微波消解-原子熒光法檢測液奶中砷和汞樣品前處理方法探究及應(yīng)用

畢成名，盧智華，李艷紅*，齊 琦，秦曉婷，王英南，李洪梅，王 斌，白曉玲，伊德潤

1 蒙牛乳業(yè)（唐山）有限責(zé)任公司，河北唐山 064000

2 蒙牛乳業(yè)常溫事業(yè)部，內(nèi)蒙古呼和浩特 011500

0 引言

牛奶含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價值，是人類重要的營養(yǎng)物質(zhì)來源之一[1]。近年來更為嚴(yán)峻的環(huán)境污染，飲水和土壤中重金屬元素含量不斷提高[2]，環(huán)境中的金屬元素在食物鏈中不斷積累，牛奶受重金屬元素污染的風(fēng)險急劇增加。人們長期食用被重金屬元素污染的牛奶，在體內(nèi)富集到一定的程度，對人體器官造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害[3]。重金屬元素汞在人體體內(nèi)不斷積累會損害人的神經(jīng)系統(tǒng)，引起聽覺和語言功能障礙[4]；重金屬元素砷在體內(nèi)積累較多時會造成人體的急、慢性中毒，還可能會造成體內(nèi)多種酶和基因產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響體內(nèi)代謝，增加患多種疾病的風(fēng)險[5]。因此，開發(fā)一種大規(guī)模靈敏檢測牛奶中重金屬元素的方法特別重要[6]。

牛奶中檢測重金屬元素的方法有很多，包括中有比色法和試紙法、酶聯(lián)免疫吸附等技術(shù)[7]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[8]、原子熒光法[9]等。其中原子熒光方法由于檢測靈敏度高，檢出限較低，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)符合要求[10]，樣品前處理相對簡單等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用到多種樣品的檢測中[11]。目前原子熒光法樣品前處理主要有沸水浴法和微波消解法，沸水浴消解法由于加熱時間長，整個加熱過程不封閉，可能降低檢測準(zhǔn)確性，對人體健康有一定危害[12]。微波消解法以微波作為熱源將樣品加熱到200 ℃以上，使用更少量的硝酸將樣品消解的更加充分[13]。同時減少了樣品中揮發(fā)性元素的損失，多數(shù)微波消解儀可同時消解大約40 個樣品，時間大概是50 min左右，消解的質(zhì)量和效率滿足大批量檢測的要求[14]。所以目前微波消解-原子熒光法檢測重金屬元素被廣泛應(yīng)用在食品檢測領(lǐng)域[15]。

本文以質(zhì)控樣檢測結(jié)果和加標(biāo)回收率為評價指標(biāo)，優(yōu)化前處理和檢測過程中還原劑硫脲添加量、硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度、氨基磺酸和硝酸的添加量和微波消解溫度等實驗條件，建立適合大批量檢測牛奶中重金屬元素總砷、總汞的方法，并對方法進(jìn)行驗證和應(yīng)用，為保障食用無污染的、健康的牛奶提供強(qiáng)有力的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛奶（產(chǎn)自內(nèi)蒙古呼和浩特）；硝酸、過氧化氫、氨基磺酸、鹽酸、硫脲、氫氧化鈉、硼氫化鈉均為分析純 上海麥克林生化科技股份有限公司；砷汞標(biāo)準(zhǔn)液 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

AFS-933原子熒光北京吉天儀器有限公司；TOPEX+全能型微波化學(xué)工作平臺；移液器賽默飛世爾科技（中國）有限公司； ME204E電子分析天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；實驗用水按照GB/T6682規(guī)定的一級實驗用水。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

參考王曉蘭[16]的操作方法并進(jìn)行優(yōu)化，稱取0.8 g液態(tài)牛奶試樣于消解管中，加入一定體積的硝酸，2 mL過氧化氫，震蕩混合均勻，放置于微波消解儀中消解，消解完畢后冷卻至室溫，消解管中緩慢加入一定量的氨基磺酸溶液中和硝酸，冷卻至室溫后用5%的鹽酸溶液轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶中，加入2.5 mL硫脲溶液用5%的鹽酸定容，混勻，至少放置30 min后，再上機(jī)進(jìn)行檢測。

