脾胃培源方含藥血清對鵝去氧膽酸誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞腸化生的影響

裴 蓓,魏思源,張 藝,郝文哲,鄭艷敏,李學(xué)軍

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,安徽 合肥 230000;2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230000;3. 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院,安徽 合肥 230000)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是臨床較為常見的一種消化系統(tǒng)疾病,在我國發(fā)病率較高,以胃黏膜固有腺體萎縮為基本病理特點(diǎn),中-重度CAG有一定的癌變率[1]。在其基礎(chǔ)上伴發(fā)的腸上皮化生和(或)異型增生,被稱為癌前病變,是胃黏膜從正常向胃癌發(fā)展過程中的一個(gè)重要階段[2]。胃癌是一種分子和表型高度異質(zhì)性的疾病,是第三大常見癌癥死亡原因[3]。盡管在過去一個(gè)世紀(jì)中胃癌的全球發(fā)病率有所下降,但它仍然是威脅人類健康的主要?dú)⑹諿4]。根據(jù)Correa級聯(lián)學(xué)說,腸型胃腺癌是胃黏膜逐步從萎縮、腸上皮化生、異型增生發(fā)展而來的[5-6],而胃黏膜腸上皮化生與腸型胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。因此針對CAG進(jìn)行及時(shí)有效的干預(yù),是預(yù)防胃癌發(fā)生、發(fā)展的重要舉措。目前西醫(yī)對于腸上皮化生尚無有效的治療方法,而中醫(yī)藥治療有著獨(dú)特的自身優(yōu)勢。中醫(yī)認(rèn)為,正氣不足是疾病發(fā)生的內(nèi)在因素。腸上皮化生者多素體脾虛,或因感邪損傷脾胃,衛(wèi)外之力不足,邪氣易侵入體內(nèi),而正氣不足,無力鼓邪外出,進(jìn)一步導(dǎo)致脾氣虛衰。李學(xué)軍教授基于脾胃虛弱的病機(jī)特點(diǎn),結(jié)合自身的臨床實(shí)踐自擬脾胃培源方治療CAG。前期研究表明,脾胃培源方治療胃癌前病變及胃癌療效確切,可抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8-10],但其對胃黏膜腸上皮化生是否有影響及其機(jī)制尚不明確?；诖?本研究以鵝去氧膽酸誘導(dǎo)人胃上皮細(xì)胞(GES-1)腸上皮化生,探討了脾胃培源方含藥血清對腸上皮化生標(biāo)志物的影響及其可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞株與動(dòng)物 人GES-1購于河北北納生物科技有限公司(BNCC337969)。SPF級成年雄性SD大鼠28只,體重180～220 g,購自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號:SCXK(遼)2020-0001。大鼠飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,室溫為22～25 ℃,相對濕度45%～60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(AHUCM-rats-2021012)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 脾胃培源方(白術(shù)20 g、炙黃芪18 g、石斛15 g、白芍10 g、香附10 g、劉寄奴6 g)購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中草藥房。

1.3試劑與儀器 鵝去氧膽酸購自北京索萊寶科技有限公司;CDX1、MUC2購自HUABIO公司;CDX2購自Affinity公司;白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA KIT(Human) 、白細(xì)胞介素-8(IL-8) ELISA KIT(Human)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA KIT(Human)、丙二醛(MDA) ELISA KIT(Human)、超氧化物歧化酶(SOD) ELISA KIT(Human)購自RUIXIN Biotech公司。酶標(biāo)儀(RT6100)、全自動(dòng)PCR 儀(Bio-Rad)、超微量分光光度計(jì)(南京五義科技有限公司)、電泳儀(上海天能科技有限公司)、電泳槽(上海天能科技有限公司)、轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)、ChemiDoc成像儀(Bio-Rad)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)培養(yǎng)GES-1細(xì)胞,加入胰酶消化,培養(yǎng)基重懸,使細(xì)胞密度為1×105;將細(xì)胞懸液輕輕混勻,按2×103個(gè)/孔接種在96孔板中,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,且設(shè)置空白對照組,邊緣孔用無菌PBS填充;將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜。

1.4.2脾胃培源方水煎劑的制備 將白術(shù)、炙黃芪、石斛、香附、白芍、劉寄奴6味藥煎煮2次,過濾取出藥液,將所得藥液混勻合并并濃縮成50 mL,得生藥量為1.4 g/mL,置于4 ℃冰箱保存待用。

