消瘀止痛合劑聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞對股骨頸骨折兔骨愈合的影響及機制

韋志豪,袁振中,胡耶芳,陳煒堅,鐘 健,郭詩雯,唐剛健

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530200;2. 桂林市中醫(yī)醫(yī)院,廣西 桂林 541002)

股骨頸骨折是一種常見的創(chuàng)傷性損傷,老年股骨頸骨折患者2年內(nèi)病死率約為37.1%[1]。 股骨頸骨折的治療方案分為保守治療和手術(shù)治療,隨著手術(shù)技術(shù)的進步,多學(xué)科配合,股骨頸骨折更加傾向于手術(shù)治療,但有部分患者術(shù)后骨折愈合時間較長,且伴隨著各種并發(fā)癥發(fā)生。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是存在于機體結(jié)締組織和間質(zhì)中具有多向分化潛能的一種干細胞,具有增殖分化能力極強的特點,目前研究證實BMSCs治療能促進骨折修復(fù),治療骨不連等[2-4]。近幾年來研究表明,一些中藥具有誘導(dǎo)成骨分化、增加骨密度、促進骨折愈合的作用[5-6]。消瘀止痛合劑為桂林市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑,是在桃紅四物湯基礎(chǔ)上加血竭、姜黃、木香、郁金、蘇木等多味中藥而成,具有活血化瘀、消腫止痛作用,臨床應(yīng)用效果較好。本實驗通過建立兔股骨頸骨折模型,觀察消瘀止痛合劑聯(lián)合BMSCs對骨折愈合的影響,同時通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)探討了其可能作用機制,旨在為股骨頸骨折的臨床治療提供新思路。

1 實驗材料和方法

1.1實驗動物 新西蘭大白兔36只,3月齡,體重1.5～2.0 kg,由湖南太平生物科技有限公司提供,動物許可證號:SCXK(湘)2020-0005。單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗,實驗通過桂林醫(yī)學(xué)院實驗中心動物保護倫理委員會批準(GLMC-IACUC-2022008),于桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心及動物實驗中心完成。

1.2細胞及藥物 大白兔BMSCs購于武漢普諾賽生命科技有限公司(CP-Rb007);消瘀止痛合劑由桂林市中醫(yī)醫(yī)院提供(由桃仁、紅花、赤芍、當歸、血竭、生地、川芎、延胡索、木香、郁金、蘇木、姜黃、澤蘭、木通、甘草組成,桂藥制字Z20190032000)。

1.3主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA、青霉素/鏈霉素雙抗、胎牛血清(美國Gibco公司),PBS緩沖液(北京索萊寶科技有限公司),3%戊巴比妥鈉(桂林醫(yī)學(xué)院實驗室提供),兔堿性磷酸酶(ALP)ELISA檢測試劑盒、兔骨鈣素(OCN) ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司),蘇木素伊紅染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),TRIzol試劑(美國Invitrogen公司),SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒(美國Roche Diagnostics公司),PrimeScript RT reagent kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司),RNA Nano 6000檢測試劑盒(美國安捷倫技術(shù)公司),NEB Next?UltraTMRNA文庫制備試劑盒(美國NEB公司)。Thermo細胞培養(yǎng)箱(美國Electron公司),AV-100型超凈臺(西班牙Telstar公司),RT-6100酶標分析儀(美國Rayto公司),光學(xué)顯微鏡(美國萊卡公司),7900HT實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司),K5500分光光度計(北京凱奧科技發(fā)展有限公司),擺鋸,克氏針,黏附載玻片,顯微鏡載玻片。

1.4實驗方法

1.4.1細胞培養(yǎng) 待兔BMSCs生長至80%～90%時進行傳代,將細胞從培養(yǎng)箱中取出,置于超凈臺中,舍棄培養(yǎng)基,使用PBS進行洗滌,然后加入經(jīng)37 ℃預(yù)熱的胰酶消化。當顯微鏡下觀察細胞回縮為圓形時,加入3 mL完全培養(yǎng)基終止消化,將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,1 000 r/min離心3 min,棄上清,加入完全培養(yǎng)基制備懸液,然后接種培養(yǎng)瓶,放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至第三代細胞待用。

