幾種環(huán)境因子對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)及磷利用率的影響

劉敏，于建霖，康會(huì)會(huì)，孔慶霞

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300392）

據(jù)悉，2016 年我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)五千多萬(wàn)噸，為全國(guó)水產(chǎn)總量的74.5%[1]。高密度養(yǎng)殖是中國(guó)主要養(yǎng)殖模式，過(guò)多的殘餌與糞便會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖水域TN、TP、CODMn等偏高[2-4]，尾水處理問(wèn)題急需解決，但水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水污染程度較低且量大，很難有效處理[5]。氨氮、亞硝酸鹽、磷等污染物在水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水中最為常見[6]。焦雋對(duì)江蘇省農(nóng)村污水研究顯示，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)生的TN 污染占總污染的11.57%，而51.12%則來(lái)自TP[7]。養(yǎng)殖尾水中磷的來(lái)源主要是養(yǎng)殖戶投喂的飼料中雜帶的飼料添加劑及其分解物，還有一部分來(lái)自水生生物的排泄物[8]。其中可溶性磷會(huì)隨水體進(jìn)入環(huán)境中，造成水體富營(yíng)養(yǎng)化，破壞生態(tài)環(huán)境[9]。

普通小球藻（Chlorella vulgaris）隸屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬，細(xì)胞直徑2～10 μm，呈球形或橢圓形[10]，內(nèi)含豐富活性代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)、微量元素和蛋白質(zhì)等天然物質(zhì)，對(duì)外部環(huán)境條件適應(yīng)性較強(qiáng)[11]，具有保健和藥理方面的作用[12]，主要以氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以利用其進(jìn)行污水凈化，改善環(huán)境[13]。

近年來(lái)利用普通小球藻處理養(yǎng)殖尾水，實(shí)施水體生物修復(fù)，成為養(yǎng)殖尾水處理技術(shù)的重點(diǎn)之一[14]。2017 年，SHEN 等[15]研究表明小球藻有利于含鹽廢水中氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽去除，并有助于小球藻油脂積累。本研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步加深對(duì)普通小球藻去除活性磷效果和途徑的認(rèn)知，為普通小球藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水處理中的科學(xué)使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源及預(yù)培養(yǎng)

小球藻取自天津農(nóng)學(xué)院海洋漁業(yè)資源實(shí)驗(yàn)室，培養(yǎng)基為f/2 培養(yǎng)基（硝酸鈉75 mg/L；磷酸二氫鈉5 mg/L；f/2 微量元素1 mL/L；f/2 維生素0.5 mL/L）。培養(yǎng)基配制完成在高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，將藻液與培養(yǎng)基1∶1 混合后放入智能高級(jí)型人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天搖瓶2～3次，防止小球藻貼壁或者沉底，培養(yǎng)鹽度為30，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為50 μmol/ （m2·s），光暗比為14 h∶10 h，相對(duì)濕度為38%，持續(xù)光照培養(yǎng)，試驗(yàn)前取適量藻液，放入高速離心機(jī)離心10 min。

1.2 指標(biāo)測(cè)試分析與計(jì)算方法

1.2.1 普通小球藻比生長(zhǎng)率計(jì)算

其中Nt為第t天小球藻藻液吸光度；N0為某一時(shí)間間隔開始時(shí)小球藻藻液吸光度；Δt為時(shí)間間隔。

1.2.2 磷濃度測(cè)量

采用磷鉬藍(lán)分光光度法測(cè)量磷濃度。

1.2.3 鹽度測(cè)量

采用?，敼P式鹽度計(jì)測(cè)量海水鹽度。

1.2.4 pH 測(cè)量

采用PHBJ-260 便攜式pH 計(jì)對(duì)藻液的pH 進(jìn)行測(cè)量。

1.2.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)量

采用浮游植物分類熒光儀（PHYTO-PM WALZ）對(duì)葉綠素?zé)晒飧鱾€(gè)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

Fv/Fm代表光合作用的最大光能轉(zhuǎn)化效率，F(xiàn)v/F0代表光合作用潛在活力，ΦPSⅡ代表光合作用實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率。其公式如下：

