基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對接及實驗研究探討高良姜-香附藥對治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用機(jī)制

黃玉芳，譚銀豐，3，任喜康，李永輝，3，4，張俊清，3，4，李海龍，3

（1.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實驗室，海南 ?？?571199；3.?？谑欣枳遽t(yī)藥重點(diǎn)實驗室，海南 海口 571199；4.熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室，海南 ?？?571199）

原發(fā)性痛經(jīng)（primary dysmenorrhea，PD）屬非器質(zhì)性病變，被定義為女性行經(jīng)前后或行經(jīng)期間引發(fā)的腹部痙攣性疼痛，輕則頭暈、惡心嘔吐、冒冷汗、乏力等，重則出現(xiàn)昏厥、休克、甚至心理健康，危及生命[1]。隨著社會生活壓力、飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的轉(zhuǎn)變，PD 患病率呈逐年增加的趨勢[2-4]。全球范圍內(nèi)，患有PD 的育齡婦女達(dá)45%~93%，其中有3%~33%的患者屬于嚴(yán)重疼痛。在一項以6所大學(xué)的550 名女生的原發(fā)性痛經(jīng)評估調(diào)查中，PD 的患病率為80.9%，大多數(shù)疼痛程度為中度（56%）和重度（34.6%），嚴(yán)重影響女生的日?；顒雍蛯W(xué)習(xí)能力[5-6]。臨床醫(yī)學(xué)認(rèn)為，PD 的發(fā)生與內(nèi)分泌及代謝因素相關(guān)，經(jīng)期前列腺素、縮宮素、雌二醇、孕酮和NO 等水平的高低都是PD 發(fā)病的關(guān)鍵因素[7-8]，其治療選擇非甾體抗炎藥為主，如布洛芬，但其會引起消化不良、頭痛、嗜睡等副作用，如長期服用該類藥物會增加心臟并發(fā)癥的風(fēng)險及腎臟問題、肝臟并發(fā)癥[9-10]。中草藥作為PD 的補(bǔ)充和替代療法，具有多樣化、低毒副作用和低成本等優(yōu)勢，有研究表明部分中草藥對PD 的療效確切，并且與非甾體類抗炎藥相當(dāng)或更勝[11-12]。

高良姜具有溫胃止嘔、散寒止痛之功；香附具有理氣解郁、調(diào)經(jīng)止痛的作用。二者成方首見于《良方集腋》，用于治療胃炎、胃潰瘍等寒性胃痛，《本草綱目》[13]中有記載高良姜-香附為伍的妙用，可行淤止痛、散寒疏肝、理氣調(diào)經(jīng)。截至目前，已有研究證實高良姜和香附能緩解PD 引起的疼痛[14-15]，但二者成方用于PD 治療的機(jī)制尚未明確。因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對接及實驗對高良姜-香附藥對治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用機(jī)制進(jìn)行闡明，為其進(jìn)一步應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高良姜和香附藥材購自海南壽南山參業(yè)有限公司，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室田建平教授鑒定為姜科山姜屬植物高良姜Alpinia officinarumHance的干燥根莖，香附為莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根莖；月月舒痛經(jīng)寶顆粒（仲景宛西制藥股份有限公司，規(guī)格：10 g/袋，批號Z41021972）；苯甲酸雌二醇（上海源葉生物科技有限公司，批號Y12O6D4246）；縮宮素注射液（上海禾豐制藥有限公司，規(guī)格：1 mL∶10 U，批號H31020850）；前列腺素E2（PGE2）ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號E20220208-20561A）；前列腺素F2α（PGF2α）ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號E20220208-20562A）；β-內(nèi)啡肽ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20230508）；一步法PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，批號036C2300）；RIPA 裂解液（強(qiáng)）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液（5X）、蛋白酶抑制劑混合物（通用型，100X）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）、特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、Western 一抗、二抗稀釋液（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0013B、P0012S、P0015、P1005、A0208、A0216、P0018AS、P0023A、P0023D）；PVDF 膜[賽文創(chuàng)新（北京）生物科技有限公司，批號20230301]；GAPDH（abclonal，批號AC002）；p38、COX-2（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號27308-1-AP、66234-1-Ig）；PI3K、磷酸化PI3K、AKT、磷酸化AKT（Cell Signaling Technology公司，批號4257、17366、4691、4060）；β-Actin（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號GB11001）；Eastep?Super總RNA 提取試劑盒（上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司，批號0000495807）；PCR 引物（天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司）。

