轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在豬肉質(zhì)性狀研究中的進(jìn)展

李龍嬌

（重慶三峽職業(yè)學(xué)院 404115）

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高，人們對豬肉產(chǎn)品有了更高的要求，不僅僅局限于滿足豬肉的量，更多的是關(guān)注口味、口感、營養(yǎng)等豬肉品質(zhì)方面。多年來，育種工作者致力于在滿足消費(fèi)者更多追求的同時(shí)，選育出對人體健康有益的肌肉脂肪含量適宜、新鮮氨基酸含量高、不飽和脂肪酸含量高、肉質(zhì)鮮美的品種。在眾多的育種技術(shù)中，高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序的一次革命性變革，幾千萬到幾億的堿基數(shù)字可以通過單次實(shí)驗(yàn)獲得，從而有可能分析出一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組的詳細(xì)全貌。其中，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可直接測序樣品中存在的RNA 分子，對每個轉(zhuǎn)錄本的計(jì)數(shù)可定量分析，并可映射到基因組進(jìn)行注釋[1]。因此，該技術(shù)在基因組數(shù)據(jù)的大規(guī)模分析中得到了廣泛應(yīng)用，為探索種群的基因變異和轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)特征提供了一條新的途徑。

1 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

轉(zhuǎn)錄組測序通過對該物種的RNA 進(jìn)行高通量測序，再將基因表達(dá)量通過cDNA 片段兩端的Reads 序列與選中的物種參考基因組序列進(jìn)行比對后計(jì)算，或注釋出同源的未知基因的比對，從而篩選出表達(dá)差異的基因[1]。轉(zhuǎn)錄組測序的發(fā)現(xiàn)和尋找新信息的能力比一般應(yīng)用的基因芯片技術(shù)和基因組學(xué)更強(qiáng)。通過轉(zhuǎn)錄組測序所發(fā)掘越來越多的差異表達(dá)基因或者差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的功能注釋和富集分析等生物學(xué)信息，讓該技術(shù)擁有了廣泛用于哺乳動物的生長發(fā)育、免疫機(jī)制、疾病診斷和藥物開發(fā)領(lǐng)域的潛力。

2 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在豬肉質(zhì)量研究中的應(yīng)用

豬肉的品質(zhì)是一個復(fù)雜的特征，與肌肉增長和脂肪含量密切相關(guān)，受到品種、環(huán)境、飼喂管理，屠宰加工方式的影響。轉(zhuǎn)錄組測序研究在豬肉品質(zhì)的研究中，一方面著重于不同發(fā)育階段的差異研究，以及骨骼肌的生理狀態(tài)或生產(chǎn)性能的差異性。另一方面，該技術(shù)在以商業(yè)瘦肉型豬種（約克夏、大白、長白、杜洛克等）與地方豬種間的肉品比較為主要研究方向[2]。相比商品型瘦肉型豬種，我國一些地方的豬種雖然生長速度慢，含脂量高，但其風(fēng)味和口感受到大眾青睞。肌肉的生長發(fā)育過程是一個持續(xù)動態(tài)的變化過程，受到多種調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子的作用，如已證實(shí)的生機(jī)調(diào)節(jié)因子家族（MRFs）、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子家族（MEF2）以及調(diào)控肌肉生成的上游調(diào)控因子PAX3 家族等[3]。然而其間的復(fù)雜調(diào)控體系和分子機(jī)制尚不明確，亟需生物學(xué)信息的不斷深入發(fā)掘。

2.1 編碼RNA 對于豬肉質(zhì)的研究應(yīng)用

編碼RNA（mRANs）的測序是轉(zhuǎn)錄組測序最早開展研究的方向，mRANs 的測序分析可直接與蛋白組學(xué)相銜接，將基因的遺傳信息和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行相互驗(yàn)證，而大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也證實(shí)了這一點(diǎn)。例如，有學(xué)者通過對3 種不同發(fā)育階段的八眉豬背肌最長的轉(zhuǎn)錄組測序，識別出23926 個mRAN 和241 個差異微RNA（miRNAs）的基因，其中差異表達(dá)基因大多由不同的miRNAs 調(diào)控，揭示了不同生長階段豬的骨骼肌肉差異的發(fā)育模式[4]。通過GO 和KEGG 富集分析，從江香豬和大白豬的背部最長肌群中獲取的318 個差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要集中在一磷酸腺苷活化蛋白激酶信號通路、轉(zhuǎn)錄因子信號通路、丙酮酸代謝通路以及與肉質(zhì)相關(guān)的4 條脂肪酸代謝通路[5]。利用mRNAs 測序在對豬肌衛(wèi)星細(xì)胞Notch 1 的探索中進(jìn)一步確定mRNAs- miRNAs 的調(diào)控關(guān)系并篩選到關(guān)鍵基因，為豬肌衛(wèi)星細(xì)胞Notch 1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供參考[6]。在長白豬與藍(lán)塘豬肌肉不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組分析中，影響肌生成的候選靶基因如GSK3B、IKBKB 和ACVR1等由于差異表達(dá)被鑒定發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，研究人員指出藍(lán)塘豬比長白豬生長緩慢的原因可能與肌生成抑制關(guān)鍵基因在藍(lán)塘豬體內(nèi)高表達(dá)有關(guān)[7]。在對杜洛克與恩施豬、杜洛克與梅山豬、大白與恩施豬和大白與梅山豬4 個比較組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析中，共鑒定到1799 個差異表達(dá)基因。這些差異表達(dá)基因由GO 和KEGG 分析發(fā)現(xiàn)主要富集于骨骼肌發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過程和信號通路中，如葡萄糖代謝過程、骨骼肌細(xì)胞分化、成肌細(xì)胞分化等[8]。在對蘇姜豬兩個生長階段的背最長肌和腿肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析篩選出背最長肌之間的差異表達(dá)基因1655 個，背最長肌與腿肌之間的差異表達(dá)基因有383 個，同時(shí)還篩選到6 個與蘇姜豬肌肉肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因[9]。上述結(jié)論進(jìn)一步解釋了商業(yè)瘦肉型豬種和地方豬種在肉質(zhì)上的形成差異的原因，為今后培育更優(yōu)質(zhì)的豬種提供參考依據(jù)。

