蠟梅花藥材UPLC特征圖譜及黃酮類成分含量測定研究

鐘春琳，何嘉瑩，邱韻靜，林晗，潘禮業(yè)，梁永新，李國衛(wèi)，蘭小勇，陳向東

（廣東一方制藥有限公司廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528200）

蠟梅花收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準：中藥材第1 冊[1]、《江蘇省中藥材標準》[2]和湖北省中藥材質(zhì)量標準[3]，標準規(guī)定蠟梅花為蠟梅科植物蠟梅Chimonanthus praecox（L.）Link 的干燥花蕾。1~3 月采摘，曬干或烘干。具有解暑生津的功效，常用于熱病煩渴、胸悶、咳嗽。蠟梅花的化學(xué)成分主要包含有龍腦、桉油精、洋蠟梅堿、蠟梅苷、亞油酸、油酸等揮發(fā)性成分，也含有生物堿、黃酮類、香豆素類、甾體類等成分；葉中含有蠟梅堿、氫氰酸等成分[4]。研究表明蠟梅花黃酮類成分具有抗氧化活性[5]?，F(xiàn)行標準中，《湖北省中藥材質(zhì)量標準（2018 年版）》僅收載了其顯微鑒別、薄層鑒別，《江蘇省中藥材標準（2016 年版）》收載了其顯微鑒別、薄層鑒別、蘆丁和槲皮素質(zhì)量分數(shù)測定項。有相關(guān)研究也報道了其蘆丁的質(zhì)量分數(shù)測定方法[6]和槲皮素質(zhì)量分數(shù)測定方法[7]，但采用的是高效液相色譜法，分析時間較長，且不能同時測定蘆丁和槲皮素質(zhì)量分數(shù)。由于中藥有效成分具有多樣性及復(fù)雜性，單純地檢測某一成分缺乏一定的專屬性，同時對中藥材質(zhì)量的評價稍顯偏頗。特征圖譜作為控制中藥質(zhì)量的鑒別手段，結(jié)合多指標成分定量分析，不但可鑒別產(chǎn)品真?zhèn)危铱煽刂浦饕卣鞣宓馁|(zhì)量分數(shù)，是全面控制中藥質(zhì)量的可行模式[8]。目前尚無文獻報道蠟梅花特征圖譜或指紋圖譜的研究。

本研究采用UPLC 法建立蠟梅花藥材的特征圖譜，同時測定黃酮類成分蘆丁和槲皮素的質(zhì)量分數(shù)，可綜合控制和評價蠟梅花藥材的質(zhì)量。

1 儀器與材料

Thermo Vanquish 型超高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Waters Cortecs T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）色譜柱；Mettler XP-26型百萬分之一天平，ME204E 型萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 型超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；水為Mili-Q 超純水；其余試劑為分析純。蘆?。ㄅ枺?00080-202012，質(zhì)量分數(shù)91.6%）、槲皮素（批號：100081-201610，質(zhì)量分數(shù)99.1%）、山柰酚（批號：110861-202013，質(zhì)量分數(shù)93.2%）對照品由中國食品藥品檢定研究院提供；17 批藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定，為蠟梅科植物蠟梅Chimonanthus praecox（L.）Link 的干燥花蕾，來源見表1。

表1 17批蠟梅花藥材的來源信息Table 1 Origins of 17 batches of Chimonanthus praecox Flower

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters Cortecs T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）色譜柱，流速為0.3 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為1 μL，檢測波長為355 nm；以甲醇（A）-0.2%磷酸（B）為流動相，梯度洗脫（0~3 min，25%A→25%A；3~4 min，25%A→27%A；4~13 min，27%A→29%A；13~14 min，29%A→36%A；14~30 min，36%A→42%A）。

2.2 對照品溶液的制備

分別取蘆丁、槲皮素、山柰酚對照品適量，精密稱定，加60%（體積分數(shù)，下同）甲醇分別制成質(zhì)量分數(shù)為99.11、59.71、21.08 μg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