1.2.2 試劑的配制

（1）混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

將100 0 μg/mL的砷和汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別稀釋到10 μg/mL和1 μg/mL，分別吸取0.25 mL定容于25 mL容量瓶中作為標(biāo)準(zhǔn)中間液；分別吸取0.0 mL 、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液于6 個容量瓶中，加一定體積的還原劑硫脲溶液，用5%的鹽酸定容至25 mL，混勻后靜置反應(yīng)30 min后上機(jī)測定。

（2）試劑及儀器載流液的配制

氨基磺酸（100 g/L）：精確稱取10.0 g氨基磺酸，用一級水溶解并定容至100 mL。

硫脲溶液（50 g/L）：精確稱取5g硫脲用一級水溶解并定容至100 mL。

鹽酸（5%）：量取50 mL鹽酸用一級水定容至100 0 mL。

氫氧化鈉溶液（3 g/L）：精確稱取3.0 g氫氧化鈉，用一級水溶解并定容至100 0 mL。

硼氫化鈉溶液（10～20 g/L）：稱取10～20 g硼氫化鈉，用3 g/L的氫氧化鈉溶液定容至1 000 mL。

重鉻酸鉀的硝酸溶液（0.5 g/L）：稱取0.5 g重鉻酸鉀，用硝酸溶液（5+95）溶解并定容至1 000 mL，混勻備用。

（3） 測定儀器條件

砷光電倍增管負(fù)高壓240 V，砷燈電流60 mA；汞光電倍增管負(fù)高壓240 V，汞燈電流30 mA；原子化器高度：10 mm，氬氣流速：載氣300 mL/min，屏蔽氣：800 mL/min，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法的測量方式。

1.2.3 結(jié)果計算

試樣檢測后，總砷和總汞含量按照以下公式計算：

式中：

X：總砷或總汞含量（mg/kg）；

C1：待測溶液濃度（ng/mL）；

C0：空白溶液濃度（ng/mL）；

m：樣品質(zhì)量（g）；

V：試樣消化液體積（mL）；

1.2.4 單因素與正交實驗設(shè)計

（1）單因素實驗設(shè)計設(shè)置固定的反應(yīng)條件。硫脲的添加量為2.5 mL，氫氧化鈉濃度為3 g/L，硫脲的添加量為2.5 mL，硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度為15 g/mL，氨基磺酸的添加量為2.5 mL，硝酸的添加量為5 mL，微波消解最高溫度保持時間為20 min。以質(zhì)控樣檢測結(jié)果和加標(biāo)回收率為評價指標(biāo)，分別以還原劑硫脲添加量（40、50、60、70、80 g/L），硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度（10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 g/L），氨基磺酸添加量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL）,硝酸添加量(3、4、5、6、7 mL)，微波消解溫度（180、185、190、195、200℃）等五個因素進(jìn)行單因素實驗。

（2）正交實驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取硫脲的濃度（A）、硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度（B）、硝酸添加量（C）、微波消解溫度（D），進(jìn)行四因素三水平正交實驗，優(yōu)化微波消解-原子熒光法測定牛奶中重金屬元素砷和汞的最佳條件，正交因素水平表見表1。

表1 正交因素水平表

1.2.5 方法驗證

采用繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算相關(guān)系數(shù)是否符合要求；通過重現(xiàn)性實驗，將同一樣本平行進(jìn)樣6 次，計算檢測數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差；通過精密度實驗，將6 個樣本處于同一實驗條件進(jìn)樣6 次，計算數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

對按照該實驗條件檢測的質(zhì)控樣本和加標(biāo)回收率過去一個季度的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在偏差允許的情況下，通過計算加標(biāo)回收率和質(zhì)控樣本的檢測數(shù)據(jù)驗證檢測方法的準(zhǔn)確性。

1.2.6 牛奶樣本檢測

按照該方法分析過去半年檢測的牛奶樣本，對整體數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，評價檢測方法的快捷性、簡便性和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 硫脲的濃度結(jié)果分析

硫脲是具有強(qiáng)還原作用的還原劑，可以將消解后樣品中的五價砷還原為三價砷[17]。由圖1可知，硫脲在40～70 g/L濃度下，采用微波消解-原子熒光法檢測重金屬元素，總汞的加標(biāo)回收率變化不顯著（P＞0.05），總汞回收率為93.4%～97.1%，硫脲對汞的加標(biāo)回收率幾乎沒影響。在牛奶樣品中總砷加標(biāo)回收率顯著升高（P＜0.05），砷回收率從76.1%升高到109.3%，當(dāng)硫脲濃度較低時不能全部還原五價砷；濃度升高時，砷被還原的更多，加標(biāo)回收率顯著升高（P＜0.05），在50 g/L時砷的加標(biāo)回收率升高到97.2%；當(dāng)濃度繼續(xù)增加時，砷的回收率超過100%，表明硫脲的濃度對砷加標(biāo)回收率影響較大；綜合考慮節(jié)約試劑和實驗效果，回收率接近100%，選擇硫脲濃度為50 g/L進(jìn)行實驗。