SynergyHTX 多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；ChemiDos XRS 高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；CFX96 Touch 梯度熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實驗動物

SPF 級ICR 雌性小鼠60 只，體質(zhì)量18~22 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0013。實驗前進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由飲水飲食，室溫20~27 ℃，濕度40%~60%，12 h晝夜更替。動物實驗經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：HYLL-2023-393）。

1.3 獲取高“高良姜-香附”藥對活性成分及活性成分靶點(diǎn)

以高良姜、香附作為Herb name 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP, http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）檢索藥物的所有成分。對活性成分進(jìn)行篩選，其篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%，類藥性（drug likeness,DL）≥0.18[16]，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫文獻(xiàn)檢索香附有關(guān)成分的研究，納入不符合該條件的成分。所得活性成分在TCMSP 中獲得的targetname，進(jìn)行去重后，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)行轉(zhuǎn)化得Genename。將篩選得到的活性成分通過TCSMP 和PubChem（http：//pubchem.ncbi.nlm.gov）獲取分子式，再通過Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）預(yù)測靶點(diǎn)，選擇可能性評分為≥0.06 的靶點(diǎn)，結(jié)合TCSMP 中relatedtargets，合并去重后即得。

1.4 獲取疾病相關(guān)靶點(diǎn)

疾病靶點(diǎn)以“dysmenorrhea”和“primarydysmenorrhea”為檢索詞分別在GeneCards、DrugBank、OMIM、TTD和DisGenet檢索，將成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)通過微生信制圖平臺作Venn圖得到交集靶點(diǎn)。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將成分-疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種限定為“homosapiens”，最低交互作用設(shè)置為>0.9，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，將相互作用關(guān)系的TSV 格式數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件中繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并使用插件CytoNCA 進(jìn)行拓?fù)浞治?，以度中心性（度DC）、中介中心性（間距中心度BC）和接近中心性（緊密中心度CC）的中位數(shù)篩選核心靶點(diǎn)。

1.6 KEGG與GO通路富集分析

將藥物成分-疾病交集靶點(diǎn)錄入Metascape 平臺，選擇P<0.05，進(jìn)行KEGG 通路和GO 富集分析，GO 分析包括生物過程、分子功能及細(xì)胞組分。篩選出與PD 相關(guān)的前21 條通路和前10 的生物學(xué)功能進(jìn)行可視化處理。微生信制圖平臺作圖。

1.7 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

將活性成分、交集靶點(diǎn)、相關(guān)通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，三者均用節(jié)點(diǎn)表示，三者之間的相互關(guān)系用邊表示，運(yùn)用插件CytoNCA 進(jìn)行拓?fù)浞治觯訢egree 值篩選關(guān)鍵的活性成分及核心靶點(diǎn)用于后續(xù)分子對接。

1.8 分子對接

通過PDB 數(shù)據(jù)庫下載網(wǎng)絡(luò)圖中核心靶點(diǎn)與PPI網(wǎng)絡(luò)中核心蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，活性成分的Mol2 格式從TCSMP數(shù)據(jù)庫直接下載。根據(jù)DrugBank和文獻(xiàn)研究，布洛芬作為治療PD 的一線藥物，將其作為陽性對比，從Pubchem 下載其3D 結(jié)構(gòu)的SDF 格式，再經(jīng)過OpenBabel 轉(zhuǎn)換成Mol2 格式，蛋白中的水分子和配體經(jīng)Pymol 處理，運(yùn)用Autodock 對受體蛋白和配體成分進(jìn)行加氫處理，轉(zhuǎn)化為pdbqt 格式，再進(jìn)行分子對接模擬計算，最后經(jīng)Pymol進(jìn)行可視化處理。對接結(jié)果以結(jié)合能大小判斷，數(shù)值<0 kcal/mol，說明配體和受體能自發(fā)的結(jié)合，當(dāng)數(shù)值<-5 kcal/mol，說明其結(jié)合情況較好[17-18]，分子對接結(jié)合能可視化由Chiplot平臺繪制熱圖。

