of extracellular proteins through the asialoglycoprotein receptor)來(lái)介導(dǎo)胞外靶蛋白與ASGPR的三元復(fù)合物的形成，MoDE-As由ASGPR結(jié)合序列、PEG(polyethylene glycol)間隔片段、靶蛋白結(jié)合序列組成。研究人員利用二硝基苯基團(tuán)構(gòu)建靶向a-DNP抗體的小分子D-MoDE-A，該分子通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入胞內(nèi)后被迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，并被其中的蛋白酶降解。更重要的是，在向含有a-DNP抗體的小鼠體內(nèi)每日注射D-MoDE-A后，在21天范圍內(nèi)血漿a-DNP的水平顯著下降，同時(shí)小鼠的正常生理狀態(tài)并未受到顯著影響，證明了D-MoDE-A在小鼠體內(nèi)通過(guò)ASGPR介導(dǎo)的溶酶體途徑靶向降解胞外蛋白的能力。這一研究成果首次驗(yàn)證了LYTAC技術(shù)在體內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)靶向降解的可行性[22]，使得LYTAC技術(shù)向真正的藥物開(kāi)發(fā)邁出了關(guān)鍵的一步。

圖2 基于細(xì)胞膜表面溶酶體結(jié)合受體的膜蛋白降解技術(shù)的作用機(jī)制：LYTAC利用糖基化修飾后的抗體結(jié)合膜蛋白后被M6PR(或ASGPR)識(shí)別，形成三元復(fù)合物內(nèi)化至細(xì)胞中，在溶酶體中降解膜蛋白；KineTAC利用細(xì)胞趨化因子CXCL12的N端結(jié)合區(qū)域與靶向膜蛋白的抗體結(jié)合構(gòu)成的雙特異性抗體結(jié)合膜蛋白后，被CXCR7識(shí)別內(nèi)化至細(xì)胞中，在溶酶體中降解膜蛋白

LYTAC技術(shù)的成功開(kāi)發(fā)不僅讓蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)不再局限于胞內(nèi)蛋白，而且降解子的形式也不再局限于類(lèi)似PROTAC的小分子，極大地拓展了蛋白質(zhì)降解技術(shù)的應(yīng)用范疇。然而，LYTAC技術(shù)依然有不足之處：其一， M6PR在正常組織細(xì)胞中也有表達(dá)，降解子的生物利用度會(huì)因“on-target, off-tumor”效應(yīng)而降低；其二，制備LYTAC分子需要十幾步以上的化學(xué)反應(yīng)來(lái)合成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖肽或多糖分子，放大生產(chǎn)存在困難。如何將其高效地連接到抗體上以得到組分均一的LYTAC分子，同樣是亟須解決的問(wèn)題。

3 AbTAC技術(shù)

基于雙特異性抗體的蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)AbTAC代表了另一個(gè)重要的研究方向。PROTAC分子通過(guò)將細(xì)胞內(nèi)的E3連接酶募集到目的蛋白附近促進(jìn)其在蛋白酶體中的降解，其靶向基團(tuán)多為小分子或多肽。AbTAC則是通過(guò)“knobs in hole”抗體恒定區(qū)構(gòu)建而成的異源雙特異性抗體，其一端的可變區(qū)結(jié)合跨膜E3連接酶(RNF43/ZNRF3)的胞外區(qū)，另一端結(jié)合膜蛋白的胞外區(qū)[23]。降解子在細(xì)胞外同二者形成三元復(fù)合物，并進(jìn)一步內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞中通過(guò)蛋白酶體或溶酶體降解，如圖1所示。利用噬菌體展示和篩選技術(shù)，研究人員成功得到了靶向PD-L1和RNF43的AbTAC分子，其在較低濃度時(shí)就可以降低多種細(xì)胞表面的PD-L1含量。進(jìn)一步的研究表明，AbTAC分子降解靶蛋白的效率受到抗體親和力、結(jié)合表位和E3連接酶表達(dá)水平等在內(nèi)的多種因素影響。但是，AbTAC誘導(dǎo)靶蛋白降解的作用機(jī)理尚未得到完全解析。細(xì)胞層面的實(shí)驗(yàn)表明，加入溶酶體抑制劑巴佛洛霉素(Bafilomycin)可顯著降低AbTAC的降解活性，而加入蛋白酶體抑制劑MG132則對(duì)其降解活性無(wú)明顯作用，表明AbTAC引起的蛋白質(zhì)降解主要在溶酶體而不是在蛋白酶體中發(fā)生[12]。但作為E3連接酶的RNF43是否在復(fù)合物內(nèi)化前通過(guò)增加靶蛋白的泛素化水平來(lái)促進(jìn)其降解，還是僅僅通過(guò)類(lèi)似于CI-M6PR的穿梭行為來(lái)內(nèi)化和降解蛋白質(zhì)仍未闡明，目前認(rèn)為二者均可能作為AbTAC的降解途徑。此外，細(xì)胞內(nèi)源的CIM6PR和ASGPR在溶酶體和細(xì)胞膜上都有分布，CI-M6PR在將靶蛋白運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中后，理論上其自身可以回到細(xì)胞表面，循環(huán)參與降解過(guò)程，而作為E3連接酶的RNF43和ZNRF3是否可以在靶蛋白被降解后得到循環(huán)利用尚不清楚。