本品粉末（過3號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 特征圖譜的建立及評價

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（S1），按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6 次，以蘆丁為參照峰，計算5 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（S1），按“2.1”項下的色譜條件，分別于0、2、6、8、10、12、18、24 h 進樣測定，以蘆丁為參照峰，計算5 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 樣品粉末約0.5 g（S1），平行6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，以蘆丁為參照峰，計算5 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 耐用性試驗 采用33~37 ℃柱溫、0.28~0.32 mL/min 流速對特征圖譜中5 個特征峰的分離度、相對保留時間和相對峰面積進行考察，發(fā)現(xiàn)影響均不大，表明耐用性良好?？疾炝薟aters Cortecs T3（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱對特征圖譜的影響，發(fā)現(xiàn)Agilent ZORBAX SB-C18和Waters Cortecs T3 色譜柱對5 個共有峰分離度較好，峰分布均勻。

2.4.5 特征圖譜分析與評價

2.4.5.1 特征圖譜的建立 精密稱取17 批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。將17 批藥材特征圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.0 版）”中，選擇S1 蠟梅花的色譜圖作為參照圖譜，以平均數(shù)法作為對照圖譜生成方式，設(shè)定時間窗寬度為0.1 min，多點校正后，在全譜峰匹配模式下生成5 個共有峰，并生成對照圖譜R，見圖1。

圖1 17批蠟梅花特征圖譜和對照圖譜疊加圖Figure 1 Superimposed chromatograms of characteristic chromatograms and control chromatograms of 17 batches of Chimonanthus praecox Flower

根據(jù)對照品指認，確定了蠟梅花特征圖譜中峰2、4、5 分別為蘆丁、槲皮素、山柰酚。見圖2。

圖2 蠟梅花特征圖譜和對照品HPLC圖Figure 2 Characteristic chromatogram of Chimonanthus praecox Flower and HPLC chromatograms of reference substance

2.4.5.2 相似度評價 在“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.0 版）”中，系統(tǒng)根據(jù)各批次樣品色譜圖的共有模式生成對照圖譜R，計算出S1~S17 蠟梅花藥材特征圖譜與對照圖譜R 的相似度，各批次藥材與對照圖譜之間的相似度均大于0.90，表明各批次藥材的相似度良好。見表2。

表2 17批蠟梅花藥材的相似度測定數(shù)據(jù)Table 2 Similarity measurement data of 17 batches of Chimonanthus praecox Flower

2.5 含量測定

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取5 份質(zhì)量濃度為495.5 μg/mL 的蘆丁對照品儲備液1 mL，分別置2、5、10、20、50 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，分別制成每1 mL 含蘆丁247.8、99.11、49.55、24.78、9.911 μg 的蘆丁對照品溶液。分別精密量取5 份質(zhì)量濃度為306.417 μg/mL 的槲皮素對照品儲備液1 mL，分別置2、5、10、25、50 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，分別制成每1 mL 含槲皮素153.2、61.28、30.64、12.26、6.128 μg 的對照品溶液。分別精密吸取蘆丁對照品儲備液、上述5 種不同質(zhì)量濃度的對照品溶液1 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（x），建立線性回歸方程。得到蘆丁標準曲線為y1=0.093 2x1-0.055 5，r1=0.999 9；槲皮素標準曲線為y2=0.179 9x2-0.313 3，r2=1.000 0，蘆丁、槲皮素分別在9.911~495.5、6.128~306.4 μg/mL 范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗 取同一份供試品溶液（批號：S1），按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄色譜圖。測得蘆丁和槲皮素峰面積RSD 值分別為0.30%、1.15%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液（批號：S1），在室溫下于配置后0、2、4、6、8、12、18、24 h 分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，測得蘆丁和槲皮素峰面積RSD 值分別為0.11%、0.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗 精密稱取供試品（批號：S1）適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，測得蘆丁和槲皮素質(zhì)量分數(shù)RSD 值分別為1.59%、0.63%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 分別稱取蘆丁、槲皮素對照品27.975、14.911 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶液制成每1 mL 含蘆丁2.563 mg、槲皮素1.478 mg的對照品儲備液。精密吸取上述儲備液1 mL 于具塞錐形瓶中，平行操作6 份，揮干溶劑；再分別取蠟梅花藥材粉末（批號：S1）適量，分別取約0.25 g置于上述6 個錐形瓶中，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄蘆丁和槲皮素的峰面積，計算蘆丁和槲皮素加樣回收率，結(jié)果見表3、4，表明方法加樣回收率良好。