1.9 良附醇提物的制備

稱取高良姜、香附各100 g，浸泡30 min，70%（φ）乙醇，料液比1∶8（g∶mL），提取2 次，1 次2 h，將所得提取液濃縮干燥得浸膏7.17 g 生藥/g，取適量用水配成所需濃度備用。

1.10 動物分組及模型制備

60 只雌性小鼠，隨機(jī)分成6 組，每組10 只，分別為正常、模型、陽性藥痛經(jīng)寶顆粒組（5 g/kg）、良附醇提物組（0.9、0.3、0.1 g/kg）。在課題組前期考察高良姜提取物治療痛經(jīng)的實驗和文獻(xiàn)基礎(chǔ)上[19-20]，以苯甲酸雌二醇和縮宮素聯(lián)合制備小鼠PD 模型：每天于小鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇10 mg/kg，連續(xù)注射7 d。正常組注射等體積生理鹽水。從造模第1 天起，除正常、模型組外，按分組給各組小鼠灌胃給予相應(yīng)劑量藥物。小鼠于第7 天末次給藥并皮下注射苯甲酸雌二醇后30 min，腹腔注射縮宮素20 u/kg。

1.11 觀察扭體反應(yīng)

注射縮宮素后觀察，記錄30 min 內(nèi)扭體次數(shù)及開始時間（潛伏期），以小鼠腹部凹陷、后肢外伸、軀體伸展和扭曲為扭體標(biāo)準(zhǔn)，并計算扭體抑制率。

抑制率=（模型組扭體次數(shù)均值-給藥組扭體次數(shù)均值）/模型組扭體次數(shù)均值×100%。

1.12 組織學(xué)檢查

取小鼠子宮同側(cè)同位段子宮組織于4%（φ）多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋切片，經(jīng)環(huán)保型脫蠟液和梯度酒精脫蠟水化，用蘇木素和伊紅染色，再將切片依次放入無水乙醇和二甲苯浸泡透明，最后封片，于顯微鏡下觀察子宮組織病理形態(tài)。

1.13 ELISA 法測定血清中β-EP、PGE2和PGF2α的水平

各組小鼠進(jìn)行摘眼球取血，將取完后靜置2 h的全血進(jìn)行離心獲得血清，于-80 ℃保存，之后嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，檢測各組小鼠血清中β-EP、PGE2和PGF2α的水平。

1.14 Western blot 法檢測子宮組織中COX-2、p38、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平

用預(yù)冷的生理鹽水清洗子宮組織殘留的血液，稱取50 mg組織于2 mL研磨管中，按1∶10質(zhì)量體積比加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，置于高速低溫組織研磨儀自動勻漿，再于4 ℃放置1 h 后，12 000 r/min 離心15 min，用BCA 蛋白試劑盒對上清進(jìn)行蛋白定量并配平，分裝于-80 ℃保存，使用前100 ℃煮6 min。按照一步法PAGE 凝膠快速制備試劑盒說明制備電泳膠，加入40 μg 蛋白，電泳結(jié)束轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST 洗滌3 次，5 min/次，一抗4 ℃孵育過夜，洗滌3 次，10 min/次，二抗室溫孵育1 h，洗滌4次，5 min/次，顯影，ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

1.15 RT-qPCR 檢測COX-2、MAPK14、PI3K 和AKT的mRNA表達(dá)

用預(yù)冷的生理鹽水清洗子宮組織殘留的血液，冰上稱取30 mg 子宮組織于2 mL 研磨管中，按Eastep?Super 總RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取RNA，進(jìn)行核酸定量及A260/280 檢測后，分裝于-80 ℃保存。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用Hieff?qPCRSYBR Green Master Mix（No Rox）制備20 μL 反應(yīng)體系，于CFX96 Touch 儀器上進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件參照說明書，采用2-ΔΔCt法分析RT-qPCR結(jié)果。引物序列見表1。