相對(duì)于最早的LYTAC技術(shù)，AbTAC分子采用抗體靶向跨膜E3連接酶，促進(jìn)膜蛋白的內(nèi)化和降解，為蛋白質(zhì)降解子的開(kāi)發(fā)提供了新的思路。一方面，內(nèi)化受體蛋白的選擇并不局限于特定的糖受體，包括E3連接酶在內(nèi)的其他具有內(nèi)化活性的受體蛋白也可以作為候選；另一方面，靶向結(jié)構(gòu)域不局限于受體蛋白天然的配體或衍生物，人工篩選出的抗體分子或類(lèi)似物只要具備合適的結(jié)合表位，也可以很好地促進(jìn)膜蛋白內(nèi)化和降解。AbTAC分子可以通過(guò)更換靶向抗體適用于不同的靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)模塊化，其在大規(guī)模生產(chǎn)上也更為容易，有望在腫瘤免疫治療中得到進(jìn)一步應(yīng)用。

4 KineTAC技術(shù)

上述蛋白質(zhì)降解技術(shù)均為膜蛋白及胞外蛋白的降解提供了新的思路與方案，但這些技術(shù)仍然缺乏模塊化及開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)易性。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性細(xì)胞趨化因子CXCL12能與趨化因子循環(huán)受體CXCR7結(jié)合，后者被G蛋白或β抑制蛋白招募后持續(xù)內(nèi)化[24]。2022年，James A.Wells團(tuán)隊(duì)首次借助內(nèi)源性細(xì)胞因子CXCL12開(kāi)發(fā)了基于細(xì)胞因子受體靶向嵌合體(KineTAC)的新型靶向降解平臺(tái)[14]，如圖2所示。KineTAC結(jié)合了AbTAC與LYTAC的優(yōu)勢(shì)，以CXCR7作為靶向溶酶體的細(xì)胞表面受體，將細(xì)胞趨化因子CXCL12的N端結(jié)合區(qū)域與靶向膜蛋白的抗體結(jié)合構(gòu)成能夠完全基因編碼的雙特異性抗體，不需要復(fù)雜的化學(xué)合成或生物偶聯(lián)來(lái)生產(chǎn)，具有模塊化的優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KineTAC具有高選擇性，很大程度上降低了脫靶效應(yīng)，并以濃度與時(shí)間依賴(lài)的方式由CXCR7介導(dǎo)膜蛋白至溶酶體中降解。研究人員將CXCL12的N端結(jié)合區(qū)域分別與靶向結(jié)合8種疾病治療相關(guān)膜蛋白(包括HER2、EGFR和PD-L1等)及胞外可溶性蛋白 (包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF和腫瘤壞死因子TNF-α) 的抗體結(jié)合起來(lái)，所構(gòu)建的對(duì)應(yīng)的雙特異性抗體均表現(xiàn)出了對(duì)目的蛋白的有效降解，且對(duì)目的蛋白之外的其他相關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)量并未產(chǎn)生影響，為KineTAC的安全性提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。

此外，科研人員深入研究后發(fā)現(xiàn)，抗體結(jié)合親和力、結(jié)合表位等因素會(huì)不同程度地影響KineTAC的降解效率，這為基于抗體的蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)未來(lái)的設(shè)計(jì)、優(yōu)化提供了可行的方向[14]。除CXCL12的N端結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，用趨化因子CXCL11、白細(xì)胞介素IL2構(gòu)建的雙特異性抗體也發(fā)揮了類(lèi)似的降解作用，進(jìn)一步突出了靶向降解膜蛋白的KineTAC平臺(tái)的模塊化優(yōu)勢(shì)。

