一株P(guān)AHs 降解菌Bacillus halotolerans M-7 的篩選、鑒定及其特性

張世堂，胡澤祥，婁國生，張再美，高盛嵩，陳 爽

（1.92228 部隊，北京 100072；2.91286 部隊，山東青島 266021；3.中國石油大學(xué)（華東）化學(xué)化工學(xué)院，山東青島 266580）

航空煤油是一種重要的戰(zhàn)略資源，如果儲存不當(dāng)就會受到微生物的污染。一方面，這些微生物污染會引發(fā)許多問題，如：燃料燃燒性能下降；燃料中微生物代謝產(chǎn)物可能會腐蝕貯藏設(shè)備、管道、氧化密封項圈，微生物的團(tuán)簇也會造成飛機(jī)過濾器等的堵塞[1]，對航空煤油中主要的污染微生物進(jìn)行研究，將有助于微生物污染的防治。而另一方面，這些微生物能夠在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，氧氣濃度低的環(huán)境下生存，能夠利用并降解多種烴類，包括鏈烷烴、環(huán)烷烴甚至是難降解的多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）等石油物質(zhì)，其生物降解特性值得關(guān)注[2]。PAHs 是指含2 個或2 個以上苯環(huán)的芳烴，是一類有毒的有機(jī)污染物。在人類社會的發(fā)展過程中，人為造成的PAHs 排放量越來越大，主要是由于各種礦物燃料（如煤、石油和天然氣等）、木材、紙以及其他含碳?xì)浠衔锏牟煌耆紵蛟谶€原條件下熱解形成等[3]，其污染問題引起了世界各國的普遍重視。研究發(fā)現(xiàn)，隨著多環(huán)數(shù)目的增加，PAHs 的抗生物降解能力和致癌性會增大，且由于在許多生物鏈中都存在生物積累效應(yīng)，導(dǎo)致PAHs 污染嚴(yán)重危害著土壤的生產(chǎn)、生態(tài)功能以及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和人類健康[4]。

有研究表明，微生物降解PAHs 是解決PAHs 污染最主要的途徑[5]。受烴類污染的土壤、海水或油品是高效降解菌株的主要來源。目前已知的能夠降解PAHs 的微生物包括芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和黃桿菌屬等[6-10]。孟建宇等[11]從烏梁素海水中篩選出一株假單胞菌，可降解質(zhì)量濃度為3.5 g/L 的萘。馬丹[12]從含油廢水分離出一株菲降解菌，培養(yǎng)5 d后對菲的降解率為43.57%。但是，很少有降解菌能夠同時高效降解航空煤油和PAHs，對于降解PAHs 的研究也很少關(guān)注對同分異構(gòu)體的降解效果。

本研究以污染的航空煤油為污染微生物來源，富集后通過平板分離法篩選得到降解菌，通過形態(tài)觀察、生理生化特征及16S rRNA 序列比對對篩選的降解菌進(jìn)行鑒定，最后對該菌株降解不同種類PAHs 的能力進(jìn)行了測定，以期為受PAHs 污染土壤的微生物降解提供微生物資源，同時鑒定航空煤油中的污染菌株并研究其降解特性，對減少航空煤油中微生物的污染和提高油品質(zhì)量有重要意義。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸銨2.5 g、硫酸鈉1.0 g、無水氯化鈣0.1 g、無水硫酸鎂1.0 g、酵母粉0.1 g、氯化鈉30.0 g、乳酸鈉水溶液1.0 mL、磷酸氫二鉀0.5 g。加入適量去離子水，完全溶解后，定容至1 L。取若干250 mL 錐形瓶，每瓶分裝50 mL，121 ℃高壓滅菌20 min 備用。

篩選液體培養(yǎng)基：向滅菌后的50 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基加入過濾器除菌的油品0.75 mL，即為篩選液體培養(yǎng)基。每50 mL 篩選液體培養(yǎng)基中加入0.9 g 瓊脂粉即為篩選固體培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌20 min 后備用。

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）：稱取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基粉末30.0 g，加入適量去離子水，完全溶解后，定容至1 L。取若干250 mL 錐形瓶，每瓶分裝50 mL；每50 mL TSB 中加入0.9 g 瓊脂粉即為胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基（TSA），121 ℃高壓滅菌20 min 后備用。

萘、蒽、菲降解培養(yǎng)基：以萘為例，用正己烷溶解固體萘，將其配制成1.0 g/L 的母液；向滅菌后的50 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基加入2.5 mL 的母液，使萘的工作濃度為50 mg/L。待正己烷揮發(fā)后即為萘降解培養(yǎng)基，蒽、菲降解培養(yǎng)基配制方法同萘。