1.4.3脾胃培源方含藥血清的制備 將大鼠隨機(jī)分為空白對照組及脾胃培源方高、中、低劑量組。每組7只。依據(jù)人和大鼠等效藥量換算方法,脾胃培源方高、中、低劑量組分別灌胃23.2 g/kg、11.6 g/kg、5.8 g/kg的脾胃培源方濃縮液,空白對照組灌胃等量生理鹽水,均2次/d,,連續(xù)灌胃7d。末次灌胃1 h后,腹主動(dòng)脈取血,離心,收集血清,放入56 ℃恒溫水浴箱30 min對血清進(jìn)行滅活后,置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1鵝去氧膽酸、脾胃培源方對GES-1細(xì)胞活性的影響 ①將GES-1接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁生長24 h后,加入不同濃度的鵝去氧膽酸(0,20,50,100,150,200 μmol/L)及不同濃度的脾胃培源方含藥血清(0,2.5%,5%,10%,20%,30%,40%)各100 μL/孔,分別處理細(xì)胞24 h、48 h、72 h后,每孔加入CCK-8試劑10 μL,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h,用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測各孔的吸光值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,取平均值。②實(shí)驗(yàn)分為5組,空白對照組加入正常血清培養(yǎng),鵝去氧膽酸組加入100 μmol/L的鵝去氧膽酸培養(yǎng),鵝去氧膽酸+5%脾胃培源方含藥血清組、鵝去氧膽酸+10%脾胃培源方含藥血清組、鵝去氧膽酸+20%脾胃培源方含藥血清組先加入100 μmol/L的鵝去氧膽酸干預(yù)48 h后,再分別加入相應(yīng)濃度的脾胃培源方含藥血清再次培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h,用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測各孔的吸光值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,取平均值。

1.5.2細(xì)胞中炎癥因子及氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物水平 將GES-1細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞生長至合適密度后分為4組,空白對照組加入正常血清培養(yǎng),20%脾胃培源方含藥血清組加入20%脾胃培源方含藥血清培養(yǎng),鵝去氧膽酸組加入100 μmol/L的鵝去氧膽酸培養(yǎng),鵝去氧膽酸+20%脾胃培源方含藥血清組先加入100μmol/L的鵝去氧膽酸干預(yù)48 h,再加入20%脾胃培源方含藥血清培養(yǎng)24 h后,收集各組細(xì)胞上清液,置于EP管中,在8 000 r/min條件下離心10 min,收集各組上清液后,根據(jù)制造商說明,使用相應(yīng)試劑盒檢測IL-6、IL-8、TNF-α、MDA、SOD水平。

1.5.3細(xì)胞中CDX1、CDX2、MUC2蛋白表達(dá)情況將GES-1細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞生長至合適密度后分為5組,空白對照組加入正常血清培養(yǎng),鵝去氧膽酸組加入100 μmol/L的鵝去氧膽酸培養(yǎng),鵝去氧膽酸+5%脾胃培源方含藥血清組、鵝去氧膽酸+10%脾胃培源方含藥血清組、鵝去氧膽酸+20%脾胃培源方含藥血清組先加入100 μmol/L的鵝去氧膽酸干預(yù)48 h,再加入不同濃度脾胃培源方含藥血清培養(yǎng)24 h后,將6孔板置于冰上,去除細(xì)胞培養(yǎng)基,使用提前預(yù)冷的無菌PBS清洗細(xì)胞2遍,每次5 min。去除PBS,加入RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞。裂解完成后,收集各組細(xì)胞樣本,置于EP管中,在4 ℃、14 000 r/min條件下離心20 min,收集上清液樣本于EP管中,每管加入適量Loading buffer,在100 ℃條件下金屬浴10 min以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將各組細(xì)胞蛋白樣本依次加入提前配置完成的SDS-PAGE中,在100 V恒壓條件下進(jìn)行電泳。電泳完成后,配置轉(zhuǎn)膜“三明治”,在350 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜25 min。轉(zhuǎn)膜完成后,將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中,常溫封閉2 h。封閉完成后,使用TBST洗膜3遍,每次5 min,再配置目的蛋白對應(yīng)I抗溶液,4 ℃孵育過夜。I抗孵育完成后,使用TBST洗膜3遍,每次5 min,再配置目的蛋白對應(yīng)種屬的II抗溶液,常溫孵育2 h。最后使用ECL顯影液,在凝膠圖像處理系統(tǒng)中對目的蛋白條帶進(jìn)行可視化分析。本實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參蛋白,使用Image J軟件對目的蛋白CDX1、CDX2、MUC2的條帶進(jìn)行定量分析。

