兩種防冰劑對(duì)噴氣燃料中微生物抑菌性能對(duì)比

胡澤祥，張世堂，婁國(guó)生，高盛嵩，陳 爽

（1.92228 部隊(duì)，北京 100072；2.91286 部隊(duì)，山東青島 266021；3.中國(guó)石油大學(xué)（華東）化學(xué)化工學(xué)院，山東青島 266580）

燃料中的微生物污染會(huì)導(dǎo)致燃料潔凈性、燃燒性與流動(dòng)性等效果下降[1－2]；同時(shí)會(huì)引起燃料儲(chǔ)存、供給系統(tǒng)部件堵塞，干擾計(jì)量系統(tǒng)正常工作[3]；還會(huì)加劇油箱、儲(chǔ)罐和管道的腐蝕，使內(nèi)部涂層脫落、內(nèi)壁生銹，產(chǎn)生大量淤泥[4－5]。在20 世紀(jì)30 年代，燃料中微生物污染的問(wèn)題引起了各燃料管理機(jī)構(gòu)的關(guān)注[6]，微生物污染影響燃料使用與飛機(jī)飛行的事件在國(guó)內(nèi)外均有記錄[7－8]。因微生物個(gè)體小、分布范圍廣、生長(zhǎng)繁殖快，燃料中的微生物難以徹底去除[9]。為防止微生物污染的危害，國(guó)內(nèi)外所有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范中均含有針對(duì)微生物污染防治的手段[6－7，10]。徹底的殺菌工作需要采用具有特殊要求的殺菌劑，殺菌前需排出全部燃料，殺菌后需多次清洗處理并干燥。殺菌手段往往是一種“休克療法”，當(dāng)燃料儲(chǔ)存、供應(yīng)系統(tǒng)發(fā)生嚴(yán)重的微生物污染事故時(shí)，才會(huì)采取繁瑣復(fù)雜的殺菌手段[10-11]。做好日常質(zhì)量管理、預(yù)防微生物生長(zhǎng)繁殖是解決微生物污染的最優(yōu)方法[11]。

防冰劑是一種較為常見(jiàn)的飛機(jī)噴氣燃料添加劑，其主要功能是降低水分的冰點(diǎn)，防止噴氣燃料中產(chǎn)生冰晶。防冰劑主要為醇醚類(lèi)化合物，既能溶于水，又能溶于燃料。因?yàn)榉辣鶆┠芘c水混溶且具備一定的細(xì)胞毒性，除防止冰晶產(chǎn)生的作用外，防冰劑還具有抑制微生物生長(zhǎng)繁殖的作用。

國(guó)內(nèi)對(duì)于防冰劑的使用方法主要參考美國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，早期采用乙二醇單甲醚（EGME）作為防冰劑[12]，但因EGME 存在降低燃料閃點(diǎn)、毒性較大等問(wèn)題，被二乙二醇單甲醚（DiEGME）取代[13]。目前國(guó)內(nèi)以DiEGME作為主要采用的防冰劑，有研究指出，DiEGME 蒸氣壓較高，在接觸壁面冷凝后產(chǎn)生的高濃度液滴會(huì)引起涂層溶脹并剝落，影響飛機(jī)油箱的正常使用并導(dǎo)致輸送管線堵塞[14]。三乙二醇單甲醚（TriEGME）相比于DiEGME，降低冰點(diǎn)的效果相近且對(duì)于涂層的影響很小[15]。目前，TriEGME 防止冰晶產(chǎn)生的作用已經(jīng)得到驗(yàn)證，但其抑制微生物生長(zhǎng)繁殖的作用仍待探究，若TriEGME 具備與DiEGME 相近的抑菌性能，則存在代替DiEGME，作為更優(yōu)質(zhì)的防冰劑應(yīng)用于實(shí)際。

本研究利用某油庫(kù)的噴氣燃料油樣分別在細(xì)菌、真菌培養(yǎng)條件下制備原菌液。當(dāng)光波波長(zhǎng)為600 nm時(shí)，菌液中微生物的數(shù)量與吸收的光密度OD（optical density）存在線性關(guān)系，可以用OD600表示。通過(guò)吸光光度法，快速測(cè)定菌液的吸光度以表達(dá)微生物數(shù)量。測(cè)定DiEGME 與TriEGME 分別對(duì)于噴氣燃料樣品中細(xì)菌、真菌的抑菌性能，并進(jìn)行對(duì)比分析，考察兩種防冰劑抑制微生物生長(zhǎng)繁殖的能力。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