1.2 降解菌的富集及篩選

在無菌環(huán)境下，用無菌的0.22 μm 濾膜抽濾4.0 L污染的油品，得到帶有菌體的濾膜，低溫環(huán)境下運輸至實驗室。用2.0 mL 無菌水沖洗上述濾膜，得到的菌懸液加至50 mL 篩選液體培養(yǎng)基中，放置于恒溫震蕩搖床中，35 ℃、165 r/min 培養(yǎng)至渾濁，同樣的條件轉(zhuǎn)接3次，經(jīng)過富集最終得到能夠利用油品的微生物菌群。取富集液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋的菌液涂布于篩選固體培養(yǎng)基平板上，在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，直到長出單菌落，并對菌株進(jìn)行劃線純化，得到的菌株即為初篩得到的降解菌。將初篩得到的降解菌接種至TSB中，35 ℃、165 r/min 活化12 h。按照1%的接種量將活化的種子液轉(zhuǎn)接至篩選液體培養(yǎng)基中，35 ℃、165 r/min條件下培養(yǎng)7 d，每組3 個平行，以不接種菌株的培養(yǎng)液作為對照。利用紫外分光光度法測定菌株對油品的降解率，根據(jù)降解率篩選獲得高效降解菌。

1.3 紫外分光光度法測定油品降解率

1.3.1 最佳吸收波長的確定 利用石油醚（60～90 ℃）（以下簡稱石油醚）作為萃取劑，萃取加入至篩選液體培養(yǎng)基中的油品，每次加入10.0 mL 的石油醚，在分液漏斗中靜置10 min，等待分層，收集有機(jī)相，以上步驟重復(fù)3 次，收集后的有機(jī)相稀釋至適當(dāng)濃度后進(jìn)行紫外全波長掃描。同時，配制1.0 g/L 的油品標(biāo)準(zhǔn)溶液，以石油醚為空白對照，在波長200～300 nm 的范圍內(nèi)利用紫外可見分光光度計對萃取后溶液及1.0 g/L 的油品標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度進(jìn)行測定，確定最佳吸收波長[13]。

1.3.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制濃度為100～1 000 mg/L的油品標(biāo)準(zhǔn)溶液，以石油醚為空白對照，利用紫外-可見分光光度計測定最佳吸收波長處的吸光值，以油品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 菌株降解率的測定 將降解菌接種至TSB 中，置于恒溫培養(yǎng)搖床中，在35 ℃、165 r/min 條件下活化12 h。將活化后的種子液按照1%的接種量轉(zhuǎn)接至篩選液體培養(yǎng)基中，35 ℃、165 r/min 條件下培養(yǎng)7 d，每組3 個平行，以不接種菌株的培養(yǎng)液作為對照。利用紫外分光光度法測定降解率，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算油品的殘留量，借助公式（1）計算出菌株的降解率。

1.4 降解菌的鑒定

依據(jù)文獻(xiàn)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[14]和博檢鑒定試劑盒中的使用說明對降解菌進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化特性鑒定。提取M-7 的DNA，以細(xì)菌通用引物27F（5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'）、1492R（5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）分別為上下游引物[15]，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系總體積為20.00 μL，LA-Taq 酶0.25 μL，模板1.00 μL，無菌水5.25 μL，2×GC Buffer Ⅰ12.50 μL，dNTP 2.00 μL，上下游引物各0.50 μL。循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性300 s；95 ℃變性50 s；46.4 ℃退火45 s；72 ℃延伸90 s。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測上述PCR 產(chǎn)物。將條帶大小正確的PCR 產(chǎn)物送去北京擎科生物科技有限公司青島分公司進(jìn)行測序。利用BLAST 比對已知微生物的16S rRNA 序列，分析得到同源序列。采用ClustalX2.0[16]和MEGA7.0[17]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用鄰接法并通過自舉分析（1 000 次）進(jìn)行置信度檢測。

1.5 氣相色譜法測定PAHs 降解率

首先繪制PAHs 標(biāo)準(zhǔn)曲線。以萘為例，配制濃度為20、40、60、80、100 mg/L 的萘標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用氣相色譜法測定其峰面積。以萘的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。菲、蒽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法同萘。氣相色譜條件如下：進(jìn)樣口溫度300 ℃，檢測器溫度330 ℃，毛細(xì)管柱50 m×0.25 mm×0.25 μm，柱溫130 ℃保持3 min，以45 ℃/min 的升溫速率升溫至180 ℃，保持5 min，再以45 ℃/min 的升溫速率升溫至280 ℃，保持5 min，進(jìn)樣量1 μL[18]。