1.5.4細(xì)胞中CDX1、CDX2、MUC2 mRNA表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)分組及培養(yǎng)同1.5.3。去除細(xì)胞培養(yǎng)基后,使用總RNA提取試劑盒,提取細(xì)胞總RNA。經(jīng)過裂解、離心、提取等工序后,獲得各組細(xì)胞RNA樣本,使用紫外分光光度計(jì)對RNA樣本進(jìn)行濃度測定。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,通過PCR儀獲得各組細(xì)胞cDNA樣本。另取提前設(shè)計(jì)完成的目的基因引物與cDNA樣本配置反應(yīng)體系,使用PCR儀,經(jīng)預(yù)變性、變性、退火、延伸過程,獲得各目的基因的Ct值,使用2-ΔΔCT方法計(jì)算各目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad prism 9統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度鵝去氧膽酸對GES-1細(xì)胞活性的影響 隨著鵝去氧膽酸處理濃度的升高及時(shí)間的延長,GES-1細(xì)胞活性逐漸下降,當(dāng)鵝去氧膽酸濃度大于150 μmol/L、處理時(shí)間大于48 h時(shí),GES-1細(xì)胞活性低于50%(見圖1)。因此,本研究選擇100 μmol/L的鵝去氧膽酸、干預(yù)48 h作為最佳干預(yù)條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度鵝去氧膽酸對人胃上皮細(xì)胞活性的影響

2.2不同濃度脾胃培源方含藥血清對GES-1細(xì)胞活性的影響 隨著脾胃培源方含藥血清處理濃度的升高及時(shí)間的延長,GES-1細(xì)胞的活性逐漸下降,當(dāng)脾胃培源方含藥血清濃度為20%、處理時(shí)間為24 h時(shí),GES-1細(xì)胞活性最接近50%(見圖2)。因此,本研究選擇濃度5%,10%,20%的脾胃培源方含藥血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度脾胃培源方含藥血清對人胃上皮細(xì)胞活性的影響

2.3不同組別GES-1細(xì)胞活性比較 鵝去氧膽酸組GES-1細(xì)胞活性與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各濃度脾胃培源方含藥血清組GES-1細(xì)胞活性均明顯低于鵝去氧膽酸組(P均<0.05),且各濃度脾胃培源方含藥血清組GES-1細(xì)胞活性呈劑量依賴性降低,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

A為空白對照組;B為鵝去氧膽酸組;C為鵝去氧膽酸+5%脾胃培源方含藥血清組;D為鵝去氧膽酸+10%脾胃培源方含藥血清組;E為鵝去氧膽酸+20%脾胃培源方含藥血清組

2.4不同組別炎癥因子與氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物水平比較 空白對照組和20%脾胃培源方含藥血清組IL-6、IL-8、TNF-α、MDA、SOD水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與空白對照組和20%脾胃培源方含藥血清組比較,鵝去氧膽酸組IL-6、IL-8、TNF-α、MDA水平均明顯升高(P均<0.05),SOD水平明顯降低(P均<0.05)。與鵝去氧膽酸組比較,鵝去氧膽酸+20%脾胃培源方含藥血清組IL-6、IL-8、TNF-α、MDA水平均明顯降低(P均<0.05),SOD水平明顯升高(P<0.05)。見圖4。

A為空白對照組;B為20%脾胃培源方含藥血清組;C為鵝去氧膽酸組;D為鵝去氧膽酸+20%脾胃培源方含藥血清組圖4 空白對照組和鵝去氧膽酸處理各組人胃上皮細(xì)胞中炎癥因子與氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物水平

2.5不同組別CDX1、CDX2、MUC2 蛋白表達(dá)情況比較鵝去氧膽酸組CDX1、CDX2、MUC2蛋白相對表達(dá)量均明顯高于空白對照組(P均<0.05);鵝去氧膽酸+10%脾胃培源方含藥血清組和鵝去氧膽酸+20%脾胃培源方含藥血清組CDX1、CDX2蛋白相對表達(dá)量和各濃度脾胃培源方含藥血清組MUC2蛋白相對表達(dá)量均明顯低于鵝去氧膽酸組(P均<0.05),且各指標(biāo)呈一定濃度依賴性降低。見圖5。

A為空白對照組;B為鵝去氧膽酸組;C為鵝去氧膽酸+5%脾胃培源方含藥血清組;D為鵝去氧膽酸+10%脾胃培源方含藥血清組;E為鵝去氧膽酸+20%脾胃培源方含藥血清組圖5 空白對照組和鵝去氧膽酸處理各組人胃上皮細(xì)胞中CDX1、CDX2、MUC2 蛋白表達(dá)情況

2.6不同組別CDX1、CDX2、MUC2 mRNA表達(dá)情況比較 鵝去氧膽酸組CDX1、CDX2、MUC2 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于空白對照組(P均<0.05);各濃度脾胃培源方含藥血清組CDX1、CDX2 mRNA相對表達(dá)量和鵝去氧膽酸+10%脾胃培源方含藥血清組、鵝去氧膽酸+20%脾胃培源方含藥血清組MUC2 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于鵝去氧膽酸組(P均<0.05),且各指標(biāo)呈一定濃度依賴性降低。見圖6。