沿海地區(qū)某油庫(kù)噴氣燃料油樣；魚(yú)粉蛋白胨，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D（+）-無(wú)水葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；二乙二醇單甲醚，上海麥克林生化科技股份有限公司；三乙二醇單甲醚，上海麥克林生化科技股份有限公司。

恒溫水浴加熱器DF-101S，鞏義市予華儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱FCD-3000，上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平ME204TE/02，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器CHA-SA，青島藍(lán)特恩科教儀器設(shè)備有限公司；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)752N，上海精密科學(xué)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LB-100SⅡ，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；超聲波清洗儀KQ-300KDE，昆山市超聲儀器有限公司；雙人超凈工作臺(tái)SW-CJ-2G，上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；奧林巴斯生物顯微鏡CX31，奧林巴斯（中國(guó)）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌、真菌培養(yǎng)基配制 稱取30 g 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基試劑，加入純化水，在恒溫50 ℃下水浴攪拌至溶解，待冷卻后定容為1 L 溶液，分裝后于121 ℃下高壓滅菌15 min，作為細(xì)菌培養(yǎng)基備用。同理，稱取10 g 魚(yú)粉蛋白胨與40 g 無(wú)水葡萄糖試劑，加入純化水，在恒溫50 ℃下水浴攪拌至溶解，待冷卻后定容為1 L 溶液，分裝后于115 ℃下高壓滅菌15 min，作為真菌培養(yǎng)基備用[16]。

1.2.2 細(xì)菌、真菌原菌液制備 將現(xiàn)場(chǎng)取得噴氣燃料油樣置于滅菌后試劑瓶中密封，輕微振蕩使其混合均勻。在雙人超凈工作臺(tái)SW-CJ-2G 中用移液槍移取1 mL未過(guò)濾的噴氣燃料，加入到滅菌后的500 mL 細(xì)菌培養(yǎng)基中。同理將1 mL 未過(guò)濾的噴氣燃料加入到500 mL真菌培養(yǎng)基中。并將兩種培養(yǎng)基置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中分別在對(duì)應(yīng)溫度（細(xì)菌培養(yǎng)基37 ℃、真菌培養(yǎng)基28 ℃）下培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)后分別得到噴氣燃料樣品中細(xì)菌與真菌（以下分別簡(jiǎn)稱為細(xì)菌、真菌）的原菌液。輕微振蕩混合均勻后，用移液槍移取200 μL 原菌液制成玻片標(biāo)本，采用奧林巴斯生物顯微鏡CX31 鏡檢觀察形態(tài)加以驗(yàn)證。

1.2.3 不同體積分?jǐn)?shù)DiEGME 抑菌性能測(cè)定 在無(wú)菌環(huán)境中，將DiEGME 作為防冰劑以體積分?jǐn)?shù)10%、20%、30%、40%、50%、60%的比例加入到細(xì)菌培養(yǎng)基中，于250 mL 錐形瓶中配制100 mL 溶液，并取100 mL無(wú)DiEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基于250 mL 錐形瓶中作為對(duì)照樣，移液槍移取10 mL 細(xì)菌原菌液加入到每個(gè)錐形瓶中，采用透氣膜與耐熱橡皮筋封口，將上述7 份含不同體積分?jǐn)?shù)防冰劑的培養(yǎng)基作為一組，準(zhǔn)備三組作為平行實(shí)驗(yàn)組，在后續(xù)測(cè)定過(guò)程中取三組的平均值以消除誤差，將上述三組培養(yǎng)基記為DiEGME 細(xì)菌培養(yǎng)組。同理將DiEGME 加入到真菌培養(yǎng)基中，并取100 mL 真菌培養(yǎng)基作為對(duì)照并封口，準(zhǔn)備三組作為平行實(shí)驗(yàn)組，記為DiEGME 真菌培養(yǎng)組。