圖1 硫脲濃度對砷和汞加標(biāo)回收率的影響

2.1.2 硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度結(jié)果分析

硼氫化鉀-氫氧化鉀是強(qiáng)還原劑，使三價砷和汞還原生成砷化氫和原子態(tài)汞，由氬氣運(yùn)載到石英原子化器中，通過特質(zhì)的砷和汞空心陰極燈的發(fā)射光激發(fā)下產(chǎn)生原子熒光，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較計算[18]。由圖2可知，硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度在10～20 g/L的條件下，砷和汞的加標(biāo)回收率呈先上升再下降的趨勢，當(dāng)濃度較低時，三價砷和汞未能全部轉(zhuǎn)化為砷化氫和原子態(tài)汞，導(dǎo)致檢測值較低，當(dāng)還原劑濃度繼續(xù)升高時，砷和汞的加標(biāo)回收率顯著升高（P＜0.05）；濃度為15.0 g/L時，砷的回收率為96.1%，汞的回收率為99.6%，當(dāng)還原劑的濃度繼續(xù)升高時，砷和汞的加標(biāo)回收率呈現(xiàn)下降趨勢，可能是還原劑濃度較高，在上機(jī)器檢測時反應(yīng)特別劇烈，使反應(yīng)后的溶液有少部分噴出，進(jìn)而使三價砷和原子態(tài)汞產(chǎn)生的原子熒光較低，導(dǎo)致回收率降低[19]。表明硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度對砷和汞的加標(biāo)回收率影響較大，綜合分析檢測時反應(yīng)的劇烈程度和回收率的大小，反應(yīng)劇烈容易造成機(jī)器堵塞，增加設(shè)備維護(hù)成本，選擇硼氫化鉀-氫氧化鉀濃度為15.0 g/L進(jìn)行實驗。

圖2 硼氫化鉀-氫氧化鉀濃度對砷和汞加標(biāo)回收率的影響

2.1.3 氨基磺酸添加量結(jié)果分析

氨基磺酸主要中和前期加入的硝酸溶液，去除硝酸根離子、亞硝酸根離子和揮發(fā)性氮氧化物產(chǎn)生二氧化氮和氮氣，防止硝酸與硫脲反應(yīng)生成氫氣，進(jìn)而消耗原子態(tài)汞生成汞化氫，同時避免五價砷不能充分被還原為三價砷[20]。由圖3可知，在氨基磺酸添加量在1.5～3.5 mL時，總砷和總汞的加標(biāo)回收率先顯著上升（P＜0.05），在氨基磺酸添加量在2.5 mL時，總砷的加標(biāo)回收率達(dá)到95.6%，總汞的加標(biāo)回收達(dá)到99.4%，氨基磺酸添加量繼續(xù)增大，總砷和總汞的加標(biāo)回收率變化不顯著（P＞0.05），可能是因為氨基磺酸添加量為2.5 mL時正好中和硝酸，避免了硝酸與硫脲反應(yīng)，對砷和汞的加標(biāo)回收率產(chǎn)生影響[21]。表明氨基磺酸添加量為2.5 mL時中和硝酸效果較好，繼續(xù)增大添加量對回收率影響不顯著（P＞0.05），所以在后續(xù)正交實驗對該因素不再進(jìn)行深入研究，選擇氨基磺酸添加量為2.5 mL進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖3 氨基磺酸添加量對砷和汞加標(biāo)回收率的影響

