肝胃百合湯對(duì)胃潰瘍大鼠IRE1α信號(hào)通路的影響

陽(yáng)凌峰,林瑞芳,楊 穎,謝 欣,喻 斌

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208;2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410007)

胃潰瘍是發(fā)生在胃內(nèi)壁黏膜的一種缺損性疾病,甚者病變可穿透肌層,或伴隨胃出血、胃穿孔、癌變等急重并發(fā)癥,嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[1]。目前,胃潰瘍的全球發(fā)病率高達(dá)5%～10%[2],其發(fā)生的主要原因可能是機(jī)體各種防御機(jī)制與致病因素間的失衡[3],常見(jiàn)外源性致病因素有幽門(mén)螺桿菌感染、過(guò)量飲酒、長(zhǎng)期攝入非甾體類(lèi)抗炎藥物(如吲哚美辛)等,尤其是非甾體類(lèi)抗炎藥物的不合理使用使得胃潰瘍發(fā)病率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)[4]。因吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜急性損傷類(lèi)似于胃潰瘍患者的病變,故該動(dòng)物模型已經(jīng)被廣泛用于評(píng)估各種天然藥物的潛在胃腸道保護(hù)活性[5-7]。胃潰瘍的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,相關(guān)研究認(rèn)為過(guò)度或持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)會(huì)加重胃黏膜損傷,改善胃黏膜ERS可能是預(yù)防非甾體類(lèi)抗炎藥物誘導(dǎo)胃潰瘍的一種潛在方式[8]。ERS是一種新型細(xì)胞凋亡方式,肌醇需求酶1α(IRE1α)信號(hào)通路作為ERS重要的途徑之一,可能在發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用中占有重要地位[9-11]。肝胃百合湯由湖湘名老中醫(yī)夏度衡教授根據(jù)“后天脾胃難離肝”的學(xué)術(shù)思想所創(chuàng),臨床上治療胃潰瘍療效確切[12-14]。然其具體作用機(jī)制尚未明確,故本研究建立吲哚美辛誘導(dǎo)胃潰瘍大鼠模型,從IRE1α信號(hào)通路介導(dǎo)的ERS角度探討肝胃百合湯對(duì)大鼠胃潰瘍的影響及其干預(yù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF 級(jí)SD大鼠36只,9～10周齡,體重240～260 g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)濕度40%～60%,室溫25 ℃,自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)(ZYFY20230725-01)。

1.2藥品和試劑 肝胃百合湯由百合15 g、柴胡10 g、川楝子10 g、烏藥10 g、郁金10 g、丹參10 g、黃芩10 g、甘草6 g組成,湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供;吲哚美辛腸溶片,臨汾寶珠制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H14022501);奧美拉唑腸溶片,無(wú)錫阿斯利康公司(批號(hào):20170502) ;葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)抗體(貨號(hào):66574-1-Ig)、IRE1α抗體(貨號(hào):27528-1-AP)、凋亡信號(hào)激酶 1 (ASK1)抗體(貨號(hào):28201-1-AP)、β-actin抗體(貨號(hào):66009-1-Ig),美國(guó)proteintech公司;磷酸化肌醇需求酶1α(p-IRE1α)抗體(貨號(hào):ab124945)、胱天蛋白酶12(Caspase-12)抗體(貨號(hào):ab62484),英國(guó)abcam公司;山羊抗兔 IgG-HRP(貨號(hào):AWS0002)、5×蛋白上樣緩沖液(貨號(hào):AWB0055)、Tris-HCl緩沖液(貨號(hào):AWB0073)、SDS溶液(貨號(hào):AWT0047),中國(guó)Abiowell公司;顯影液(貨號(hào):BW-61)、定影液(貨號(hào):BW-62),上海佳信公司;伊紅、蘇木素、PBS(7.2～7.6)、DAPI,Wellbio公司。

1.3主要儀器 搖床(貨號(hào):TS-92,其林貝爾);TUNEL試劑盒(40306ES50,上海翊圣生物);切片機(jī)(貨號(hào):YD-315,浙江金華益迪試驗(yàn)器材);包埋機(jī)(貨號(hào):BMJ-A,常州中威電子儀器);電泳儀(貨號(hào):DYY-6C,中國(guó)北京六一);熒光顯微鏡(貨號(hào):BA410T,Motic);臺(tái)式冷凍離心機(jī)(貨號(hào):H1650R,中國(guó)湖南湘儀)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,按照隨機(jī)數(shù)字表將36只大鼠分為空白組、模型組、奧美拉唑組、肝胃百合湯組,每組9只。根據(jù)體表面積(按人體重70kg算)計(jì)算出肝胃百合湯用藥量為7.29 g/(kg·d),奧美拉唑(按成人每天劑量40 mg/d算)用藥量為3.6 mg/(kg·d),用蒸餾水配制相應(yīng)濃度溶液備用,灌胃容積為10 mL/kg。肝胃百合湯組和奧美拉唑組分別予以肝胃百合湯、奧美拉唑溶液預(yù)防性灌胃藥1周,空白組、模型組灌胃等量蒸餾水。末次預(yù)防性給藥前先禁食不禁水24 h,模型組、奧美拉唑組、肝胃百合湯組末次預(yù)防性給藥1 h后予以單次灌胃溶于5%NaHCO3溶液的吲哚美辛80 mg/kg誘導(dǎo)胃潰瘍[15],造模3 h后用10%異氟烷吸入麻醉大鼠并處死。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1胃潰瘍指數(shù) 根據(jù)Guth標(biāo)準(zhǔn)[16]對(duì)胃潰瘍情況進(jìn)行計(jì)分:無(wú)損傷記0分;損傷≤1 mm記1分;1 mm<損傷≤2 mm記2分;2 mm<損傷≤3 mm記3分;3 mm<損傷≤4 mm記4分;損傷>4 mm記5分;損傷寬度>2 mm,則胃潰瘍指數(shù)加倍。通過(guò)3人同時(shí)評(píng)估取累計(jì)得分平均值為胃潰瘍指數(shù)。

