基于標(biāo)準(zhǔn)湯劑的海金沙草配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

魏家保，唐雙燕，趙偉志，黃凱偉，蔡素琴，張輝，譚沛

（華潤三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000/華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518000）

海金沙草為海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum（Thunb.）Sw. 及小葉海金沙Lygodium microphyllum（Cav.）R.Br.的干燥地上部分。收載于《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2011 年版）中，具有清熱解毒、利水通淋的功效[1]，主產(chǎn)于廣東、浙江、湖南、四川、重慶、廣西、福建等地[2-3]。海金沙草中的化學(xué)成分主要有酚酸類和苯丙素類、黃酮類、三萜類、揮發(fā)油類以及脂肪酸類成分[4-6]。研究表明海金沙草具有利膽、降血糖、防治尿結(jié)石、抗氧化、抗菌、抗病毒和抗雄性激素等作用[7-9]。

中藥配方顆粒是以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為基準(zhǔn)，采用現(xiàn)代方法經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成，既符合傳統(tǒng)中醫(yī)辨證論治的要求，又具備質(zhì)量穩(wěn)定、攜帶方便、衛(wèi)生可靠等優(yōu)勢[10-12]，在臨床被越來越廣泛使用。為保障中藥配方顆粒臨床用藥與傳統(tǒng)湯劑的一致性，在《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》中，將標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為橋接，評價及控制中藥配方顆粒的質(zhì)量。近年來，對海金沙草的研究多限于成分研究[13-14]、含量測定[15-17]等，關(guān)于特征圖譜及薄層的研究甚少[18]，更無海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)報(bào)道。故本研究以市售5 個主產(chǎn)地18 批海金沙草飲片為材料，遵循標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法，計(jì)算出膏率，并以咖啡酸為指標(biāo)成分，考察其在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的轉(zhuǎn)移率，同時建立了標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜分析方法及薄層色譜法（TLC）鑒別方法，為建立海金沙草配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Thermo Ultimate 3000 色譜系統(tǒng)，包括LPG-3400SDN 型四元梯度輸液泵、WPS-3000SL 型自動進(jìn)樣器、TCC-3000SD 型色譜柱溫箱、DAD-3000 型二極管陣列紫外檢測器、Chromeleon 7 色譜管理系統(tǒng)（賽默飛世爾科技有限公司）；ME36S 百萬分之一天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；XS204十萬分之一天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；SK5200H 超聲波儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；薄層自動成像儀（TLC visualizer2）、展開缸、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥

海金沙草對照藥材（批號：280067-202103）購于上海鴻永生物科技有限公司；對照品咖啡酸（批號：110885-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.7%）、原兒茶酸（批號：110809-202207，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：97.5%）、4-香豆酸（批號：112037-202102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.7%）、異槲皮苷（批號：111809-202205，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：96.3%）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號：112007-202103，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：94.0%）、蒙花苷（批號：111528-202213，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：94.6%）均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水；三氯甲烷、甲酸、甲醇、正丁醇等其他試劑均為分析純。

1.3 樣品及制備方法

18 批海金沙草藥材分別來源于四川宜賓縣、重慶合川區(qū)、江西泰和縣、廣東湛江遂溪縣以及廣西來賓合山市。經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定為海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.的干燥地上部分。詳細(xì)信息見表1。

表1 18批海金沙草藥材信息及編號Table 1 Sample information and number of 18 batches of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw

本研究根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》[19]制備海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的標(biāo)準(zhǔn)制備海金沙草配方顆粒。

海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法：取海金沙草飲片100 g，加12 倍水，浸泡30 min，采用砂鍋先武火煮沸，再文火煎煮30 min，200 目濾布趁熱濾過，藥渣再加10 倍水，先武火煮沸，再文火煎煮25 min，200目濾布趁熱濾過，合并濾液；減壓濃縮（60°C）成浸膏，冷凍干燥，即得標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。

海金沙草配方顆粒制備方法：取海金沙草飲片7 500 g，加12 倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，再文火煎煮30 min，200目濾布過濾；藥渣再加10倍量水煎煮25 min，合并2 次濾液，經(jīng)70 ℃減壓濃縮為相對密度1.02~1.10 g/mL 的流浸膏，噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)溫度：150~210 ℃，出風(fēng)溫度：70~115 ℃），加麥芽糊精至1 000 g，混勻，制粒，即得海金沙草配方顆粒（每1 g配方顆粒相當(dāng)于7.5 g飲片）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDBC18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為甲醇∶乙腈∶0.2%磷酸溶液（6∶6∶88），檢測波長為320 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，理論板數(shù)按咖啡酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.1.2 對照品溶液的制備 取咖啡酸對照品適量，精密稱定，加50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取海金沙草飲片粉末（過3 號篩）1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