2.2 非編碼RNA 對于豬肉質(zhì)的研究應(yīng)用

2.2.1 miRNAs 在豬肉質(zhì)中研究

測序技術(shù)的進(jìn)步表明，生物過程是被調(diào)節(jié)的，而不是僅僅通過mRNA 轉(zhuǎn)錄來表達(dá)，還需要微RNA（miRNA)、長鏈非編碼RNA（lncRNA)、環(huán)狀RNA（circRNA）等非編碼RNA（ncRNA）的參與。其中對于miRNA 的鑒定和靶標(biāo)預(yù)測是近十年來研究的熱點(diǎn)，miRNA 作為一種小的非編碼RNA，通過識別同源序列和干擾轉(zhuǎn)錄、翻譯或表觀遺傳過程來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[10]。通過對長白豬、通城豬和五指山豬三種不同品系豬種的肌肉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，長白豬和通城豬存在差異表達(dá)基因43 個和差異表達(dá)miRNA106 個，長白豬和五指山豬存在差異表達(dá)基因145 個和差異表達(dá)miRNAs 156 個，通城豬和五指山豬存在差異表達(dá)基因92 個和差異表達(dá)miRNAs 151 個。通過構(gòu)建差異性表達(dá)基因和差異性表達(dá)miRNAs 的互作網(wǎng)絡(luò)，研究人員發(fā)現(xiàn)差異性表達(dá)miRNAs 主要參與調(diào)控的過程包括氧化應(yīng)激過程、肌肉器官發(fā)育過程、肌肉收縮過程、脂肪酸代謝等過程[11]。

2.2.2 circRNAs 和lncRNsA 在豬肉質(zhì)中研究

有資料表明，環(huán)狀RNA (circRNAs）和長鏈非編碼RNA (lncRNAs）參與到脂肪形成和肌源性分化過程中[12]，但它們對豬肌肉性狀的影響機(jī)理尚不明確。研究人員通過比較商業(yè)瘦肉型豬種杜洛克和中國地方豬種淮南豬的背最長肌表達(dá)圖譜，鑒定出差異表達(dá)lncRNAs 233 個，circRNAs 66 個。差異表達(dá)基因和circRNAs 靶基因富集在與脂肪形成相關(guān)的Wnt 通路、肌源性分化以及氨基酸代謝通路[10]。同樣的，在對北京黑豬和夏洛克豬骨骼肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測序后，得到差異表達(dá)基因1055個，lncRNAs 322 個，circRNAs 82 個，富集結(jié)果顯示差異表達(dá)的基因和lncRNAs 的靶基因主要參與骨骼肌發(fā)育和脂肪酸代謝等相關(guān)通路[13]。為豐富ncRNAs 的信息網(wǎng)絡(luò)，研究人員還對確山黑豬和大白豬背最長肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，比較了兩種豬肌肉表達(dá)譜，進(jìn)一步探索circRNAs 在肉質(zhì)中的作用。經(jīng)數(shù)據(jù)分析得到差異表達(dá)circRNAs 62 個，39 個miRNAs，404 個差異表達(dá)基因。而這些差異表達(dá)的circRNAs 的靶基因富集于正調(diào)控骨骼肌纖維收縮、骨骼肌松弛、成肌細(xì)胞增殖、AMPK 信號通路、Wnt 和Jak-STAT 信號通路等方面[14]。通過上述商業(yè)瘦肉型豬種和地方豬種背最長肌測序數(shù)據(jù)比較得知，lncRNAs 和circRNAs 參與成肌細(xì)胞的增殖、分化過程、肌內(nèi)脂肪沉積和肌肉發(fā)育等過程，同時(shí)還作為肉質(zhì)不同性質(zhì)的分子基礎(chǔ)調(diào)節(jié)肌肉機(jī)構(gòu)[10]。盡管ncRNA 不直接參與轉(zhuǎn)錄過程，但它們對生物的生長發(fā)育和表型遺傳的調(diào)控卻是必不可少的。

3 展望

豬肉在世界肉類消費(fèi)中占有重要地位，是人們生活中的主要肉制品來源。中國作為最大的豬肉消費(fèi)國家，豬在中國畜牧業(yè)中占有十分重要的作用。隨著高通量測序技術(shù)等生物信息技術(shù)的不斷發(fā)展，相信會了解到更多的分子生物信息。屆時(shí)，我們將掌握豬在不同時(shí)期、不同品種、不同飼養(yǎng)模式在發(fā)展過程中的基因差異和調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而為培育適應(yīng)社會需求的新品種提供理論依據(jù)，從不同角度提高豬肉的品質(zhì)，從而提升經(jīng)濟(jì)效益。