血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤血管新生及VEGFA、VEGFR2表達(dá)的影響

王一錚,高 冬,王 鶴,蘇孫益,秦崇濤,王 虹,林 凡

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福建 福州 350122;2. 福建省立醫(yī)院,福建 福州 350001)

血管新生是指在原已存在的毛細(xì)血管網(wǎng)基礎(chǔ)上,通過內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和出芽形成新的毛細(xì)血管的過程。血管新生不僅是機(jī)體正常發(fā)育、生殖和組織修復(fù)等生理過程的基礎(chǔ),而且還能影響多種病理過程。然而在疾病治療中,血管新生是把雙刃劍,單純的促進(jìn)或抑制血管新生都不是理想的選擇。例如在腫瘤治療中,抑制血管新生可阻斷腫瘤組織的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),從而抑制其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[1];但過度抑制血管新生可能導(dǎo)致藥物與免疫細(xì)胞無法向腫瘤組織輸送,從而影響藥效,且有利于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[2-3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,活血化瘀不僅包含“疏其氣血,令其條達(dá)”的“祛瘀”層面, 還包含“復(fù)其真氣、化舊生新”的“生新”層面,因此活血化瘀中藥在理論上具有促血管新生作用[4-5]。但臨床中活血化瘀中藥也可用于腫瘤治療[6],如活血化瘀經(jīng)典方劑——血府逐瘀湯聯(lián)合化療應(yīng)用于肺癌治療,不僅有助于改善患者生活質(zhì)量,還可緩解和控制病灶的發(fā)展[7-10]。如果活血化瘀藥物在腫瘤環(huán)境中只是單純地促進(jìn)血管新生,則與腫瘤治療中的抑制血管新生策略相違背。因此,活血化瘀藥在腫瘤環(huán)境中與化療藥物聯(lián)用時(shí)調(diào)控血管新生的行為和機(jī)制還需進(jìn)一步闡明。本研究通過構(gòu)建Lewis肺癌荷瘤小鼠模型,探討血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤生長(zhǎng)、腫瘤血管新生的影響及可能作用機(jī)制,為活血化瘀藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物及細(xì)胞 SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠75只,5～6周齡,體重(20±2)g,購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2019-0008,飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物福利倫理審查(批準(zhǔn)文號(hào):FJTCM IACUC2021038)。小鼠Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2藥物 血府逐瘀膠囊,天津宏仁堂藥業(yè)有限公司,批號(hào):BA03310,規(guī)格:0.4 g/粒;順鉑注射液,江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào):601200904,規(guī)格:5 mg/mL。

1.3試劑與儀器 兔源CD34一抗(批號(hào):GR3240236-24)、小鼠源血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)一抗(批號(hào):GR3200812-4)、兔源血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)一抗(批號(hào):GR3220838-3),美國(guó)Abcam公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(批號(hào):090322221028)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(批號(hào):031722221010),上海碧云天生物技術(shù)有限公司;小鼠VEGFA ELISA試劑盒(批號(hào):202105)、小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)ELISA試劑盒(批號(hào):202208),酶免公司;DAB顯色試劑(批號(hào): G1211),武漢賽維爾生物科技有限公司;快速轉(zhuǎn)膜液(批號(hào):20201021)、快速封閉液(批號(hào):20210820),新賽美生物科技有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(批號(hào):092922220930),上海碧云天生物技術(shù)有限公司。IX70型倒置相差顯微鏡及攝像裝置(日本Olympus公司);Eclipse Ci正置熒光顯微鏡(日本尼康公司);Tecan Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);RM2016型病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司);Power PacTMBasic型電泳儀、Universal Hood III型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)取15只小鼠作為正常組,不予任何藥物處理,其余小鼠建立Lewis肺癌荷瘤模型。造模方法:采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)LLC細(xì)胞。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用生理鹽水調(diào)節(jié)其密度為1×107個(gè)/mL,每只小鼠右側(cè)腋下皮下注射0.1 mL細(xì)胞懸液。接種7 d后,造模小鼠右側(cè)腋下可觸及米粒大小瘤塊即為造模成功。將造模成功的60只荷瘤小鼠耳標(biāo)編號(hào)錄入Excel 2019表格,生成一組隨機(jī)數(shù),將隨機(jī)數(shù)按照升序排列后依次分成血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組、血府逐瘀膠囊組、順鉑組和模型組,每組15只。按照血府逐瘀膠囊藥品說明書,成年人劑量為每次6粒(2.4 g),2次/d,因此血府逐瘀膠囊組小鼠每次灌胃0.36 g/kg血府逐瘀膠囊制備的溶液[劑量=2.4 g(成人一次用量)÷60 kg(成人體重)×9(小鼠與人每公斤體重劑量折算系數(shù)),加入生理鹽水加熱溶解配制],模型組給予生理鹽水灌胃,灌胃體積均為0.1 mL/10 g體重,2次/d;順鉑組給予2 mg/kg的順鉑腹腔注射,2 d 1次;血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組灌胃給予血府逐瘀膠囊(藥物配制、給藥方法、劑量同血府逐瘀膠囊組)和腹腔注射順鉑(方法及劑量同順鉑組)。各組均連續(xù)干預(yù)15 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1存活率和瘤重、抑瘤率 末次干預(yù)后24 h,統(tǒng)計(jì)各組小鼠存活率,存活率=給藥第15天小鼠只數(shù)÷給藥第0天小鼠只數(shù)×100%;稱量小鼠體重,摘眼球采血后脫頸椎處死,于冰上將皮下移植瘤完全剝離,稱量記錄瘤重,計(jì)算抑瘤率,抑瘤率=(模型組平均瘤重-用藥組平均瘤重)÷模型組平均瘤重×100%。