通過(guò)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)752N，分別測(cè)定DiEGME 細(xì)菌培養(yǎng)組、DiEGME 真菌培養(yǎng)組在光波波長(zhǎng)為600 nm 時(shí)的吸光度（OD600），重復(fù)測(cè)定3 次取平均值以消除誤差，并記錄為0 h 下OD600。將DiEGME 細(xì)菌培養(yǎng)組、DiEGME 真菌培養(yǎng)組分別在37 ℃（細(xì)菌培養(yǎng)組）、28 ℃（真菌培養(yǎng)組）恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并依次在2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 時(shí)停止振蕩，取出樣品測(cè)定OD600。

為了準(zhǔn)確分析DiEGME 能實(shí)現(xiàn)有效抑菌的濃度，再次按照上述實(shí)驗(yàn)方法，加入體積分?jǐn)?shù)12%、14%、16%、18%的DiEGME 到細(xì)菌培養(yǎng)基中，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定OD600，以確定DiEGME 具體的抑菌濃度。

1.2.4 不同體積分?jǐn)?shù)TriEGME 抑菌性能測(cè)定 同理，按照1.2.3 中相同操作，將TriEGME 作為防冰劑進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)操作，得到TriEGME 細(xì)菌培養(yǎng)組與TriEGME真菌培養(yǎng)組，并測(cè)定24 h 內(nèi)OD600變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物顯微鏡鏡檢結(jié)果

采用1.2.2 所述方法在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)細(xì)菌和真菌，制備細(xì)菌、真菌原菌液，采用生物顯微鏡對(duì)原菌液的細(xì)菌、真菌玻片進(jìn)行觀察，通過(guò)微生物細(xì)胞形態(tài)，確定所采用的菌液制備方法可靠有效以及細(xì)菌、真菌原菌液中無(wú)相互摻雜干擾。生物顯微鏡鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 細(xì)菌原菌液鏡檢結(jié)果

圖2 真菌原菌液鏡檢結(jié)果

通過(guò)鏡檢結(jié)果可以看出，細(xì)菌玻片中存在數(shù)量較多形態(tài)與桿菌相似的細(xì)胞，并無(wú)真菌等其他形態(tài)微生物。真菌玻片中存在明顯的菌絲結(jié)構(gòu)，基本不存在其他類(lèi)型微生物。可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)室條件下的細(xì)菌、真菌培養(yǎng)方法具有可行性，且基本無(wú)細(xì)菌、真菌相互摻雜干擾的情況。

2.2 DiEGME 抑菌性能測(cè)定

2.2.1 DiEGME 對(duì)于細(xì)菌的抑制效果 按照1.2.3 所述的方法，測(cè)定24 h 內(nèi)含0、10%、20%、30%、40%、50%、60%體積分?jǐn)?shù)DiEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基的OD600，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 DiEGME 細(xì)菌培養(yǎng)組24 h 內(nèi)OD600 結(jié)果

由圖3 可見(jiàn)，無(wú)DiEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基OD600在0～2 h 內(nèi)緩慢增大，在2～8 h 內(nèi)呈對(duì)數(shù)形迅速增大，在8～12 h 內(nèi)OD600趨于穩(wěn)定，在12 h 后OD600逐漸減小。10%體積分?jǐn)?shù)DiEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基在12 h 內(nèi)OD600相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)明顯變化，在12 h 后OD600逐漸增大，在24 h 時(shí)具有繼續(xù)增大的趨勢(shì)。而其他更高體積分?jǐn)?shù)DiEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基OD600在24 h 內(nèi)穩(wěn)定在初始值附近，并略微減小，與12 h 內(nèi)10%體積分?jǐn)?shù)DiEGME的細(xì)菌培養(yǎng)基處于同一水平。

10%體積分?jǐn)?shù)的DiEGME 在12 h 內(nèi)對(duì)細(xì)菌具備一定的抑菌性能，OD600與其他體積分?jǐn)?shù)下處于同一水平，但超過(guò)12 h 后DiEGME 細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖開(kāi)始變得明顯，從而表現(xiàn)為OD600增加。說(shuō)明10%體積分?jǐn)?shù)下的DiEGME 無(wú)法對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生持續(xù)有效的抑菌作用。