取海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率350 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 含量測定方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的對照品溶液、“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液及陰性樣品（空白溶劑）溶液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件依法進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，待測成分咖啡酸與相鄰成分達(dá)到基線分離，陰性樣品無干擾。

圖1 海金沙草飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒中咖啡酸測定的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of caffeic acid determination in decoction pieces，standard decoction and formula granules of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.

2.1.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一份海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（批號：BT01），重復(fù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果顯示咖啡酸峰面積RSD為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑（批號：BT01），制備6 份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果顯示，咖啡酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.74 mg/g，RSD為1.5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（批號：BT01），配制后在第0、2、6、10、12、18、24 h 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，咖啡酸峰面積的RSD 值為1.4%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.5 線性關(guān)系考察 精密稱取咖啡酸對照品10.360 mg，置25 mL 容量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL 含咖啡酸413.157 μg 的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0.5、1、2、2.5、5、10 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，制得咖啡酸質(zhì)量濃度分別為2.066、4.132、8.263、10.329、20.658、41.316 μg/mL 的系列對照品溶液，進(jìn)樣測定，記錄各濃度的色譜峰面積。以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=5.288 261×104X-8.935 719×104，R2=0.999。結(jié)果表明咖啡酸對照品在2.066~41.316 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4.6 加樣回收率考察 分別精密稱取咖啡酸對照品1.911、3.612、5.621 mg，置3 個25 mL 量瓶中，加50% 甲醇制成每1 mL 含咖啡酸0.076、0.144、0.224 mg的對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液1 mL，分別置于100 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，制得咖啡酸質(zhì)量濃度分別為0.000 76、0.001 44、0.002 24 mg/mL的系列對照品溶液。取海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑（批號：BT01）約0.05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行操作9份，每份分別精密加入25 mL 上述對照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備9份供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示，咖啡酸的平均加樣回收率分別為100.1%、98.9%、99.4%，結(jié)果見表2，表明回收率良好。

表2 海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The caffeic acid of recovery rate of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

2.1.5 樣品的測定 按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，測定18 批海金沙草飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑以及3 批配方顆粒中的咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸轉(zhuǎn)移率按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Wa 為標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，X為飲片出膏率（標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉質(zhì)量占飲片投入量比例計(jì)算），Wb 為飲片中咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。配方顆粒理論含量值按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Wa為標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Wc為配方顆粒中咖啡酸的理論質(zhì)量分?jǐn)?shù)，X為飲片出膏率（標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉質(zhì)量占飲片投入量比例計(jì)算），Y為配方顆粒對應(yīng)飲片量，結(jié)果見表3。

表3 海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及轉(zhuǎn)移率結(jié)果Table 3 The caffeic acid content and transfer rate of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

2.1.6 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果分析 由測定結(jié)果可知，海金沙草配方顆粒中咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)理論值范圍為0.17~1.05 mg/g，均值為0.60 mg/g，均值±30%為0.42~0.78 mg/g，最終以實(shí)測范圍確定配方顆粒的咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.17~1.10 mg/g，在均值±2SD 范圍內(nèi)（0.05~1.11 mg/g）；18 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸轉(zhuǎn)移率范圍為48.7%~92.8%，均值73.8%，均值±30%范圍為51.7%~96.0%。確定配方顆粒中咖啡酸轉(zhuǎn)移率范圍為48.0%~93.0%。

另外，3 批配方顆粒中咖啡酸實(shí)測質(zhì)量分?jǐn)?shù)（轉(zhuǎn)移率）分別為0.65 mg/g（86.5%）、0.64 mg/g（85.1%）、0.61mg/g（81.1%），均在相關(guān)范圍內(nèi)，且與對應(yīng)批次的標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉各質(zhì)量屬性（出膏率、含量及轉(zhuǎn)移率）基本一致，表明該制備工藝及質(zhì)量范圍較為合理。