A為空白對照組;B為鵝去氧膽酸組;C為鵝去氧膽酸+5%脾胃培源方含藥血清組;D為鵝去氧膽酸+10%脾胃培源方含藥血清組;E為鵝去氧膽酸+20%脾胃培源方含藥血清組圖6 空白對照組和鵝去氧膽酸處理各組人胃上皮細(xì)胞中CDX1、CDX2、MUC2 mRNA表達(dá)情況

3 討 論

胃黏膜腸上皮化生是由于胃黏膜長期慢性炎性損傷導(dǎo)致胃黏膜正常上皮細(xì)胞被腸型上皮細(xì)胞取代,進(jìn)而出現(xiàn)杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞及吸收上皮細(xì)胞的一種病理形態(tài)學(xué)改變[11]。在炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)的長期作用下,胃黏膜上皮持續(xù)遭到破壞,逐步向胃癌方向演變[12-13]。腸上皮化生通常無特異性臨床表現(xiàn),可通過胃鏡和病理檢查來明確診斷。

氧化應(yīng)激與炎癥密切相關(guān),參與Barrett食管、消化性潰瘍、CAG、胃癌等多種慢性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[14]。一方面,慢性炎癥是氧化應(yīng)激反應(yīng)激活的結(jié)果。氧化應(yīng)激反應(yīng)是由活性氧等氧化物質(zhì)的產(chǎn)生引起的,這些活性物質(zhì)是正常炎癥反應(yīng)的一部分,但其過度產(chǎn)生異常積累,可導(dǎo)致炎癥的進(jìn)展[15]。在機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)中,SOD與MDA是其重要指標(biāo)。MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物,過多的MDA可加劇氧化應(yīng)激帶來的損傷[16]。SOD是針對氧化應(yīng)激的首道防線,可預(yù)防細(xì)胞損傷及細(xì)胞核的裂解,從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。另一方面,慢性炎癥也會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。化學(xué)刺激、感染或免疫失衡引起的慢性炎癥也會增加活性氧的產(chǎn)生,從而加劇氧化應(yīng)激。這種持續(xù)的炎癥/氧化環(huán)境引發(fā)惡性循環(huán),進(jìn)一步損傷臨近細(xì)胞,最終導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[18]。因此,CAG在長期炎癥反應(yīng)的作用下不僅能夠誘發(fā)胃黏膜腸上皮化生及異型增生,還能夠引發(fā)胃黏膜氧化應(yīng)激反應(yīng),加重胃黏膜上皮組織損傷,加重疾病的進(jìn)程,增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,脾胃培源方干預(yù)后,IL-6、IL-8、TNF-α、MDA水平顯著降低,SOD水平顯著升高,表明脾胃培源方可抑制炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng),從而在一定程度上阻止胃黏膜腸上皮化生的進(jìn)程。

MUC2黏蛋白是一種在人體腸道中發(fā)現(xiàn)的重要分泌蛋白,在保護(hù)腸道屏障、調(diào)節(jié)微生物組穩(wěn)態(tài)和預(yù)防疾病等方面發(fā)揮著重要作用,其破壞與多種疾病和癌癥有關(guān)[19]。MUC2在正常胃黏膜中不表達(dá),而在腸化的胃黏膜組織中呈高表達(dá),是腸化生的重要標(biāo)志物[20]。CDX1是腸道分化的重要轉(zhuǎn)錄因子,正常的胃黏膜中不表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子CDX1,但在動(dòng)物和人胃腸上皮化生中可發(fā)現(xiàn)CDX1的異常表達(dá),其在人胃腸上皮化生的發(fā)展中起關(guān)鍵作用,是胃炎-化生-癌發(fā)生進(jìn)程中的一個(gè)重要標(biāo)志[21-22]。CDX2和CDX1同屬于尾型同源框基因家族成員,是腸上皮細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,與腸道上皮細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,脾胃培源方干預(yù)后,CDX1、CDX2、MUC2的表達(dá)水平顯著降低,提示脾胃培源方可抑制胃黏膜腸上皮化生。

綜上所述,脾胃培源方可通過抑制炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng),下調(diào)CDX1、CDX2、MUC2的表達(dá),從而抑制胃黏膜腸上皮化生。但胃黏膜腸上皮化生的機(jī)制較為復(fù)雜,本研究內(nèi)容有限,今后將進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)研究等,探究其具體的藥理成分及作用機(jī)制。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。