2.1.4 硝酸添加量結(jié)果分析

硝酸是強(qiáng)氧化劑可以消解大多數(shù)無機(jī)樣品和容易消解的有機(jī)樣品，是最常用的消解試劑[22]，通常與雙氧水配合使用，提高消解效率。由圖4可知，當(dāng)硝酸的添加量在3～5 mL范圍時，隨著硝酸添加量不斷增加，樣品消解越充分，砷和汞的加標(biāo)回收率顯著升高（P＜0.05）。當(dāng)硝酸添加量為5 mL時，砷的加標(biāo)回收率為97.6%，汞的加標(biāo)回收率為99.8%，回收率接近100%，表明樣品消解的充分。當(dāng)硝酸的添加量繼續(xù)增大時，砷和汞的加標(biāo)回收率變化不顯著（P＞0.05）。綜合考慮到消解效果和過量硝酸對實驗的影響，選擇硝酸添加量為5 mL。

圖4 硝酸添加量對砷和汞加標(biāo)回收率的影響

2.1.5 微波消解溫度結(jié)果分析

微波消解是應(yīng)用比較廣泛的一種消解方式，消解溫度可達(dá)200 ℃，消解效率比較高。由圖5所示，微波消解溫度在180～195 ℃范圍內(nèi)，隨著消解溫度的不斷升高，樣品消解更加充分，汞的加標(biāo)回收率顯著升高（P＜0.05），在消解溫度為195 ℃時，砷的加標(biāo)回收率為99.1 %，汞的加標(biāo)回收率為99.8 %。隨著消解溫度繼續(xù)增加，砷和汞的加標(biāo)回收率變化不顯著（P＞0.05），表明微波消解溫度在195 ℃時樣品消解充分，不用再提高消解溫度。綜合考慮消解溫度提高后，消解管的壓力增加較大，耗能增加[23]，所以選擇消解溫度為195 ℃繼續(xù)實驗。

圖5 微波消解溫度對砷和汞加標(biāo)回收率的影響

2.2 正交實驗結(jié)果分析

2.2.1 正交實驗設(shè)計與結(jié)果分析

正交實驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示，影響總砷加標(biāo)回收率因素主次順序為：C、A、B、D，實驗組A1B2C2D2的回收率最高為99.3%，理論最優(yōu)組合是A2B2C2D2。影響總汞加標(biāo)回收率因素主次順序為B、C、A、D，實驗組A2B2C3D1的回收率最高為98.7%，理論最優(yōu)組合為A2B2C2D2。總砷和總汞加標(biāo)回收率實驗組最優(yōu)組和理論最優(yōu)組回收率不同，需要進(jìn)行驗證性實驗。

表2 正交實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限的實驗結(jié)果

2.2.2 驗證性實驗結(jié)果分析

通過正交實驗結(jié)果分析，對A2B2C2D2進(jìn)行驗證性實驗，重復(fù)三次。總砷加標(biāo)回收率為99.8%±0.8%，比實驗組A1B2C2D2的回收率更加接近100%，以A2B2C2D2為最佳實驗條件。總汞加標(biāo)回收率為99.6%±1.1%，回收率比實驗組A2B2C3D1更加接近100%，以A2B2C2D2為最佳實驗條件。所以檢測砷和汞加標(biāo)回收率的最佳實驗條件為：硫脲的濃度為50 g/L、硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度為15 g/L、硝酸添加量為5 mL、微波消解溫度為195 ℃。

2.3 方法驗證實驗結(jié)果分析

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程結(jié)果分析

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行方法驗證，砷和汞的標(biāo)準(zhǔn)曲線為分別配置濃度為0、2、4、6、8、10 ng/mL的砷標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液和濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ng/mL的汞標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液，按照最優(yōu)實驗條件進(jìn)行檢測。砷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=80.71X-9.43，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，線性范圍是0～10 ng/mL，檢出限和定量限分別為0.01 mg/kg、0.04 mg/kg。汞的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=929.74X-7.55，相關(guān)系數(shù)為0.999 2，線性范圍是0～1 ng/mL，檢出限和定量限分別為0.003 mg/kg、0.01 mg/kg。經(jīng)分析砷和汞的標(biāo)注曲線方程滿足后續(xù)實驗相關(guān)要求。

2.3.2 重現(xiàn)性實驗結(jié)果分析

取牛奶樣品分別經(jīng)前處理后進(jìn)行檢測。樣品中砷和汞的含量并計算相對應(yīng)的平均值和RSD。結(jié)果如表4所示，樣品中砷和汞的加標(biāo)回收率平均值和RSD值分別為99.39%、0.11%，98.81%、0.18%。砷質(zhì)控樣本濃度為0.145 mg/kg，檢測結(jié)果平均值為0.147 mg/kg，RSD為3.8，表明采用該方法檢測砷質(zhì)控樣數(shù)據(jù)符合要求；汞質(zhì)控樣本濃度為0.044 6 mg/kg，檢測結(jié)果平均值為0.043 8 mg/kg，RSD為4.29，表明采用該方法檢測汞質(zhì)控樣數(shù)據(jù)符合要求。通過檢測加標(biāo)回收和質(zhì)控樣本數(shù)據(jù)均符合要求，表明該方法可以用于檢測牛奶中砷和汞。