表1 qPCR所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in qPCR

1.16 統(tǒng)計分析

采用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示，采用組間單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 良附活性成分的篩選結(jié)果

通過TCSMP 數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)查閱，去掉無靶點(diǎn)的成分，共獲得29 種活性成分，其中香附15 個、高良姜9 個、共有成分5 個，見表2。將成分含量和活性高，但不符合TCSMP 篩選條件的成分納入，分別是諾卡酮（Nootkatone）、DPHA（（5R）-5-hydroxy-7-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-1-phenylheptan-3-one）、香附烯酮（cyperotundone）和α-香附酮（（4aR，7R）-7-isopropenyl-1，4a-dimethyl-3，4，5，6，7，8-hexahydronaphthalen-2-one）。

2.2 活性成分-疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

良附活性成分靶點(diǎn)合并去重后共有719個。通過GeneCards、DrugBank、OMIM、TTD 和DisGenet數(shù)據(jù)庫檢索獲取疾病靶點(diǎn)，經(jīng)合并去重，獲得PD 的相關(guān)靶點(diǎn)662 個，將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)通過作韋恩圖得到交集靶點(diǎn)117個，見圖1。

圖1 高良姜-香附與原發(fā)性痛經(jīng)交集靶點(diǎn)韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the intersection targets between Alpinia officinarum-Cyperus rotundus and primary dysmenorrhea

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

將成分-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，獲取PPI 信息，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，如圖2。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行可視化，刪去游離連接的6個節(jié)點(diǎn)，刪除重復(fù)邊，得到80 個節(jié)點(diǎn)、442 條邊。運(yùn)用插件CytoNCA進(jìn)行拓?fù)浞治?，度中心性（度DC）、中介中心性（間距中心度BC）和接近中心性（緊密中心度CC）得到中位數(shù)分別為10、47.415、0.323，經(jīng)中位數(shù)篩選最終得到10 個核心靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越趨向紅色，說明度值越高，見圖2。通過篩選最小相互作用大于0.9 的網(wǎng)絡(luò)，對網(wǎng)絡(luò)圖中排名前25的核心靶點(diǎn)，通過Chiplot作柱狀圖，見圖3。Degree值大于30 的前5 個基因分別為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT3，度=42）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸肌醇-3-激酶（PIK3CA，度=36）、絲氨酸／蘇氨酸激酶（AKT1 度=34）、雌激素受體（ESR1，度=32）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53，度=32），提示“高良姜-香附”藥對可能通過這5個核心基因治療PD。

圖3 PPI圖中的靶點(diǎn)排序（排名前25位）Figure 3 Ranking of targets in PPI network（top 25）

2.4 KEGG和GO富集分析結(jié)果

將成分-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺進(jìn)行KEGG 通路分析和GO 富集分析，選擇Hsapiens 進(jìn)行分析。GO 富集分析生物過程共有138 條，前10條生物過程涉及激素反應(yīng)、對異種刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、血液循環(huán)、對氧氣水平降低的反應(yīng)、烯烴化合物代謝過程、細(xì)胞群增值的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、對雌二醇的反應(yīng)和腺體發(fā)育等，如圖4。細(xì)胞組成共105 條，涉及膜筏、樹突、神經(jīng)元細(xì)胞體、分泌顆粒腔、軸突和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等。分子功能共149條，涉及單加氧酶活性、蛋白質(zhì)同二聚化活性、核受體活性、肽結(jié)合、激酶結(jié)合和突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等，前10條作圖，見圖4。KEGG 富集分析獲得與117個交集靶點(diǎn)具有顯著性相關(guān)的通路共157條，根據(jù)文獻(xiàn)檢索篩選出與PD相關(guān)的前21條關(guān)鍵通路，涉及PI3K/AKT 信號通路、鈣信號通路、MAPK 信號通路、細(xì)胞衰老、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等，見圖5。結(jié)果表明，良附可通過激素調(diào)節(jié)、炎癥相關(guān)通路、中樞陣痛、平滑肌解痙、免疫調(diào)節(jié)的方式治療PD。