隨后，測定菌株對不同PAHs 的降解率。降解菌在TSB 中活化12 h 后，按照1%的接種量轉(zhuǎn)接至萘、蒽、菲降解培養(yǎng)基中，35 ℃、165 r/min 條件下培養(yǎng)6 d，每隔24 h 取樣，測定菌株的PAHs 降解率，具體方法包括：吸取5 mL 培養(yǎng)液加入裝有2.0 g 氯化鈉和10 mL正己烷溶液的離心管中，用旋渦混合器混勻2 min，7 000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至玻璃小瓶中。用2.0 g 無水硫酸鈉脫水，30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，氮氣吹至1 mL以下，正己烷定容至1 mL[19]用氣相色譜儀測定各PAHs 的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 建立紫外分光光度法測定油品的降解率

2.1.1 最佳吸收波長的確定 首先，利用紫外可見分光光度計對1.0 g/L 的油品標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖1，標(biāo)準(zhǔn)溶液在226 nm 和266 nm 處有最大吸收峰，隨后，用同樣的方法對萃取后的油品進(jìn)行了全波長掃描，結(jié)果表明，二者最大吸收峰位置一致，證明該檢測方法適用于接下來油品降解率的測定。由于在200～238 nm 內(nèi)石油醚的吸收性很強(qiáng)，容易干擾實驗測定結(jié)果[20]，為減少干擾而優(yōu)選266 nm 為最佳吸收波長。

圖1 萃取后油品和油品標(biāo)準(zhǔn)液紫外全波長掃描結(jié)果

2.1.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以石油醚為空白對照，用紫外可見分光光度計測定266 nm 處的吸光度，以油品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），得到線性方程為y=0.000 6x+0.021 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.993，表明吸光度與油品濃度之間呈較好的線性關(guān)系，該方法可用于油品含量測定。

圖2 油品濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 降解菌富集及篩選

從受污染的油品中初篩得到9 株能夠以油品為唯一碳源進(jìn)行生長代謝的菌株，分別將其編號命名為：M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7、M-8、M-9。將9株菌株培養(yǎng)7 d 后，利用石油醚萃取殘余油樣，適當(dāng)稀釋后測定266 nm 波長處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到菌株降解后殘余油品的濃度，最后通過公式（1）計算各菌株的降解率，結(jié)果見圖3。9 株菌株對油品都具有一定的降解能力，其中菌株M-7 降解率最高，為99.00%，表現(xiàn)出高效降解混合油品的能力，因此，確定菌株M-7 為后續(xù)實驗菌株。

圖3 9 株菌株培養(yǎng)7 d 的油品降解率

2.3 降解菌M-7 的鑒定

對菌株M-7 在TSA 上的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖4a，菌落呈乳白色、粗糙、不透明狀，邊緣不規(guī)則，與芽孢桿菌的形態(tài)特征相似。掃描電鏡圖顯示M-7 為短而小的桿菌，見圖4b。隨后，對該菌株進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果見表1。菌株M-7 對β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸鹽利用、硫化氫產(chǎn)生、VP、氧化酶的實驗結(jié)果為陽性，其余實驗結(jié)果均為陰性，說明菌株M-7 可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶、脲酶、氧化酶，能夠利用葡萄糖、蔗糖、檸檬酸鹽產(chǎn)酸，可分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫等，實驗結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和王青華等[21]報道的芽孢桿菌的生化結(jié)果相似。

表1 生理生化鑒定結(jié)果

圖4 a.M-7 菌落形態(tài)和b.掃描電鏡形態(tài)觀察

最后，對該菌株進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定。提取菌株基因組，經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到1 300 bp 左右的條帶并進(jìn)行測序。通過BLAST 對測序結(jié)果進(jìn)行同源比對，利用ClustalX2.0 和MAGE7.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），菌株M-7 與芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株Bacillus halotolerans的16S rRNA 序列同源性最高，達(dá)到了99.86%，因此，確定該菌株為Bacillus halotolerans，將其命名為Bacillus halotolerans M-7。