為確定DiEGME 對(duì)于燃料中細(xì)菌具體的抑菌濃度，測(cè)定24 h 內(nèi)含12%、14%、16%、18%體積分?jǐn)?shù)DiEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基的OD600，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 10%～20%體積分?jǐn)?shù)DiEGME 細(xì)菌培養(yǎng)組24 h 內(nèi)OD600 結(jié)果

DiEGME 體積分?jǐn)?shù)達(dá)到12%時(shí)，前16 h 內(nèi)，細(xì)菌無(wú)明顯的生長(zhǎng)繁殖，在16 h 后細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖逐漸明顯，但速度相對(duì)慢于加入10%體積分?jǐn)?shù)DiEGME 時(shí)。DiEGME 體積分?jǐn)?shù)達(dá)到14%及以上時(shí)，對(duì)細(xì)菌可以發(fā)揮充足的抑菌性能，維持OD600穩(wěn)定于0.1 以下，在24 h內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，OD600基本不變。說(shuō)明DiEGME 在體積分?jǐn)?shù)達(dá)到14%及以上時(shí)，可以在24 h 內(nèi)有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。

2.2.2 DiEGME 對(duì)于真菌的抑制效果 測(cè)定24 h 內(nèi)含0、10%、20%、30%、40%、50%、60%體 積 分 數(shù)DiEGME 的真菌培養(yǎng)基的OD600，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 DiEGME 真菌培養(yǎng)組24 h 內(nèi)OD600 結(jié)果

由圖5 可見(jiàn)，無(wú)DiEGME 的真菌培養(yǎng)基OD600在0～4 h 內(nèi)緩慢增大，在4～12 h 內(nèi)呈對(duì)數(shù)形迅速增大，在12 h 后OD600趨于穩(wěn)定，存在略微波動(dòng)。添加10%體積分?jǐn)?shù)DiEGME 的真菌培養(yǎng)基相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)明顯變化。總體來(lái)看，不同體積分?jǐn)?shù)DiEGME 的真菌培養(yǎng)基OD600在24 h 內(nèi)穩(wěn)定在初始值附近。

通過(guò)OD600結(jié)果可以看出，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的真菌，在無(wú)DiEGME 抑制時(shí)，在10 h 達(dá)到最大生長(zhǎng)速度，培養(yǎng)14 h 后真菌數(shù)量達(dá)到穩(wěn)定。

DiEGME 體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%及以上時(shí)，對(duì)于真菌可以發(fā)揮充足的抑菌性能，維持OD600穩(wěn)定于0.1 以下。說(shuō)明DiEGME 在體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%及以上時(shí)，可以在24 h 內(nèi)有效抑制真菌生長(zhǎng)繁殖，且相比來(lái)說(shuō)，DiEGME 抑制真菌生長(zhǎng)繁殖的效果優(yōu)于抑制細(xì)菌。

2.3 TriEGME 抑菌性能測(cè)定

2.3.1 TriEGME 對(duì)于細(xì)菌的抑制效果 測(cè)定24 h 內(nèi)含0、10%、20%、30%、40%、50%、60% 體 積 分 數(shù)TriEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基的OD600，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 TriEGME 細(xì)菌培養(yǎng)組24 h 內(nèi)OD600 結(jié)果

由圖6 可見(jiàn)，無(wú)TriEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基OD600變化規(guī)律與無(wú)DiEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基一致。10%體積分?jǐn)?shù)TriEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基在8 h 內(nèi)OD600相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)明顯變化，8～12 h 時(shí)OD600逐漸增大，12～20 h 時(shí)OD600呈指數(shù)形增大，在20 h 后趨于穩(wěn)定。而其他更高體積分?jǐn)?shù)TriEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基OD600在24 h 內(nèi)穩(wěn)定在初始值附近，與8 h 內(nèi)10%體積分?jǐn)?shù)TriEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基處于同一水平。