表4 重金屬元素質(zhì)控和加標(biāo)回收率樣本的重現(xiàn)性實驗結(jié)果

2.3.3 精密度實驗結(jié)果分析

采用同樣的方法分別進(jìn)行6次實驗，計算數(shù)據(jù)的平均值和RSD。結(jié)果如表5所示，樣品中砷的加標(biāo)回收率、質(zhì)控檢測平均值和RSD值分別為99.35%、0.59，0.205 mg/kg、3.28。砷采用的質(zhì)控樣本濃度為0.197 mg/kg，質(zhì)控樣檢測值符合準(zhǔn)確性要求，表明可以使用該方法檢測牛奶中重金屬砷。汞采用的質(zhì)控樣本濃度為0.057 3 mg/kg，采用此方法質(zhì)控樣檢測值為0.056 8 mg/kg，標(biāo)注偏差符合實驗要求，表明可以采用此方法同時檢測牛奶中重金屬元素砷和汞。

表5 重金屬元素質(zhì)控和加標(biāo)回收率樣本精密度的實驗結(jié)果

2.3.4 加標(biāo)回收率和質(zhì)控樣本實驗結(jié)果分析

采用此方法對樣品檢測過程中，每周做一次加標(biāo)回收率和質(zhì)控樣本檢測判斷該方法的準(zhǔn)確性，對最近一個季度的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如表6所示，砷和汞分別做了12次加標(biāo)回收率檢測，平均值分別為98.84%、99.23%，RSD分別為1.91、1.01，回收率和RSD均符合數(shù)據(jù)分析要求。砷和汞進(jìn)行了兩個濃度的質(zhì)控樣本檢測各12次，砷的質(zhì)控樣本濃度分別為0.145 mg/kg、0.197 mg/kg，采用此方法的檢測平均值分別為0.146 mg/kg、0.204 mg/kg，RSD分別為3.80、3.71，經(jīng)過檢測質(zhì)控樣本說明此方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。汞的質(zhì)控樣本濃度分別為0.044 6 mg/kg、0.057 3 mg/kg，檢測值為0.044 5 mg/kg、0.056 5 mg/kg，RSD分別為2.79、3.05，砷檢測值偏差符合質(zhì)控要求，表明可以應(yīng)用此方法檢測牛奶樣本中的重金屬元素砷和汞。

表7 牛奶砷汞檢測結(jié)果

2.4 牛奶樣本檢測結(jié)果分析

采用此方法檢測牛奶中重金屬元素砷和汞，對過去6個月的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如圖6所示，6個月共檢測樣品5 098個，砷檢測值超過檢出限的有34個，第四個月份時檢出最多為9 個，檢出率為1.07%，最低的為3月檢出2 個，檢出率為0.23%。汞共檢出26個，3月的檢出率最高為1.04%，4月的檢出率最低為0.12%。通過本實驗采用的6個月份實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，表明這些批次牛奶重金屬元素砷和汞檢出率較低，奶源受污染的概率較低。此檢測方法的優(yōu)化為嚴(yán)格控制市場奶源重金屬污染貢獻(xiàn)力量。

圖6 砷和汞標(biāo)準(zhǔn)曲線方程擬合結(jié)果（A）砷、（B）汞

3 結(jié)論

通過對原劑硫脲的濃度、硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度，氨基磺酸的添加量,硝酸的添加量、微波消解溫度等前處理和上機(jī)條件做單因素和正交實驗優(yōu)化，成功建立了同時快速準(zhǔn)確檢測牛奶中重金屬元素砷和汞的檢測方法。在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)大于0.999，質(zhì)控和回收率檢測結(jié)果精密度、準(zhǔn)確度符合要求，方法檢出限和定量想滿足日常檢測要求。為加大牛奶中重金屬元素砷和汞的監(jiān)管奠定基礎(chǔ)，為一線重金屬相關(guān)檢驗人員提供方法參考。