5 GlueTAC技術(shù)

相對(duì)于前文中介紹的依賴(lài)細(xì)胞膜表面特定受體的膜蛋白降解技術(shù)，GlueTAC創(chuàng)造性地采用化學(xué)合成的“穿膜肽”促進(jìn)復(fù)合物內(nèi)化，在各種細(xì)胞中都可以發(fā)揮作用，尤其是對(duì)異質(zhì)性強(qiáng)的腫瘤組織有更好的適用性。如圖3所示，GlueTAC包含：①具有共價(jià)結(jié)合抗原能力的共價(jià)納米抗體(GlueBody)；②帶有正電的穿膜肽和溶酶體分選肽(CPP+LSS)，二者通過(guò)轉(zhuǎn)肽酶(Sortase A)偶聯(lián)在一起[25]。GlueTAC分子中用納米抗體替換了傳統(tǒng)IgG抗體，顯著增加了降解子的組織滲透。首先，分子量小的降解子和抗原復(fù)合物也更容易在穿膜肽的促進(jìn)下內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞；其次，通過(guò)向納米抗體中定點(diǎn)引入具有鄰近反應(yīng)活性的非天然氨基酸，賦予納米抗體共價(jià)結(jié)合抗原的能力，最大程度地降低了降解過(guò)程中的脫靶效應(yīng)；最后，利用轉(zhuǎn)肽酶將穿膜肽和溶酶體分選序列 (CPP+LSS)與納米抗體偶聯(lián)在一起，實(shí)現(xiàn)降解子在結(jié)合抗原后的主動(dòng)快速內(nèi)吞和降解。研究人員通過(guò)開(kāi)發(fā)靶向免疫檢查點(diǎn)PD-L1的GlueTAC分子驗(yàn)證了該技術(shù)的有效性。體外實(shí)驗(yàn)表明，共價(jià)形式的降解子能夠快速降低三陰乳腺癌(MDA-MB-231)和非小細(xì)胞肺癌(H460)等細(xì)胞表面的PD-L1蛋白含量，并展現(xiàn)出比單一的阻斷性抗體更強(qiáng)的激活T細(xì)胞的活性。同時(shí)，研究者在活體動(dòng)物層面上證明，與FDA批準(zhǔn)的靶向PD-L1的阿特珠單抗相比，GlueTAC也更為有效地抑制了免疫重建小鼠上的腫瘤生長(zhǎng)。

圖3 GlueTAC降解膜蛋白的作用機(jī)制：非天然氨基酸修飾的納米抗體偶聯(lián)帶正電的穿膜肽與溶酶體分選肽后形成的復(fù)合物與膜蛋白共價(jià)結(jié)合后內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi)，在溶酶體中降解膜蛋白

值得注意的是，雖然在納米抗體結(jié)合抗原誘發(fā)的鄰近效應(yīng)存在下，GlueTAC內(nèi)化進(jìn)入表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞速率要遠(yuǎn)大于不表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞，但強(qiáng)正電性的穿膜肽使其在濃度較高時(shí)同樣能夠非特異地進(jìn)入非靶細(xì)胞中。這使得在全身性給藥時(shí)，降解子的生物利用率因正常組織細(xì)胞的攝取而降低，部分限制了其應(yīng)用范圍。但重要的是，GlueTAC通過(guò)鄰近效應(yīng)誘發(fā)下的交聯(lián)反應(yīng)特異性地共價(jià)結(jié)合抗原，在腫瘤組織中會(huì)有更長(zhǎng)時(shí)間的停留和作用，是一種非常值得關(guān)注的藥物形式[13]。

6 總結(jié)與展望

隨著對(duì)膜蛋白的發(fā)生、折疊以及生物功能的深入理解，可以發(fā)現(xiàn)，膜蛋白與其他可溶性蛋白一樣具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，在許多細(xì)胞的基本生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，其中大多數(shù)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。膜蛋白約占全部基因組編碼基因的30%，但迄今為止已知其空間結(jié)構(gòu)的膜蛋白相對(duì)較少[26]。因此，能夠靶向結(jié)合其特定活性位點(diǎn)的小分子抑制劑的設(shè)計(jì)面臨重重阻礙，導(dǎo)致這些關(guān)鍵的膜蛋白成為主要的“不可成藥”靶點(diǎn)。