10%體積分?jǐn)?shù)的TriEGME 在8 h 內(nèi)對(duì)細(xì)菌具備一定的抑菌性能，OD600與其他體積分?jǐn)?shù)下處于同一水平，但超過(guò)8 h 后TriEGME 無(wú)法抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，且相比于DiEGME 抑菌性能較低，表現(xiàn)為OD600以高于加入DiEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基的速度迅速增大，并在20 h 后趨于穩(wěn)定。說(shuō)明10%體積分?jǐn)?shù)下的TriEGME 無(wú)法對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生持續(xù)有效的抑菌作用。雖然細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)數(shù)量少于未添加TriEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基，但仍然出現(xiàn)細(xì)菌大量生長(zhǎng)繁殖的情況。與添加10%DiEGME 相比，采用10%TriEGME 進(jìn)行抑制生長(zhǎng)的細(xì)菌，其生長(zhǎng)繁殖速度更快并出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的穩(wěn)定期，TriEGME 抑菌性能略弱于DiEGME。

為確定TriEGME 對(duì)于燃料中細(xì)菌具體的抑菌濃度，測(cè)定24 h 內(nèi)含12%、14%、16%、18%體積分?jǐn)?shù)TriEGME 的細(xì)菌培養(yǎng)基的OD600，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 10%～20%體積分?jǐn)?shù)TriEGME 細(xì)菌培養(yǎng)組24 h 內(nèi)OD600 結(jié)果

隨著TriEGME 體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖速度減慢，在TriEGME 體積分?jǐn)?shù)增大到12%、14%、16%，細(xì)菌開(kāi)始出現(xiàn)明顯生長(zhǎng)繁殖的時(shí)間也延后至10、16、18 h，當(dāng)TriEGME 體積分?jǐn)?shù)達(dá)到18%時(shí)，OD600在24 h 內(nèi)穩(wěn)定維持于0.1 以下。說(shuō)明TriEGME 在體積分?jǐn)?shù)達(dá)到18%及以上時(shí)，可以在24 h 內(nèi)有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。

2.3.2 TriEGME 對(duì)于真菌的抑制效果 測(cè)定24 h 內(nèi)含0、10%、20%、30%、40%、50%、60%體積分?jǐn)?shù)TriEGME 的真菌培養(yǎng)基的OD600，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 TriEGME 真菌培養(yǎng)組24 h 內(nèi)OD600 結(jié)果

由圖8 可見(jiàn)，無(wú)TriEGME 的真菌培養(yǎng)基OD600變化規(guī)律與無(wú)DiEGME 的真菌培養(yǎng)基一致?？傮w來(lái)看，不同體積分?jǐn)?shù)TriEGME 的真菌培養(yǎng)基OD600在24 h 內(nèi)穩(wěn)定在初始值附近，幾乎無(wú)變化。

通過(guò)OD600結(jié)果可以看出，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的真菌，在無(wú)TriEGME 抑制時(shí)，在10 h 達(dá)到最大生長(zhǎng)速度，培養(yǎng)14 h 后真菌數(shù)量達(dá)到穩(wěn)定。

TriEGME 體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%及以上時(shí)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)真菌可以發(fā)揮充足的抑菌性能，維持OD600穩(wěn)定于0.1 以下。說(shuō)明TriEGME 在體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%及以上時(shí)，可以在24 h 內(nèi)有效抑制真菌生長(zhǎng)繁殖，且相比來(lái)說(shuō)，TriEGME 抑制真菌生長(zhǎng)繁殖的效果優(yōu)于抑制細(xì)菌。

3 結(jié)論

（1）二乙二醇單甲醚（DiEGME）在24 h 內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的體積分?jǐn)?shù)為14%，而在24 h 內(nèi)完全抑制真菌生長(zhǎng)繁殖所需的體積分?jǐn)?shù)為10%。

（2）三乙二醇單甲醚（TriEGME）在24 h 內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的體積分?jǐn)?shù)為18%，而在24 h 內(nèi)完全抑制真菌生長(zhǎng)繁殖所需的體積分?jǐn)?shù)為10%。TriEGME 與DiEGME 相比，前者對(duì)于細(xì)菌的抑菌性能略低，但差距較小，兩者對(duì)于真菌的抑菌性能相似。

（3）DiEGME 與TriEGME 針對(duì)真菌的抑菌性能均優(yōu)于細(xì)菌。