圖5 M-7 菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 氣相色譜法測定PAHs 降解率

2.4.1 PAHs 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 配制不同濃度的萘、蒽、菲標(biāo)準(zhǔn)溶液用氣相色譜法分別測定峰面積，分別作出萘、蒽、菲濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖6，萘的線性方程為y=180.500 0x+520.000 0，R2=0.996；蒽的線性方程為y=635.357 1x+1 562.857 1，R2=0.997；菲的線性方程為y=498.228 7x+495.238 1，R2=0.991，相關(guān)系數(shù)都大于0.990，線性關(guān)系較好。

圖6 a.萘、b.蒽和c.菲的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 降解菌對PAHs 萘、蒽、菲的降解性能測定Bacillus halotolerans M-7 對三種PAHs 都有不同程度的降解（圖7）。該菌株對二環(huán)芳烴萘的降解率最高，第1 d 的降解率就能達(dá)到60.00%以上，第6 d 幾乎全部降解。但是，對三環(huán)芳烴的降解率要低。蒽在前4 d 的降解率幾乎為0，4 d 之后才開始有所降解，這可能是因為50 mg/L 的蒽在作為唯一碳源和氮源的情況下，不足以支撐菌株的快速生長，因此，Bacillus halotolerans M-7 在前4 d 的代謝十分緩慢，需要經(jīng)歷較長的遲滯期才進(jìn)入快速生長的對數(shù)期。同樣的，該菌株對蒽的同分異構(gòu)體菲的降解也出現(xiàn)類似現(xiàn)象。隨著培養(yǎng)時間的延長，蒽和菲開始被降解，在第6 d 時，降解率分別為39.89%、47.69%，且降解率依然呈現(xiàn)上升趨勢。對比該菌株對不同環(huán)數(shù)的PAHs 的降解能力發(fā)現(xiàn)，Bacillus halotolerans M-7 對二環(huán)芳烴萘的降解率明顯優(yōu)于對三環(huán)芳烴蒽和菲，根據(jù)思顯佩等[22]的研究，推斷PAHs苯環(huán)的斷開主要是靠加氧酶的作用，加氧酶把氧加到C-C 鍵上形成C-O 鍵，經(jīng)加氫、脫水等作用使C-C 鍵斷裂，從而使苯環(huán)數(shù)減少，因此，推斷苯環(huán)越多越難降解。故該菌株對于兩環(huán)的萘的降解效果優(yōu)于三環(huán)的蒽、菲。對于相同環(huán)數(shù)的蒽和菲而言，該菌株對菲的降解要優(yōu)于對蒽的降解。劉俊等[23]研究發(fā)現(xiàn)乳白耙齒菌F17 對菲的降解效果比蒽要好，杜麗娜等[24]同樣發(fā)現(xiàn)青頂擬多孔菌對菲的降解能力要優(yōu)于蒽的降解，這與本實驗結(jié)果一致。這種差異顯然是由于菲和蒽分子結(jié)構(gòu)的不同所引起[23]，蒽和菲3 個苯環(huán)的位置不同而有著不同的降解途徑。

圖7 Bacillus halotolerans M-7 對萘、蒽、菲的降解性能

3 結(jié)論

本文從污染的航空煤油中篩選獲得1 株能夠高效降解航空煤油混合物和PAHs 的菌株，通過形態(tài)觀察、生理生化特征及16S rRNA 序列分析對篩選的降解菌進(jìn)行鑒定，最后對該菌株降解不同種類PAHs 的能力進(jìn)行測定，主要得出以下結(jié)論：

（1）從污染的油品中篩選出9 株能夠高效降解油品混合物的菌株，9 株菌株對油品的降解率都在80.00%以上。通過二次篩選，篩選出1 株表現(xiàn)較好的M-7 菌株，其對油品的降解率達(dá)到99.00%以上。通過形態(tài)觀察、生理生化實驗及16S rRNA 序列比對對菌株進(jìn)行鑒定，該菌株屬于芽孢桿菌屬，命名為Bacillus halotolerans M-7。

（2）利用氣相色譜法檢測該菌株對不同PAHs 的降解率，結(jié)果表明，培養(yǎng)7 d 后，Bacillus halotolerans M-7 對萘、蒽、菲的降解率分別為99.26%、39.89%、47.69%，其中二環(huán)芳烴萘的降解率明顯優(yōu)于三環(huán)芳烴的蒽和菲，同為三環(huán)芳烴的同分異構(gòu)體蒽和菲，對菲的降解率大于蒽，表明該菌株對于同分異構(gòu)體的降解具有不同的途徑。

本研究為受PAHs 污染土壤的微生物降解提供了微生物資源，同時鑒定航空煤油中的污染菌株并研究其降解特性，對減少航空煤油中微生物的污染和提高油品質(zhì)量有重要意義。