圖5 KEGG 富集分析Figure 5 KEGG enrichment analysis

2.5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選得到的29 個活性成分、117 個交集靶點(diǎn)以及KEGG 富集與PD 相關(guān)的21 條通路，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化，刪去重復(fù)邊159條，得到167 個節(jié)點(diǎn)，849 條邊，見圖6。通過CytoNCA分析良附最關(guān)鍵的前5 種活性成分為：槲皮素（quercetin 度=61）、山柰酚（kaempferol，度=44）、美紫檀素（medicarpin，度=31）、高良姜素（galangin，度=29）、木犀草素（luteolin，度=37），分析靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)度值大于20 的有：前列腺素G/H 合酶2（PTGS2，度=26）、雌激素合酶（CYP19A1，度=22）、絲氨酸／蘇氨酸激酶（AKT1，度=20）、前列腺素G/H 合酶1（PTGS1，度=20）。

圖6 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Figure 6 Network of “components-targets-pathway”

2.6 分子對接

根據(jù)CytoNCA 分析結(jié)果，見表3，“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中選擇Degree 排列前5 的活性成分和陽性藥物與度值為26的核心靶點(diǎn)及PPI網(wǎng)絡(luò)分析的前5 個核心基因使用AutoDock 軟件進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果見圖7，陽性藥物布洛芬除與STAT3 的對接為-4.50 kcal/mol外，其活性成分與靶蛋白的最低結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，說明配體與受體的結(jié)合情況較好，并且中藥活性成分的對接結(jié)果較陽性藥物的好。將6個靶蛋白與分子最低結(jié)合能進(jìn)行可視化處理，如圖8，medicarpin 和PIK3CA 分別在ASP-933、TYR-836處形成氫鍵，與TP53分別在HIS-178、ASN-239 處形成氫鍵，與PTGS2 在ASN-382 處形成氫鍵，與STAT3 分別在ASP-371、LYS-370、GLU 處形成氫鍵，與ESR1 在GLU-353、ARG-394 處形成氫鍵，kaempferol 和AKT1 分別在ARG-76、GLN-61、LEU-78、GLN-59、SER-56 處形成氫鍵。由活性成分與陽性藥物的分子對接結(jié)果，驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有一定的可靠性。

圖7 “高良姜-香附”藥對活性成分與關(guān)鍵靶標(biāo)的分子對接結(jié)果Figure 7 Molecular docking results of active components of Alpinia officinarum-Cyperus rotundus to key targets

圖8 分子對接結(jié)果可視化Figure 8 Visualization of molecular docking results

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)與“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的CytoNCA分析結(jié)果Table 3 CytoNCA analysis results of PPI network and"component-target-pathway"network

2.7 扭體反應(yīng)

與正常組比較，模型組的潛伏期時間明顯縮短，扭體次數(shù)增加，與模型組相比，各組扭體次數(shù)均有顯著性減少，潛伏期時間有所增加，見表4。

表4 小鼠扭體實驗結(jié)果Table 4 Results of writhing experiment in mice

2.8 小鼠子宮病理變化

正常組小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞平整、無水腫、充血和炎性浸潤等異常形態(tài)。與正常組比較，模型組上皮細(xì)胞壞死，有明顯的水腫，多處充血和炎性浸潤，成功制備痛經(jīng)模型。與模型組比較，給藥組的水腫充血及炎性浸潤程度有所減輕，并且良附醇提物高劑量組效果更好，見圖9。

圖9 各組小鼠子宮組織形態(tài)（HE，100×）Figure 9 Morphology of mouse uterine tissue in each group（HE，100×）

2.9 小鼠血清中β-EP、PGE2和PGF2α含量

與正常組比較，模型的PGE2和β-EP 水平顯著性降低，PGF2α水平顯著性升高，與模型組比較，陽性組和不同給藥組的PGE2和β-EP 水平均顯著性升高，陽性組和不同給藥組的PGF2α水平顯著性降低，見表5。