1.2.6 吸附動(dòng)力學(xué)計(jì)算

準(zhǔn)一級(jí)模型多用來(lái)描述物理吸附過(guò)程，其動(dòng)力學(xué)方程形式為：

準(zhǔn)二級(jí)模型主要用于描述物理和復(fù)雜的化學(xué)吸附過(guò)程，其動(dòng)力學(xué)方程形式為：

式中，qe和qt分別為平衡時(shí)和t時(shí)刻下的吸附率；k1為準(zhǔn)一級(jí)吸附速率常數(shù)；k2為準(zhǔn)二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用origin 2018 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用 SPSS 2.0 進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 為差異顯著。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鹽度對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)的影響

設(shè)置不同鹽度梯度（0、5、10、15、20、25、30、45），取適量藻液稀釋至初始濃度為0.75×106個(gè)/mL，培養(yǎng)于100 mL 三角瓶中，設(shè)置兩個(gè)對(duì)照組，每個(gè)平行樣體積均為50 mL，確保每個(gè)錐形瓶的鹽度與藻初始濃度為設(shè)定值，每天人工定時(shí)搖3次并在波長(zhǎng)為680 nm 下測(cè)量吸光度，計(jì)算其比生長(zhǎng)速率。

1.3.2 鹽度對(duì)普通小球藻吸收磷的影響

設(shè)置不同初始磷濃度（0，5，10，15，20 mg/L），在鹽度為15、30，普通小球藻初始濃度為0.75×106個(gè)/mL，吸附反應(yīng)溫度為25 ℃，pH 為7 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中0、24、48、72、96 h取培養(yǎng)液，0.22 μm 的濾膜過(guò)濾后測(cè)磷的濃度。

1.3.3 鹽度對(duì)普通小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

設(shè)置不同鹽度（0、15、30、45），在普通小球藻初始濃度為0.75×106個(gè)/mL，吸附反應(yīng)溫度為 25 ℃，pH 為7 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中0、24、48、72 h 取培養(yǎng)液，0.22 μm 的濾膜過(guò)濾后測(cè)磷的濃度。

1.3.4 藻密度對(duì)普通小球藻吸收磷的影響

設(shè)定藻液初始濃度OD680＝0.05、0.10、0.15（0.375×106個(gè)/mL、0.750×106個(gè)/mL、1.125×106個(gè)/mL），在磷濃度為5、20mg/L，吸附反應(yīng)溫度為25 ℃，pH 為7 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中0、24、48、72、96 h 取培養(yǎng)液，0.22 μm 的濾膜過(guò)濾后測(cè)磷的濃度。

1.3.5 初始pH 對(duì)普通小球藻吸附磷的影響

設(shè)定pH 值為5、7、9，在藻液初始濃度為0.75×106個(gè)/mL，磷濃度為5、20 mg/L，吸附反應(yīng)溫度為25 ℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中0、24、48、72 h 取培養(yǎng)液，0.22 μm 的濾膜過(guò)濾后測(cè)磷的濃度。

1.3.6 吸附動(dòng)力學(xué)分析

（1）24 h 吸附動(dòng)力學(xué)分析

設(shè)定吸附反應(yīng)條件為：吸附反應(yīng)溫度為25 ℃，藻液初始濃度為0.75×106個(gè)/mL，磷濃度為5、20 mg/L，pH 為7。在此條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在1、2、4、8、12、18、24 h 取培養(yǎng)液，0.22 μm 的濾膜過(guò)濾后測(cè)磷的濃度。

（2）1 h 吸附動(dòng)力學(xué)分析

在之前相同試驗(yàn)條件下，在10、20、40、60 min取培養(yǎng)液，0.22 μm 的濾膜過(guò)濾后測(cè)磷的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通小球藻細(xì)胞密度與吸光度曲線

本試驗(yàn)用血球計(jì)數(shù)板在三目顯微鏡下計(jì)算普通小球藻細(xì)胞數(shù)，用紫外分光光度計(jì)在680 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定普通小球藻藻液吸光度，將藻密度與吸光度值進(jìn)行回歸得線性回歸方程：y＝7.502x-0.003 6，（R2＝0.999 3）[16]。