1.4.2股骨頸骨折模型制備及分組干預(yù) 根據(jù)文獻[7],采用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)耳緣靜脈注射麻醉白兔,固定于手術(shù)臺上,左后肢髖關(guān)節(jié)手術(shù)區(qū)備皮。取髖后外側(cè)手術(shù)入路,無菌條件下在髖關(guān)節(jié)后外側(cè)做3～4 cm的切口,鈍性分離肌肉,暴露關(guān)節(jié)囊,切開關(guān)節(jié)囊露出股骨頸,自大轉(zhuǎn)子向股骨頭打1枚無菌克氏針(直徑2 mm),X射線透視見克氏針位置良好,退出部分克氏針,用擺鋸造成股骨頸骨折,在股骨頭上鉆一個孔,將骨折復(fù)位,用縫線經(jīng)孔固定,最后繼續(xù)打入克氏針,再次行X射線透視見骨折復(fù)位及克氏針位置良好后分層縫合切口。術(shù)后分籠飼養(yǎng),自由活動,肌肉注射青霉素8萬IU/d,連用3 d。以生命體征穩(wěn)定、正常進食、無感染、內(nèi)固定無明顯移位及脫落為造模成功。將造模成功后的36只白兔隨機分為空白組、BMSCs組、消瘀止痛合劑組、消瘀止痛合劑+BMSCs組,每組9只。BMSCs組、消瘀止痛合劑+BMSCs組于造模后第1天在骨折端周圍注射1 mL BMSCs懸液(BMSCs 5×106個/mL),其他組局部注射等劑量DMEM[8]。于術(shù)后第2天開始,消瘀止痛合劑組及消瘀止痛合劑+BMSCs組給予消瘀止痛合劑4.2 mL/kg灌胃,空白組、BMSCs組給予等量生理鹽水灌胃,均1次/d,連續(xù)干預(yù)4周。

1.5檢測指標及方法

1.5.1血清ALP及OCN水平 干預(yù)結(jié)束后耳緣靜脈抽取靜脈血4 mL,離心處理后吸取上層透明的血清,按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作,借助酶標儀檢測光密度值,獲取標準曲線及標準方程,計算出樣本血清ALP、OCN水平。

1.5.2造模側(cè)股骨組織變化及病理學(xué)形態(tài) 取血后采用空氣栓塞法處死白兔,取造模側(cè)股骨頸骨組織,觀察骨缺損區(qū)骨質(zhì)變化、表面形態(tài)及骨痂形成等情況。然后將其放入10%福爾馬林溶液中固定24～48 h,取出后進行常規(guī)脫鈣、沖洗、梯度脫水、透明、浸蠟、包埋,制作成5～6 μm厚切片;再將切片進行常規(guī)脫蠟、梯度脫水,HE染色,晾干后用中性樹膠封片,光鏡下觀察骨組織病理形態(tài)。

1.5.3骨組織中ALP、OCN mRNA表達情況 利用TRIzol試劑提取骨組織中總mRNA。實時熒光定量PCR,Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄,生成得到cDNA,使用SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒反應(yīng)體系行Real-time PCR。利用相對定量2-ΔΔCT法檢測標本中目的基因相對內(nèi)參基因的表達量。實時熒光定量PCR引物由武漢金凱瑞生物工程有限公司設(shè)計及合成,見表1。

表1 引物序列

1.6轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析空白組和消瘀止痛合劑+BMSCs組差異基因

1.6.1轉(zhuǎn)錄組測序 提取空白組3只和消瘀止痛合劑+BMSCs組3只白兔的骨痂總RNA,使用K5500分光光度計評估RNA純度,并使用生物分析儀2100系統(tǒng)的RNA Nano 6000檢測試劑盒測量RNA完整性和濃度。每個樣品中總共2 μg的RNA被用作RNA樣品制備的輸入材料。使用NEB Next?UltraTMRNA文庫制備試劑盒生成Illumina?測序文庫,并進行文庫分析,使用Illumina HiSeq X Ten測序平臺完成RNA-seq,并獲得配對的末端序列讀數(shù)。使用FastQC工具v0.11.9(https://www.biologistics.babraham.ac.uk/)對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制。使用默認設(shè)置的HISAT v2.1.0將干凈的RNA-seq讀數(shù)與參考基因比對,然后使用Samtools v1.9處理對齊的文件,并使用Feature Counts v1.6.3量化與基因組編碼區(qū)對齊的讀取次數(shù)。最后,DESeq2 v1.22.2與R/Bioconductor軟件包一起使用,以P<0.05、∣log2FC∣>2為標準,讀取計數(shù)并鑒定差異表達基因。利用微生信(http//www.bioinformatics.com.cn)繪制火山圖。