1.5.2胃黏膜病理形態(tài) 取4%多聚甲醛固定48 h后的胃組織樣本,進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋處理,切成4 μm薄片于60 ℃下烤片2 h,然后使用全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行HE染色,經(jīng)過(guò)中性樹(shù)脂封片后在普通顯微鏡下觀察拍照。

1.5.3胃組織細(xì)胞凋亡情況 取制備好的胃組織石蠟切片,按TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作方法對(duì)切片進(jìn)行染色,并于熒光顯微鏡400倍視野下采集圖片。

1.5.4胃組織中GRP78、IRE1α、p-IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):剪取0.025 g胃組織,加RIPA裂解液于冰上裂解10 min,在4 ℃下12 000 r/min(離心半徑10 cm)條件下離心15 min后,取上清液,利用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣本上樣后,依次進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜,并在TBST緩沖液的孵育槽中進(jìn)行室溫下封閉90 min。加入GRP78(1：5 000)、IRE1α(1：500)、p-IRE1α(1：200)、ASK1(1：500)、Caspase-12(0.5～2 μg/mL)兔抗鼠一抗,4 ℃孵育過(guò)夜;加入羊抗兔二抗(1：2 000),室溫孵育90 min。ECL顯色后使用Quantity One軟件分析灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且滿足方差齊性,采用單因素方差分析,反之則用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組胃組織潰瘍情況 空白組大鼠胃黏膜表面光滑,未見(jiàn)潰瘍、糜爛出血灶;模型組大鼠胃黏膜明顯潰瘍損傷,可見(jiàn)多個(gè)條索狀血帶,潰瘍指數(shù)為49.00±12.32;奧美拉唑組和肝胃百合湯組大鼠胃黏膜均見(jiàn)少量條索狀血帶,或見(jiàn)斑點(diǎn)狀、糜爛性出血,潰瘍指數(shù)分別為29.44±15.65和27.11±10.98,均明顯低于模型組(P均<0.05),肝胃百合湯組與奧美拉唑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組胃組織病理學(xué)形態(tài) 空白組大鼠胃組織黏膜層、黏膜下層、黏膜肌層結(jié)構(gòu)完好無(wú)損、層次分明,腺體排列整齊,黏膜下層未見(jiàn)明顯充血、水腫,未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠胃黏膜組織出現(xiàn)嚴(yán)重缺損,腺體結(jié)構(gòu)紊亂,胃黏膜上皮細(xì)胞脫落,大量細(xì)胞死亡和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜下層出現(xiàn)明顯水腫。與模型組比較,肝胃百合湯組和奧美拉唑組大鼠胃黏膜部分缺損,腺體排列有所改善,少量細(xì)胞死亡和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),輕度黏膜下水腫。見(jiàn)圖1。

圖1 空白組和胃潰瘍各組大鼠胃組織病理形態(tài)(HE染色,×100)

2.3各組胃組織細(xì)胞凋亡情況 正常細(xì)胞DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色,凋亡細(xì)胞呈綠色。與空白組比較,模型組胃組織綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多;與模型組比較,肝胃百合湯組和奧美拉唑組胃組織綠色熒光強(qiáng)度減弱,細(xì)胞凋亡數(shù)目有所減少。見(jiàn)圖2。

圖2 空白組和胃潰瘍各組大鼠胃組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×400)

2.4各組胃組織中GRP78、IRE1α、p-IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白表達(dá)情況 模型組大鼠胃組織中GRP78、p-IRE1α/ IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05),肝胃百合湯組和奧美拉唑組大鼠胃組織中GRP78、p-IRE1α/ IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05),肝胃百合湯組各蛋白相對(duì)表達(dá)量與奧美拉唑組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖3及表1。

圖3 空白組和胃潰瘍各組大鼠胃組織中GRP78、p-IRE1α/IRE1α、ASK1、Caspase12蛋白表達(dá)情況

表1 空白組和胃潰瘍各組大鼠胃組織中GRP78、p-IRE1α/IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