2.2 鹽度對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)的影響

如圖1 所示，無(wú)鹽度組（0）和高鹽度組（45）小球藻生長(zhǎng)受到明顯的抑制作用，培養(yǎng)四天后會(huì)出現(xiàn)部分小球藻死亡現(xiàn)象，兩試驗(yàn)組之間差異顯著（P＜0.05）。其他鹽度組，小球藻生長(zhǎng)較好，且無(wú)顯著差異（P＞0.05）。經(jīng)過(guò)4 d 培養(yǎng)15 鹽度組小球藻藻液吸光度最高，可達(dá)0.884。

圖1 鹽度對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)的影響

陳貞奮等[17]研究表明小球藻（Chlorella vulgaris Beijerinck）在5～15 鹽度水域生長(zhǎng)最適，適鹽能力較強(qiáng)，張奇等[18]研究發(fā)現(xiàn)小球藻（Chlorella vulgaris）具較廣的適鹽能力，可在0～45 鹽度海水中生長(zhǎng)。對(duì)比本試驗(yàn)結(jié)果，普通小球藻最適生長(zhǎng)鹽度為5～30，較高較低鹽度對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)呈現(xiàn)的抑制作用大同小異。在淡水環(huán)境中，生長(zhǎng)抑制作用更明顯，說(shuō)明經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)，普通小球藻鹽度適應(yīng)能力變強(qiáng)，起到了鹽度馴化的作用。鹽度變化可以破壞藻細(xì)胞內(nèi)外離子平衡，影響其滲透壓從而影響藻細(xì)胞生長(zhǎng)，因此試驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)隨著鹽度升高藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制的現(xiàn)象。

2.3 鹽度對(duì)普通小球藻吸收磷的影響

本試驗(yàn)基于2.2 試驗(yàn)結(jié)論選取培養(yǎng)結(jié)束時(shí)小球藻藻液吸光度最大的鹽度值（15）與原培養(yǎng)基鹽度值（30）做對(duì)照，進(jìn)行磷吸附效率研究。

如圖2 所示，24 h 內(nèi)15 鹽度組在初始磷濃度為5 mg/L 時(shí)吸收速率較其他試驗(yàn)組更快，且差異顯著（p＜0.05），其吸附效率高達(dá)91.80%，48 h時(shí)各濃度組吸附效率均達(dá)到95%以上，此時(shí)基本達(dá)到吸附平衡。兩鹽度組相比，15 鹽度組24 h 內(nèi)對(duì)磷的吸附效率較高，48 h 后30 鹽度組對(duì)磷的吸附效率較高，小球藻對(duì)磷的利用更完全。研究表明，伴隨鹽度升高，不僅小球藻生長(zhǎng)會(huì)受到影響，小球藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽吸收也會(huì)受到抑制[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，短時(shí)間內(nèi)鹽度為15 時(shí)普通小球藻對(duì)磷吸收更快。

圖2 鹽度對(duì)普通小球藻吸收磷的影響

2.4 鹽度對(duì)普通小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響

小球藻潛在活力強(qiáng)可反映其光合作用較強(qiáng)[20]。光合色素是微藻光合作用的有效色素，能較好地反映微藻生長(zhǎng)狀況和光合作用效率[21]。

由圖3、圖4 可知，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，F(xiàn)v/Fm、ΦPSII、Fv/F0顯著升高，48 h 達(dá)到最大值后有略微下降趨勢(shì)，經(jīng)72 h 培養(yǎng)，30 鹽度組Fv/Fm、Fv/F0最強(qiáng)，15鹽度組ΦPSII最高，0 鹽度組各參數(shù)在24 h 內(nèi)明顯提升后呈直線下降趨勢(shì)，隨著鹽度增長(zhǎng)葉綠素a含量呈先升后降趨勢(shì)。