表5 小鼠血清中PGE2、β-EP和PGF2α的含量Table 5 Levels of serum PGE2，β-EP and PGF2α in mice(，n=7) ρ/(pg·mL-1)

表5 小鼠血清中PGE2、β-EP和PGF2α的含量Table 5 Levels of serum PGE2，β-EP and PGF2α in mice(，n=7) ρ/(pg·mL-1)

與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

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2.10 Western blot 法檢測子宮組織中COX-2、p38、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平

與正常組比較，模型組小鼠子宮組織中COX-2、p38、PI3K、和p-AKT 的蛋白表達(dá)顯著升高；與模型組比較，陽性組和良附醇提物低、中、高劑量組COX-2、p38、PI3K、p-PI3K 和p-AKT 的蛋白表達(dá)顯著降低，AKT 蛋白表達(dá)無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表6和圖10。

圖10 各組小鼠子宮組織相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 10 Expression of uterine tissue related proteins in each group of mice

表6 各組小鼠子宮組織相關(guān)蛋白表達(dá)Table 6 Expression of uterine tissue related proteins in each group of mice(，n=3)

表6 各組小鼠子宮組織相關(guān)蛋白表達(dá)Table 6 Expression of uterine tissue related proteins in each group of mice(，n=3)

與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

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2.11 RT-qPCR 檢測COX-2、MAPK14、PI3K 和AKT的mRNA表達(dá)

與正常組比較，模型組小鼠子宮組織COX-2、MAPK14 和PI3K 的mRNA 水平顯著升高。與模型組比較，陽性組和良附醇提物低、中、高劑量組COX-2、MAPK14 和PI3K 的mRNA 水平顯著降低，AKT 的mRNA 無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表7。

表7 各組小鼠子宮組織mRNA表達(dá)Table 7 mRNA expression in uterine tissue of mice in each group(，n=3)

表7 各組小鼠子宮組織mRNA表達(dá)Table 7 mRNA expression in uterine tissue of mice in each group(，n=3)

與正常組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

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3 討論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動物實驗探討良附治療PD的作用機(jī)制，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，體現(xiàn)“高良姜-香附”藥對中多活性成分作用于多靶點(diǎn)、通路或作用于同一靶點(diǎn)發(fā)揮療效，為治療PD 的藥效研究和作用機(jī)制提供依據(jù)。研究結(jié)果表明，良附中槲皮素、山柰酚、美迪紫檀素、木犀草素、高良姜素、DPHA 及α-香附酮等29 個成分可作為治療PD 的潛在活性成分。槲皮素和山柰酚被證實具有抗炎和抗氧化等作用[21-22]。在分子對接結(jié)果中，美迪紫檀素顯示更佳的結(jié)合能力，該成分可經(jīng)多種藥用植物分離獲得，并被證實具有抗炎、抑菌和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等藥理活性[23]。木犀草素通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)和炎癥相關(guān)的信號通路抑制炎癥反應(yīng)，如調(diào)節(jié)前列腺素、白介素、干擾素，調(diào)控NF-κB、MAPK、PI3K、AKT信號通路，可上調(diào)信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄活化因子6（p-STAT6）和抑制轉(zhuǎn)錄激活因子3（p-STAT3），將促炎化為抗炎，其發(fā)生部位主要在免疫細(xì)胞內(nèi)部[24-25]。香附中的揮發(fā)油、香附烯和香附酮都能使雌性小鼠上皮細(xì)胞角質(zhì)化，具有雌激素樣活性，可與雌激素競爭相應(yīng)受體，從而避免PGF2α的增加，減少子宮異常收縮[26]。溫東婷等[27]發(fā)現(xiàn)α-香附酮可抑制大鼠離體子宮自發(fā)性收縮，并且對縮宮素引起的收縮具有明顯的抑制作用，首次證明α-香附酮是香附中治療PD 的主要活性成分之一，根據(jù)文獻(xiàn)研究[28]，諾卡酮能夠介導(dǎo)炎癥通路，具有抗炎、抗氧化和抗血小板的藥理活性。相關(guān)文獻(xiàn)表明，高良姜素具備良好的抗炎活性，其作用機(jī)制主要通過抑制炎癥因子、PI3K、AKT 及MAPK 等信號通路，這與本研究結(jié)果一致，目前高良姜素在神經(jīng)炎癥、腎炎、腸炎及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等模型都具有顯著的抗炎活性[29]。而炎癥反應(yīng)是引起PD 的主要機(jī)制之一，因此認(rèn)為高良姜素可能通過該機(jī)制達(dá)到治療作用。高良姜中的主要活性成分除了黃酮類成分，其二芳基庚烷類成分也具有很好的抗炎、抗氧化、抗病毒等活性，高良姜中最關(guān)鍵的二芳基庚烷類成分是DPHA，具有顯著的抗炎和抗雌激素作用[30-31]。