近年來(lái)，PROTAC技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用為靶向這類(lèi)膜蛋白帶來(lái)了新思路。PROTAC技術(shù)首先設(shè)計(jì)具有雙靶向功能的小分子，通過(guò)靶向跨膜E3連接酶間接靶向結(jié)合膜蛋白，充分利用自身泛素-蛋白酶體系統(tǒng)達(dá)到結(jié)合并降解膜蛋白的目的，打破了傳統(tǒng)小分子抑制劑無(wú)法靶向結(jié)合并抑制其生物學(xué)功能的困局。但PROTAC技術(shù)受限于跨膜E3連接酶的種類(lèi)和數(shù)量，目前僅發(fā)現(xiàn)ZNRF3與RNF43兩種合適的跨膜E3連接酶，均具有極高的開(kāi)發(fā)價(jià)值[23]。因此，發(fā)現(xiàn)更多可用的跨膜E3連接酶將為未來(lái)PROTAC技術(shù)在膜蛋白降解中的廣泛應(yīng)用開(kāi)辟出新的道路。為了克服對(duì)跨膜E3連接酶的依賴(lài)，LYTAC技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)繞開(kāi)了最具吸引力的泛素-蛋白酶體途徑，轉(zhuǎn)而利用少有研究的溶酶體途徑。通過(guò)模擬細(xì)胞表面溶酶體結(jié)合受體CI-M6PR的天然識(shí)別模式，對(duì)靶向結(jié)合膜蛋白的單克隆抗體進(jìn)行糖基化修飾，使修飾后的抗體在結(jié)合膜蛋白的同時(shí)被CIM6PR識(shí)別，并隨著CI-M6PR內(nèi)化、運(yùn)送至溶酶體中，實(shí)現(xiàn)膜蛋白的降解。但LYTAC需要對(duì)抗體進(jìn)行糖基化修飾，導(dǎo)致降解子合成路線冗長(zhǎng)復(fù)雜，非常耗時(shí)，這一不足大大阻礙了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用[21]。而AbTAC同時(shí)具備了LYTAC與PROTAC的優(yōu)勢(shì)，以可完全基因編碼的雙特異性抗體連接跨膜E3連接酶RNF43與膜蛋白，巧妙地解決了糖基化修飾的抗體合成困難的問(wèn)題。KineTAC則在AbTAC的基礎(chǔ)上擴(kuò)展了膜蛋白降解的范圍，利用細(xì)胞趨化因子CXCL12能夠與細(xì)胞表面溶酶體受體CXCL7特異性識(shí)別，將CXCL12的N端識(shí)別序列與膜蛋白的抗體識(shí)別序列組合成能夠完全基因編碼的雙特異性抗體，使降解子的模塊化成為可能[14]。相較于上述膜蛋白降解技術(shù)，GlueTAC最大的優(yōu)勢(shì)在于非天然氨基酸的引入使降解子與膜蛋白共價(jià)結(jié)合，大大降低了脫靶效應(yīng)，同時(shí)提高了降解子的降解效率和安全性，而穿膜肽的引入則賦予降解子無(wú)須依賴(lài)任何E3連接酶或細(xì)胞膜表面受體即可進(jìn)入細(xì)胞膜的能力，是一種獨(dú)樹(shù)一幟的降解方式。幾種不同的膜蛋白降解技術(shù)匯總?cè)绫?所示。

表1 膜蛋白靶向降解技術(shù)匯總

綜上所述，通過(guò)利用不同的跨膜E3連接酶、細(xì)胞膜表面受體等將蛋白質(zhì)靶向降解技術(shù)成功應(yīng)用于膜蛋白的降解，不僅解決了傳統(tǒng)小分子抑制劑與抗體抑制不徹底或產(chǎn)生耐藥的問(wèn)題，且克服了早期PROTAC僅能靶向胞內(nèi)蛋白或滲透性強(qiáng)的蛋白的局限性。但上述膜蛋白靶向降解技術(shù)的降解作用受到多種因素的調(diào)節(jié)，包括不同的降解技術(shù)所依賴(lài)的細(xì)胞膜表面受體或E3連接酶的表達(dá)量、配體的結(jié)合親和力、結(jié)合表位、降解子及形成的三元復(fù)合物的穩(wěn)定性等，因此仍需要進(jìn)一步對(duì)降解子的各組分針對(duì)性地優(yōu)化和改造。一方面，對(duì)于依賴(lài)泛素蛋白酶體降解途徑的PROTAC與AbTAC，迫切需要發(fā)現(xiàn)除CRBN、VHL、RNF43等之外的其他不同類(lèi)型的E3連接酶，為二者提供更多的選擇去開(kāi)發(fā)更具靶向性的降解子，降低脫靶效應(yīng)；另一方面，對(duì)于依賴(lài)溶酶體降解途徑的GlueTAC、KineTAC、LYTAC等，除了發(fā)現(xiàn)其他具有特異性的能夠靶向溶酶體的細(xì)胞膜表面受體之外，對(duì)降解子本身包括抗體結(jié)合親和力、結(jié)合表位、連接子長(zhǎng)度及柔性等性質(zhì)仍有待系統(tǒng)地優(yōu)化，以適應(yīng)不同類(lèi)型的膜蛋白降解。除此之外，在驗(yàn)證降解子的降解功能的同時(shí)，應(yīng)進(jìn)行全面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，評(píng)估降解子對(duì)其他相關(guān)蛋白數(shù)量與功能的影響，尤其是降解子是否在體內(nèi)積累產(chǎn)生副作用等問(wèn)題[27]。與抑制的治療策略相比，降解膜蛋白使其徹底喪失生物學(xué)功能的策略更具有吸引力，而技術(shù)上所面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)也是并存的。在未來(lái)長(zhǎng)期的研究與探索下，這些膜蛋白靶向降解技術(shù)將會(huì)被開(kāi)發(fā)成一種新的臨床治療手段，為相關(guān)疾病的治療帶來(lái)福音。