圖3 鹽度對(duì)普通小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

圖4 鹽度對(duì)普通小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響

小球藻生活環(huán)境會(huì)影響其生長(zhǎng)，在受到脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生顯著變化[22]。鹽度脅迫是影響植物光合作用的主要環(huán)境因子之一，目前已有許多關(guān)于鹽度脅迫對(duì)植物光合作用影響的研究。在受脅迫時(shí)，植物Fv/Fm會(huì)降低，所以測(cè)量Fv/Fm成為一種簡(jiǎn)單快速脅迫監(jiān)測(cè)方法，ΦPSⅡ?yàn)楣夂献饔脤?shí)際光能轉(zhuǎn)化效率，可反映電子傳遞情況。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)高過(guò)低鹽度條件下，鹽生杜氏藻PSII 葉綠素?zé)晒鈪?shù)均會(huì)顯著降低。本試驗(yàn)中普通小球藻在高鹽（45）條件下葉綠素?zé)晒鈪?shù)沒(méi)有顯著降低，相反在低鹽（0）條件下，普通小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)顯著降低，說(shuō)明普通小球藻有一定的耐鹽性且不適宜在鹽度較低條件下生長(zhǎng)，這一優(yōu)勢(shì)為其更好的適應(yīng)與調(diào)節(jié)海水水質(zhì)提供了依據(jù)。葉綠素a 與小球藻光合作用密切相關(guān)，可以通過(guò)色素含量來(lái)判斷小球藻生理狀態(tài)[23]，朱新廣等[24]研究表明，鹽度脅迫會(huì)降低葉綠素含量，抑制電子傳遞效率以及光能轉(zhuǎn)化效率，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。

2.5 不同藻密度對(duì)普通小球藻吸收磷的影響

小球藻密度的多少會(huì)影響其對(duì)磷的吸附效能，密度太小，不能有效吸收水體中的磷，密度太大會(huì)造成資源浪費(fèi)，為降低成本，提高利用率，并有效去除水體中多余的磷，本試驗(yàn)探究了藻密度對(duì)小球藻吸附效能的影響。如圖5 所示，在初始磷濃度不同的情況下，培養(yǎng)液中磷濃度變化趨勢(shì)總體是一致的，都呈下降趨勢(shì)，當(dāng)藻液濃度適中（OD680＝0.1），96 h 后磷吸附效率可達(dá)99.49%。

圖5 初始pH 對(duì)普通小球藻吸附磷的影響

JAYAKUMA 等[25]研究顯示，藻濃度到達(dá)一定值時(shí)，吸附效率不會(huì)隨著藻濃度增加而增加。孫輝[26]研究顯示，隨著小球藻密度增加，其對(duì)鎘的吸附效率不斷增大，但吸附量會(huì)減少，較高密度會(huì)導(dǎo)致有效吸附表面積減少。

2.6 初始pH 對(duì)普通小球藻吸附磷的影響

由圖6、圖7 可知，pH 值對(duì)小球藻吸附效率影響不顯著，對(duì)小球藻生長(zhǎng)影響顯著，表現(xiàn)為各pH 組磷吸附效率總體呈下降趨勢(shì)，低pH 值時(shí)小球藻生長(zhǎng)受到明顯抑制作用。經(jīng)過(guò)72 h 培養(yǎng)后，磷濃度可由20.000 mg/L 降至2.359 mg/L，pH＝7試驗(yàn)組小球藻密度可達(dá)到初始密度的6.07 倍。

圖6 初始pH 對(duì)普通小球藻吸附磷的影響

圖7 初始pH 對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)的影響

由表1 可以看出，不管藻液初始pH 為多少，吸附72 h 后pH 值都穩(wěn)定在一個(gè)范圍內(nèi)，初始pH較小組，培養(yǎng)結(jié)束pH 值明顯升高，pH 值較大組，培養(yǎng)結(jié)束pH 值會(huì)減小。張奇等[18]研究表明，在pH 為5.5～11.5 環(huán)境中小球藻都能生長(zhǎng)，且在pH＝9 時(shí)生長(zhǎng)量達(dá)到最大，與本試驗(yàn)結(jié)果吻合，pH 通過(guò)改變普通小球藻滲透壓來(lái)改變其生長(zhǎng)及對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收，在一定范圍內(nèi)隨著pH 增加，普通小球藻生長(zhǎng)加快，可有效提高其對(duì)磷濃度的吸附效率。研究表明，當(dāng)溶液pH 呈酸性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞有機(jī)物流失，不利于其生長(zhǎng)，與本研究結(jié)果偏堿性環(huán)境下更有利于普通小球藻生長(zhǎng)一致。