胃潰瘍是常見(jiàn)的胃腸道疾病之一,以上腹部周期性、節(jié)律性疼痛為典型癥狀,胃黏膜表現(xiàn)為糜爛,甚至潰瘍出血。臨床主要以質(zhì)子泵抑制劑、胃黏膜保護(hù)劑等治療或預(yù)防,但長(zhǎng)期服用常伴不良反應(yīng)[17]。因此,尋找防治胃潰瘍的新策略十分必要。中醫(yī)藥在防治胃潰瘍方面具有多途徑、多靶點(diǎn)等優(yōu)勢(shì),為防治胃潰瘍提供了一定的思路。中醫(yī)將胃潰瘍歸屬于“胃瘍”“胃脘痛”等范疇,認(rèn)為其病位在胃,與肝、脾二臟密切相關(guān),貫穿著“肝胃不和”“肝胃郁熱”之病機(jī)變化[18]。肝胃百合湯源自《夏度衡醫(yī)案》,方取微涼之百合、郁金,性平之柴胡,微溫之烏藥疏肝理氣和胃,且百合能顧護(hù)胃陰;因久病入絡(luò),血瘀氣滯,易郁久化熱,故取丹參、郁金活血化瘀,川楝子疏肝泄肝,黃芩清解胃熱;甘草調(diào)和諸藥。全方配伍嚴(yán)謹(jǐn),不膩不燥,合而為之,共奏疏肝泄熱和胃、活血化瘀止痛之功效。相關(guān)研究表明,肝胃百合湯可促進(jìn)胃潰瘍患者血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、表皮生長(zhǎng)因子、三葉生長(zhǎng)因子表達(dá),從而加速患者潰瘍創(chuàng)面修復(fù)[19-21]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工折疊的一種重要細(xì)胞器,當(dāng)機(jī)體受到鈣失衡、氧化還原反應(yīng)等各種因素刺激導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能受損時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白過(guò)度堆積,擾亂細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而發(fā)生ERS[22]。適度的ERS會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng),恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力,從而維持細(xì)胞存活,而高強(qiáng)度的ERS會(huì)觸發(fā)一系列凋亡信號(hào)引起細(xì)胞凋亡[23]。Kim等[24]研究表明,過(guò)度的ERS引起胃黏膜細(xì)胞凋亡可能是胃黏膜損傷的重要機(jī)制,抑制ERS可能是防治胃潰瘍的有效靶點(diǎn)。GRP78是ERS的標(biāo)志性蛋白,也是ERS發(fā)生的監(jiān)測(cè)者。生理?xiàng)l件下,GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的IRE1α蛋白感受器偶聯(lián)而使IRE1α處于失活狀態(tài);ERS狀態(tài)下,GRP78與IRE1α解離并使IRE1α自身磷酸化而激活,p-IRE1α通過(guò)激活下游生存與凋亡因子而調(diào)控細(xì)胞存活[25]。Caspase-12作為ERS的特異性蛋白,其活化是凋亡命令執(zhí)行的關(guān)鍵環(huán)節(jié),GRP78/IRE1α/ Caspase-12是Caspase-12蛋白酶活化的重要途徑,活化的Caspase-12進(jìn)一步激活Caspase家族蛋白而執(zhí)行細(xì)胞凋亡命令[26]。研究表明,胃黏膜損傷時(shí)GRP78、Caspase-12蛋白處于高表達(dá)狀態(tài),通過(guò)抑制Caspase-12活化可減輕胃黏膜損傷[27-28]。ASK1是一種應(yīng)激蛋白,其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定狀態(tài)下與IRE1α形成穩(wěn)定復(fù)合物[29],而在應(yīng)激狀態(tài)下,ASK1通過(guò)激活下游c-Jun氨基末端激酶,從而調(diào)控各種凋亡基因表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在胃潰瘍發(fā)展轉(zhuǎn)歸中扮演重要角色[30]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠吲哚美辛造模后胃黏膜組織嚴(yán)重缺損,病變部位出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn),大量胃組織細(xì)胞凋亡,胃組織中GRP78、p-IRE1α/ IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白表達(dá)明顯上調(diào);肝胃百合湯組及奧美拉唑組胃黏膜損傷較輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及凋亡細(xì)胞較少,胃組織中GRP78、p-IRE1α/ IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。表明肝胃百合湯可抑制胃黏膜細(xì)胞凋亡,其可能通過(guò)抑制IRE1α信號(hào)通路介導(dǎo)的ERS,進(jìn)而對(duì)吲哚美辛誘導(dǎo)的胃潰瘍大鼠胃黏膜發(fā)揮一定保護(hù)作用。本課題組將進(jìn)一步建立高質(zhì)量病癥結(jié)合動(dòng)物模型,探討肝胃百合湯靶向ERS治療胃潰瘍的具體機(jī)制。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。