1.5.2腫瘤微血管數(shù)量 采用免疫組化法檢測(cè):將腫瘤組織放入4%多聚甲醛中固定,乙醇脫水,石蠟包埋,切成厚4 μm切片。常規(guī)方法脫蠟、水化,抗原修復(fù),阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,3% BSA封閉30 min,滴加CD34一抗(1：4 000),4 ℃孵育過夜,滴加二抗,室溫孵育50 min,DAB室溫下顯色。蘇木精復(fù)染,脫水、透明、中性樹膠封片。CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì),CD34標(biāo)記陽性微血管可見棕黃色管腔樣結(jié)構(gòu)。先在100倍光鏡視野下選取3個(gè)微血管最豐富的區(qū)域,每個(gè)區(qū)域分別隨機(jī)選取3個(gè)400倍視野,計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的微血管數(shù)量,取其平均值。計(jì)數(shù)時(shí),無論是否形成管腔,任何與周圍微血管、腫瘤細(xì)胞或周圍結(jié)締組織分界清晰的CD34陽性內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均計(jì)為一個(gè)微血管,腫瘤內(nèi)壞死區(qū)的微血管不納入計(jì)數(shù)。

1.5.3血漿VEGFA、bFGF水平 眼球采血,EDTA抗凝,4 ℃下3 000 r/min離心5 min,吸取上層血漿于EP管中,采用ELISA法檢測(cè)各組小鼠血漿中VEGFA、bFGF水平。

1.5.4移植瘤組織中VEGFA、VEGFR2蛋白表達(dá)情況 采用蛋白印跡法檢測(cè):提取移植瘤組織總蛋白,BCA法檢測(cè)提取蛋白濃度,聚丙烯酰胺凝膠電泳后快速濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,快速封閉液封閉10 min,VEGFA一抗(1：1 000)、VEGFR2一抗(1：1 000)、β-actin一抗(1：5 000)孵育,4 ℃過夜。洗膜后以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1：5 000)孵育1 h后洗膜,ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) Universal Hood Ⅲ曝光顯像,Image Lab 3.0軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠存活率、瘤重、抑瘤率比較 順鉑組和血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組小鼠均存活,血府逐瘀膠囊組和模型組各有9只(60%)存活,順鉑組和血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組小鼠存活率明顯高于模型組和血府逐瘀膠囊組(P均<0.05)。血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組瘤重明顯低于其他3組(P均<0.05),抑瘤率明顯高于順鉑組和血府逐瘀膠囊組(P均<0.05);順鉑組瘤重明顯低于模型組和血府逐瘀膠囊組(P均<0.05),抑瘤率明顯高于血府逐瘀膠囊組(P<0.05);血府逐瘀膠囊組瘤重與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 Lewis肺癌移植瘤各組小鼠瘤重、抑瘤率比較