表1 不同磷濃度下藻液吸附72 h 后pH 值變化情況

2.7 吸附動(dòng)力學(xué)分析

由圖8～圖11 可見，磷初始濃度為5 mg/L，吸附1 h 后，吸附效率達(dá)到61%，2 h 后，吸附效率達(dá)到81%，24 h 后，吸附效率達(dá)99%，與72 h吸附效率相差不大，此階段屬于快速吸附階段；磷初始濃度為20 mg/L 時(shí)，1 h 后吸附效率達(dá)到80%，24 h 后，吸附效率達(dá)83%，吸附效率超過(guò)80%，說(shuō)明經(jīng)過(guò)24 h 吸附已基本達(dá)到吸附平衡。

圖8 24 h 內(nèi)普通小球藻對(duì)磷吸附

圖9 1 h 內(nèi)普通小球藻對(duì)磷吸附

采用準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)、準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合以更好地解釋小球藻對(duì)磷的吸附過(guò)程。由圖10 可以看出磷初始濃度為5 mg/L時(shí)，吸附1 h，R2＝0.999 82。由圖11 可見磷初始濃度為20 mg/L 時(shí)，吸附1 h，R2＝0.999 99，通過(guò)計(jì)算得出小球藻對(duì)磷的吸附更適合準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型[27-28]。

圖10 普通小球藻對(duì)磷吸附動(dòng)力學(xué)曲線

圖11 普通小球藻對(duì)磷吸附動(dòng)力學(xué)曲線

生物吸附通常可分為物理吸附和化學(xué)吸附，兩者可共同作用，要想知道是物理吸附還是化學(xué)吸附，必須對(duì)其進(jìn)行深入分析，通過(guò)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，確定其吸附類型，探討其吸附機(jī)理。正常情況下，藻類生物吸附劑的吸附可以分為三個(gè)階段，第一階段為快速吸附期，這一階段內(nèi)吸附效率較快基本可以達(dá)到吸附平衡，李英敏等[29]研究小球藻對(duì)Cu2+的吸附性能及動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，在吸附起始階段，吸附效率較快。李英敏等[30]還研究表明，小球藻對(duì)鉛吸附10 min內(nèi)可以達(dá)到較大值。李悅[31]研究表明小球藻對(duì)鈾的吸附過(guò)程符合擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，吸附效率前5 min 可達(dá)90%左右，與本試驗(yàn)結(jié)果吸附起始階段24 h 內(nèi)普通小球藻對(duì)磷的吸附效率較高（超過(guò)80%）吻合。

3 結(jié)論

通過(guò)不同鹽度對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)及磷利用率的探究，可得如下結(jié)論，高鹽度（45）和低鹽度（0）對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)均有抑制作用，5～30 鹽度之間普通小球藻能較好生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)鹽度為15，鹽脅迫會(huì)抑制普通小球藻光合作用，降低其光能轉(zhuǎn)化效率，不利于其對(duì)磷吸收；在藻密度為0.75×106個(gè)/mL，pH為7 時(shí)普通小球藻生長(zhǎng)較好，對(duì)磷的吸附效率較高，1 h 內(nèi)為快速吸附期。綜上所述，普通小球藻在鹽度15、pH 為7 和藻密度為0.75×106個(gè)/mL 時(shí)，生長(zhǎng)最快，光合活性最強(qiáng)，且磷吸附效率最高。本試驗(yàn)初步探明了不同鹽度下普通小球藻吸附磷的最佳條件，為利用普通小球藻處理養(yǎng)殖尾水提供了理論依據(jù)。