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為CAPCELL CORE C18柱（4.6 mm × 150 mm，2.7 μm），流動相為乙腈（A）和0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0~20 min，6%A→15%A；20~40 min，15%A→20%A；40~50 min，20%A→32%A；50~55 min，32%A），檢測波長0~14 min 為254 nm，14 min~55 min 為320 nm，柱溫為20 ℃，流速為0.70 mL/min，進(jìn)樣量為10μL，理論板數(shù)以咖啡酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 參照物溶液的制備 取海金沙草對照藥材0.6 g，置具塞錐形瓶中，加水25 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，蒸干，放冷，殘?jiān)?0%甲醇20 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，取續(xù)濾液，作為對照藥材參照物溶液。另取“2.1.2”項(xiàng)下的咖啡酸對照品溶液，作為對照品參照物溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別取海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒0.1 g，加水10 mL使溶解，用水飽和正丁醇萃取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，放冷，殘?jiān)?0%甲醇20 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.4 特征圖譜方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號：BT01），連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，計(jì)算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值，結(jié)果表明，11 個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于2%。表明方法的精密度良好。

2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號：BT01），制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值。結(jié)果表明，11 個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2%。表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號：BT01），分別在配制后第0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣。記錄色譜圖，計(jì)算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值。結(jié)果表明，11個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD 均小于2%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 特征圖譜的建立與分析

2.2.5.1 特征峰的指認(rèn) 參照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，經(jīng)對照品比對，確認(rèn)色譜峰1 為原兒茶酸，色譜峰4 為咖啡酸，色譜峰6 為4-香豆酸，色譜峰7 為異槲皮苷，色譜峰8 為山柰酚-3-O-蕓香糖苷，色譜峰11為蒙花苷，結(jié)果見圖2。

圖2 海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照品定位液相色譜圖Figure 2 Reference location chromatograms of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

2.2.5.2 特征圖譜的建立 取“1.3”項(xiàng)下18 批海金沙草藥材制備成海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑，同時制備3 批海金沙配方顆粒，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，將各色譜峰匹配，建立對照特征圖譜，結(jié)果見圖3－圖4，18批海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照特征圖譜具有11個特征峰，共有特征峰峰面積之總和占總峰面積91.8%，表明選定的11 個特征峰可以作為海金沙草鑒定的標(biāo)志峰。根據(jù)各峰響應(yīng)值，選擇以峰4（咖啡酸）參照峰相應(yīng)的峰為S 峰，計(jì)算其余特征峰與S峰相對保留時間，相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±10%之內(nèi)，規(guī)定值為：0.48（峰1）、0.77（峰2）、0.94（峰3）、1.06（峰5）、1.45（峰6）、1.93（峰7）、2.17（峰8）、2.32（峰9）、2.52（峰10）、3.16（峰11）。

圖3 海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照特征圖譜Figure 3 Reference fingerprints of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

圖4 18批海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜共有模式圖Figure 4 Common pattern chromatograms of 18 batches of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

2.2.5.3 相似度評價 測得18 批海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑結(jié)果見表4－表5，將圖譜中各色譜峰匹配后，建立對照特征圖譜，計(jì)算得到各批次與對照圖譜的相似度在0.954~0.996之間，見表6。相似度較高，結(jié)果表明18 批樣品的化學(xué)成分較為類似，測得3 批配方顆粒的相似度分別為0.974、0.988、0.989，表明配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有較好的一致性。

表4 18批海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑相對保留時間結(jié)果Table 4 Results of relative retention time of 18 batches Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

表5 18批海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相對峰面積結(jié)果Table 5 Results of relative peak area of 18 batches Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

表6 18批海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度結(jié)果Table 6 Similarity results of 18 batches Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

2.2.5.4 聚類分析評價 采用SPSS 22.0 軟件，以共有峰的峰面積為變量，采用組間聯(lián)接法、歐平方式距離對18批海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖5 所示。根據(jù)聚類分析結(jié)果，歐式間距小于5時，18 批海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品可以分為3 類：第1類為BT16、BT17、BT18；第2 類為BT01、BT02、BT08、BT10、BT11、BT12、BT13、BT14、BT15；第3類為BT03、BT04、BT05、BT06、BT07、BT09，由聚類分析的結(jié)果可知，共有峰的峰面積與產(chǎn)地分布無明顯關(guān)聯(lián)。而特征峰峰面積在一定程度上反映了標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉中所含有的特征成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高低，因此間接表明所含化學(xué)成分的種類與質(zhì)量分?jǐn)?shù)高地與產(chǎn)地關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)。