1.6.2生物信息學(xué)分析 為了分析差異表達基因的功能作用,使用clusterProfiler, pathview等R語言軟件包進行GO和KEGG信號通路富集分析。運用STRING11.5數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)得到蛋白相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù),條件限定為研究物種為兔,相互作用閾值設(shè)為0.4,然后導(dǎo)入CytoScape3.9.0,利用內(nèi)置“Network analyzer”功能分析靶點的拓撲參數(shù),并以連接度為條件篩選關(guān)鍵基因,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1各組血清骨代謝標志物水平比較 消瘀止痛合劑+BMSCs組血清ALP、OCN水平均明顯高于其他3組(P均<0.05),消瘀止痛合劑組血清ALP、OCN水平均明顯高于空白組(P均<0.05),空白組、消瘀止痛合劑組與BMSCs組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組股骨頸骨折白兔血清ALP、OCN水平比較

2.2各組造模側(cè)股骨組織變化及病理學(xué)形態(tài) 空白組骨折線模糊不清,骨折斷端周圍有骨痂形成伴隨的輕微凸起;HE染色顯示骨小梁纖細,間隙較寬。BMSCs組骨折端有骨痂生成,可見凸起;HE染色顯示骨小梁排列紊亂,密集程度低。消瘀止痛合劑組及消瘀止痛合劑+BMSCs組骨折端及周圍有大量骨痂生成,可見明顯凸起,伴肥大增生;HE染色見骨小梁寬度、骨小梁密集程度及鈣化程度均優(yōu)于其余2組,其中消瘀止痛合劑+BMSCs組更優(yōu)。見圖1及見圖2。

圖1 各組股骨頸骨折白兔術(shù)后4周骨痂形態(tài)

圖2 各組股骨頸骨折白兔術(shù)后4周造模側(cè)股骨組織HE染色病理形態(tài)(×100)

2.3各組骨組織中ALP、OCN mRNA表達情況比較 消瘀止痛合劑+BMSCs組ALP、OCN mRNA相對表達量均明顯高于空白組及BMSCs組(P均<0.05),消瘀止痛合劑組ALP、OCN mRNA相對表達量均明顯高于空白組(P均<0.05),其余組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

圖3 各組股骨頸骨折白兔骨組織中ALP、OCN mRNA相對表達量

2.4空白組和消瘀止痛合劑+BMSCs組差異表達基因 與空白組比較,聯(lián)合組差異表達基因共589個,其中390個基因表達上調(diào),199個基因表達下調(diào)。見圖4。

圖4 空白組和消瘀止痛合劑+BMSCs組股骨頸骨折白兔差異表達基因火山圖

2.5空白組和消瘀止痛合劑+BMSCs組差異表達基因GO富集分析 GO富集生物過程分析得到5 168個, BP主要與B細胞受體信號通路(B cell receptor signaling pathway)、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(intracellular signal transduction)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、化學(xué)突觸傳遞(chemical synaptic transmission)、碳水化合物代謝過程(carbohydrate metabolic process)等有關(guān);CC主要包括膜筏(membrane raft)、質(zhì)膜的外側(cè)(external side of plasma membrane)、基底外側(cè)質(zhì)膜(basolateral plasma membrane)、細胞外間隙(extracellular space)、核內(nèi)體膜(endosome membrane)等;MF主要包括水解酶活性(hydrolase activity)、水解O-糖基化合物h(ydrolyzing O-glycosyl compounds)、鈣離子結(jié)合(calcium ion binding)、碳水化合物結(jié)合(carbohydrate binding)、肝素結(jié)合(heparin binding)、膠原蛋白結(jié)合(collagen binding)等。見圖5。

圖5 空白組和消瘀止痛合劑+BMSCs組股骨頸骨折白兔差異表達基因GO富集分析(前10個)

2.6空白組和消瘀止痛合劑+BMSCs組差異表達基因KEGG信號通路富集分析 KEGG通路分析共得到292條通路,其中消瘀止痛合劑聯(lián)合BMSCs治療股骨頸骨折主要涉及通路有鈣離子信號通路(Calcium signaling pathway)、Ras信號通路(Ras signaling pathway)、破骨細胞分化(Osteoclast differentiation)、趨化因子信號通路(Chemokine signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll- like receptor signaling pathway)。見圖6。

圖6 空白組和消瘀止痛合劑+BMSCs組股骨頸骨折白兔差異表達基因KEGG信號通路富集分析(前20個)

2.7空白組和消瘀止痛合劑+BMSCs組差異表達基因PPI分析 將589個差異表達基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫進行分析。經(jīng)Cytoscape軟件分析得知,連接度排名前列的蛋白有可能與調(diào)控Toll 樣受體 4 (TLR4)、TYRO 蛋白酪氨酸激酶結(jié)合蛋白 (TYROBP)、集落刺激因子-1受體(CSF1R)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)等,這些靶點可能是消瘀止痛合劑聯(lián)合BMSCs治療股骨頸骨折的關(guān)鍵作用靶點。見圖7。