117 個交集基因通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)與“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明，度值靠前由大到小依次為STAT3、PIK3CA、AKT1、ESR1、TP53、PTGS2、TNF、CAV1、FOS、MYC、VEGFA。根據(jù)分子對接結(jié)果，PTGS2 與活性成分的結(jié)合能力更強(qiáng)，其為花生四烯酸代謝途徑轉(zhuǎn)化成前列腺素類物質(zhì)的關(guān)鍵合酶，現(xiàn)已有研究表明，PGF2α和PGE2含量的比值被認(rèn)為是引起痛經(jīng)的重要發(fā)病機(jī)制之一，并且PGF2α在痛經(jīng)中的作用更重要[32]，子宮合成與分泌的PGE2能夠起到松弛平滑肌的作用，而PGF2α?xí)鹱訉m平滑肌收縮。在PD 中，子宮收縮力的異常增加類似于前列腺素或其衍生物誘導(dǎo)的子宮收縮力，痛經(jīng)的強(qiáng)度與PGF2α的釋放量成正比。60%以上的患者出現(xiàn)的惡心、嘔吐和腹瀉等癥狀與前列腺素的不良作用相似[33]。β-EP 是一種具有內(nèi)源性鎮(zhèn)痛作用的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，其含量高低與痛經(jīng)程度呈負(fù)相關(guān)，是影響痛經(jīng)的關(guān)鍵指標(biāo)之一[34-35]。KEGG 結(jié)果表明，高良姜-香附治療PD 關(guān)鍵的機(jī)制依次是炎癥通路、中樞鎮(zhèn)痛及激素調(diào)節(jié)，相關(guān)通路均有顯著性差異，以PI3K/AKT 信號通路顯著性最大，PI3K 和AKT 介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等作用，調(diào)控炎癥因子的釋放[36]，調(diào)控該通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠抑制炎性因子水平，并調(diào)節(jié)COX-2、VEGF和BCL-2等下游因子的含量[37]。有研究表明[38]，MAPK 通路與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生相關(guān)，該通路激活會引炎癥因子的高表達(dá)，加重痛經(jīng)。綜上，本研究通過動物實驗驗證上述結(jié)果。動物實驗結(jié)果表明，模型組小鼠的扭體潛伏期縮短，扭體次數(shù)增加，其子宮組織形態(tài)有明顯的水腫，上皮細(xì)胞壞死、充血及大量的炎性浸潤，小鼠血清中PGE2和β-EP 含量降低，PGF2α含量增加，Western blot和RT-qPCR 結(jié)果表明，模型組小鼠子宮組織中COX-2、p38、PI3K、和p-AKT 的蛋白表達(dá)顯著升高，良附醇提物組均有所降低，并且mRNA 的表達(dá)與蛋白表達(dá)趨勢一致，驗證了良附可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT、MAPK、PTGS2 的相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)緩解痛經(jīng)，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果一致。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及實驗驗證，對良附的關(guān)鍵活性成分及藥理作用機(jī)制進(jìn)行闡明，體現(xiàn)了多成分與多靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。動物實驗和分子對接在一定程度上雖能證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有一定可靠性和準(zhǔn)確性，具有一定的參考價值，但存在以下不足：驗證的蛋白較為常見，并且檢索方法和數(shù)據(jù)庫與其他網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法較為重復(fù)。因此，該研究的結(jié)論仍需要進(jìn)一步驗證。