表3 蠟梅花蘆丁加樣回收率試驗結(jié)果Table 3 The results of rutin accuracy of Chimonanthus praecox Flower(n=6)

表4 蠟梅花槲皮素加樣回收率試驗結(jié)果Table 4 The results of quercetin accuracy of Chimonanthus praecox Flower(n=6)

2.5.6 樣品測定 分別取17 批蠟梅花藥材適量，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結(jié)果見表5。

表5 17批蠟梅花中2種成分的質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果Table 5 Results of mass fraction determination of 2 components in 17 batches of Chimonanthus praecox Flower(n=2) w/(mg·g-1)

2.5.7 聚類分析 以17批蠟梅花樣品蘆丁和槲皮素質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果為變量導(dǎo)入SPSS 22.0 軟件進行系統(tǒng)聚類，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以余弦距離作為樣品相似度的距離公式，結(jié)果見圖3。同一產(chǎn)地不能聚為一類，說明蘆丁和槲皮素質(zhì)量分數(shù)與產(chǎn)地相關(guān)性不大。

圖3 17批藥材樣品聚類分析結(jié)果Figure 3 Cluster analysis results of 17 batches of samples

3 討論

本研究建立了蠟梅花藥材的UPLC 特征圖譜，分析時間短、分離度良好、基線平穩(wěn)，標定共有峰5個，指認峰2、4、5分別為蘆丁、槲皮素、山柰酚。各批次藥材與對照圖譜R之間的相似度均大于0.90。

現(xiàn)代藥理研究認為，蠟梅花的主要活性成分為黃酮類成分，其中蘆丁、槲皮素和山柰酚為蠟梅花中質(zhì)量分數(shù)較高的黃酮類成分，具有抗氧化、抗抑郁及保護受損器官等作用[9-10]。本法基于特征圖譜信息量豐富，選擇測定波長為355 nm，且蠟梅花中山柰酚原型成分質(zhì)量分數(shù)較低、響應(yīng)低，與蘆丁和槲皮素質(zhì)量分數(shù)差異較大，不宜采用同法測定，故本研究僅測定蘆丁和槲皮素質(zhì)量分數(shù)。17批不同產(chǎn)地蠟梅花藥材中蘆丁、槲皮素質(zhì)量分數(shù)均值分別為12.21、4.07 mg/g，根據(jù)聚類分析結(jié)果，同一產(chǎn)地不能聚為一類，說明蠟梅花藥材黃酮類成分（蘆丁和槲皮素）質(zhì)量分數(shù)與產(chǎn)地相關(guān)性不大。目前已有文獻報道測定蠟梅花中蘆丁的質(zhì)量分數(shù)均值為2.37 mg/g[6]，與本研究測定結(jié)果差異較大，可能原因為文獻研究藥材為素心蠟梅Chimonanthus praecox（L.）Link var. Concolor Makino，而本文研究藥材為蠟梅Chimonanthus praecox（L.）Link。還有文獻報道[7]測定云南產(chǎn)3 批蠟梅花中槲皮素質(zhì)量分數(shù)均值為0.36 mg/g，研究樣品數(shù)量較少，代表性不足。而本研究采用UPLC 法測定蠟梅花藥材特征圖譜，同時測定17批不同產(chǎn)地樣品中蘆丁和槲皮素質(zhì)量分數(shù)，為蠟梅花藥材的采購和質(zhì)量評價提供了參考。