圖7 空白組和消瘀止痛合劑+BMSCs組股骨頸骨折白兔差異表達基因PPI分析

3 討 論

隨著社會的發(fā)展、人們社會活動多元化及老齡化社會的到來,股骨頸骨折發(fā)病率呈上升趨勢。由于股骨頸特殊的解剖結(jié)構(gòu)和脆弱的血液循環(huán)給股骨頸骨折治療帶來極大的挑戰(zhàn)。在骨折骨重建過程中有多種細胞參與,如成骨細胞、BMSCs、破骨細胞等,其中BMSCs發(fā)揮著重要作用。BMSCs可以維護骨結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和平衡骨代謝,在一定條件下經(jīng)誘導(dǎo)后可向軟骨細胞和成骨細胞轉(zhuǎn)化,通過促進成骨和血管生成,從而促進骨愈合[9-11]。屈宗斌等[12]報道,自體BMSCs移植治療陳舊性脛骨中下1/3骨折能有效促進骨愈合。

消瘀止痛合劑是在中醫(yī)骨傷“瘀去、新生、骨合”及骨折三期用藥原則等理論指導(dǎo)下,由桃紅四物湯加減而成。方中桃仁、紅花、赤芍活血化瘀,當歸養(yǎng)血補血,生地滋陰補血,血竭、蘇木活血消腫止痛,川芎、延胡索、郁金、姜黃活血行氣、通經(jīng)止痛,木香行氣止痛,澤蘭、木通消腫止痛,甘草調(diào)和諸藥。全方具有活血化瘀、養(yǎng)血補血行氣、消腫止痛的功效。本實驗結(jié)果顯示,消瘀止痛合劑組及消瘀止痛合劑+BMSCs組骨折端及周圍有大量骨痂生成,且消瘀止痛合劑+BMSCs組骨小梁寬度、密集程度及鈣化程度均優(yōu)于其他組。說明消瘀止痛合劑聯(lián)合BMSCs促進骨折愈合作用優(yōu)于單獨使用消瘀止痛合劑及BMSCs。

骨折愈合的過程受局部骨生長因子調(diào)控[13]。OCN來源于成熟的成骨細胞,是骨基質(zhì)鈣化的必需物質(zhì),可反映骨生成和骨代謝情況,血清OCN水平與骨內(nèi)OCN含量成正相關(guān)[14]。ALP在骨骼、肝、脾、腎上腺等處合成[15],骨骼中的ALP主要由成骨細胞合成和分泌,當骨骼損傷時,機體成骨細胞活動增加,使成骨細胞分泌的ALP滲入血液中,血清ALP水平增高,骨形成能力增強[16]。本實驗結(jié)果顯示,消瘀止痛合劑+BMSCs組血清中ALP、OCN水平和骨組織中ALP、OCN mRNA表達量均高于其他組,說明消瘀止痛合劑與BMSCs聯(lián)合使用可促進ALP、OCN表達,加快骨痂形成,促進骨折愈合。

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析顯示,消瘀止痛合劑聯(lián)合BMSCs治療股骨頸骨折主要涉及鈣離子信號通路、Ras信號通路、破骨細胞分化、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路等,可能與調(diào)控TLR4、TYROBP、CSF1R、MMP-9等基因有關(guān)。炎癥是骨折愈合的重要階段之一,在骨折早期炎癥細胞的增殖和遷移可以促進骨折愈合,但炎癥也是骨折延遲愈合或不愈合的重要原因。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),TLR4可以介導(dǎo)骨骼中的炎癥反應(yīng),敲除TLR4基因可以激活Wnt/β-catenin信號通路,減少破骨細胞數(shù)量,抑制炎癥反應(yīng),從而促進骨折愈合[17-18]。TYROBP又名DAP12,其表達缺陷可以導(dǎo)致骨折愈合延遲,可能與DAP12調(diào)控骨折早期炎癥反應(yīng)和促進骨重建作用相關(guān)[19]。CSF1R對破骨細胞的增殖和分化有一定促進作用[20]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族的一員,在破骨細胞中高度表達,可以促進破骨細胞生長基因表達[21]。以上研究結(jié)果提示,消瘀止痛合劑聯(lián)合BMSCs通過調(diào)控破骨細胞分化及炎癥相關(guān)信號通路來促進骨愈合。

綜上所述,消瘀止痛合劑聯(lián)合BMSCs可能通過調(diào)控破骨細胞分化及炎癥相關(guān)信號通路及基因表達來促進股骨頸骨折愈合,但骨折愈合機制復(fù)雜,消瘀止痛合劑與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用的相關(guān)作用機制、作用通路仍需進一步探討驗證。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。