圖5 系統(tǒng)聚類分析結(jié)果Figure 5 Results of systematic cluster analysis

2.2.5.5 主成分分析評價 采用SPSS 22.0 軟件，以11 個共有峰的峰面積為變量，進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表7。以特征值大于1 和貢獻(xiàn)率達(dá)到85%以上作為提取原則，提取的主成分1 的特征值為7.146，貢獻(xiàn)率達(dá)到64.97%；提取的主成分2 的特征值為2.113，貢獻(xiàn)率達(dá)到19.21%；提取的主成分3 的特征值為1.065，貢獻(xiàn)率達(dá)到9.68%，這3個主成分的貢獻(xiàn)率達(dá)到了93.86%。對成分矩陣進(jìn)行了具有Kaiser標(biāo)準(zhǔn)化的正交旋轉(zhuǎn)，得到11 個指標(biāo)（峰）在3 個主成分旋轉(zhuǎn)成分矩陣，見表8。成分載荷矩陣的數(shù)值及符號代表變量在主成分當(dāng)中的載荷，載荷越大，表明該化合物在主成分分析中作用越大。由表8結(jié)果可知，峰2、7、9、11 對主成分1 的影響力較大，其中峰7為異槲皮苷。峰6對主成分2的影響力較大，峰6 為4-香豆酸。峰1、10 對主成分3 的影響力較大，峰1為原兒茶酸，峰11為蒙花苷。

表7 主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 7 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

表8 旋轉(zhuǎn)成分矩陣Table 8 Rotational component matrix

2.3 TLC法鑒別

2.3.1 TLC 法條件 取海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉或配方顆粒1 g，研細(xì)，加無水乙醇30 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取海金沙草對照藥材1 g，加水50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇30 mL，同法制成對照藥材溶液。按照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2020 年版“通則0502”）進(jìn)行試驗(yàn)。分別吸取供試品溶液4 μL、對照藥材溶液8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（10∶1∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，分別置紫外光燈254、365 nm 下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)和熒光斑點(diǎn)，結(jié)果見圖6－圖7。

圖6 18批海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑TLC色譜圖Figure 6 Results of TLC of 18 batches Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

圖7 3批海金沙草配方顆粒的TLC色譜圖Figure 7 Results of TLC of 18 batches Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.formula granules

2.3.2 TLC法鑒別結(jié)果 由圖6－圖7可見，海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉供試品色譜中，在254、365 nm下，與海金沙草對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，均顯示相同顏色的斑點(diǎn)和熒光斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰、分離度好。3 批海金沙草配方顆粒的TLC 結(jié)果表明，斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)湯劑基本一致、信息豐富，因此該方法可作為海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒的有效鑒別方法。

3 討論

2020 年版《中華人民共和國藥典》[20]僅收載了海金沙藥材，來源為海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.的干燥成熟孢子，而海金沙草被廣泛收載于各地方藥材標(biāo)準(zhǔn)，其中《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2011 年版）[1]規(guī)定海金沙草為海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.及小葉海金沙Lygodium microphyllum（Cav.）R.Br.的干燥地上部分。因此本研究過程中收集了海金沙基原，建立了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

本研究在特征圖譜方法開發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，海金沙草中化學(xué)成分色譜峰信息量極為豐富，采用的常規(guī)梯度洗脫方法也很難保證各特征峰的有效分離，因此在供試品制備方法考察中對比了不同提取溶劑（水、50%甲醇、甲醇、乙醇）、不同萃取溶劑（乙酸乙酯、三氯甲烷、水飽和正丁醇）的效果。三氯甲烷、乙酸乙酯因極性較小，導(dǎo)致萃取時部分特征峰缺失，水、50%甲醇、甲醇、乙醇所得特征峰數(shù)量雖多，但基線噪音過大，分離效果不佳。水飽和正丁醇萃取所得特征峰數(shù)量多且能呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分，共有峰峰面積占總峰面積90%以上，能較好地代表海金沙草配方顆粒整體質(zhì)量，且特征峰更容易辨別和指認(rèn)，因此最終確定了使用水飽和正丁醇進(jìn)行萃取，可用于海金沙草配方顆粒的質(zhì)量監(jiān)測。

本文通過對海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、主要成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及轉(zhuǎn)移率、HPLC 特征圖譜以及TLC 鑒別方法的研究，建立了海金沙草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并驗(yàn)證了配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的一致性，可全面反映其質(zhì)量，為相關(guān)質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。