2.2各組小鼠腫瘤組織微血管數(shù)量比較 模型組、血府逐瘀膠囊組、順鉑組、血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組腫瘤組織的微血管數(shù)量分別為(41.00±8.18)個(gè)、(36.50±8.19)個(gè)、(22.25±5.78)個(gè)、(30.00±6.65)個(gè), 順鉑組微血管數(shù)量明顯少于其他3組(P均<0.05), 血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組明顯少于模型組和血府逐瘀膠囊組(P均<0.05),血府逐瘀膠囊組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 Lewis肺癌移植瘤各組小鼠腫瘤組織微血管形態(tài)(免疫組化染色,×400,箭頭所指為微血管)

2.3各組小鼠血漿VEGFA、bFGF水平比較 模型組血漿VEGFA、bFGF水平均明顯高于正常組(P均<0.05);順鉑組血漿VEGFA、bFGF水平和血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組bFGF水平均明顯低于模型組(P<0.05),血府逐瘀膠囊組血漿VEGFA、bFGF水平和血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組VEGFA水平與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),各藥物組間血漿VEGFA、bFGF水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 Lewis肺癌移植瘤各組小鼠血漿VEGFA、bFGF水平比較

2.4各組小鼠腫瘤組織中VEGFA和VEGFR2蛋白表達(dá)情況比較 順鉑組腫瘤組織中VEGFA蛋白相對(duì)表達(dá)量和血府逐瘀膠囊組、順鉑組、血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05),血府逐瘀膠囊組和血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組VEGFA 蛋白相對(duì)表達(dá)量與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);各藥物組間VEGFA和VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2及表3。

圖2 Lewis肺癌移植瘤各組小鼠移植瘤組織中VEGFA、VEGFR2蛋白電泳圖

表3 Lewis肺癌移植瘤各組小鼠移植瘤組織中VEGFA、VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,血瘀是腫瘤形成發(fā)展的主要病機(jī)之一。清代醫(yī)家王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中提及“氣無形不能結(jié)塊,結(jié)塊者,必有形之血也”,指岀結(jié)塊必是有形之血,即血瘀。由于邪毒結(jié)聚、氣血不暢、經(jīng)絡(luò)阻塞等因素,氣滯血瘀也是肺癌的常見證型[11]?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》記載:“血實(shí)宜決之,氣虛宜掣之。”《血證論》曰:“凡治血者,必先以祛瘀為要。”因此,理論上認(rèn)為活血化瘀是中醫(yī)藥治療腫瘤的重要治則之一[4]。活血化瘀代表方血府逐瘀湯主治胸中血瘀證,該方主要由桃紅四物湯和四逆散組成,其中桃紅四物湯主要起活血養(yǎng)血作用,而四逆散主要起疏肝理氣的功效,再配以桔梗、牛膝一升一降使氣機(jī)通暢。臨床研究數(shù)據(jù)顯示,血府逐瘀湯聯(lián)合順鉑等化療藥物治療氣滯血瘀型肺癌,不僅能夠通過中藥活血祛瘀、疏通經(jīng)絡(luò)等功效改善患者血液高凝狀態(tài),預(yù)防靜脈血栓栓塞形成,改善生活質(zhì)量,而且比單獨(dú)化療更能有效地緩解和控制病灶的發(fā)展[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)血府逐瘀膠囊無論是單獨(dú)用藥還是與順鉑聯(lián)合用藥,均有一定的抑瘤效果,聯(lián)合用藥比單純使用血府逐瘀膠囊或順鉑具有更顯著的療效。以上現(xiàn)象進(jìn)一步證明了以血府逐瘀湯為代表的活血化瘀方可在特定的時(shí)機(jī)用于肺癌的治療。但研究結(jié)果也顯示,血府逐瘀膠囊組小鼠的存活率和抑瘤率都明顯低于順鉑組和血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組。因此,血府逐瘀湯是否可單獨(dú)用于腫瘤治療還需再進(jìn)一步進(jìn)行研究和探討。

腫瘤血管與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)體積大于2 mm3時(shí),必須依靠血管新生汲取更多營(yíng)養(yǎng)維持生長(zhǎng)[1]。因此,抗腫瘤血管新生成為腫瘤治療的重要策略。腫瘤血管靶向藥主要包括大分子單抗藥物(貝伐單抗、帕尼單抗等)和小分子靶向抑制劑(舒尼替尼、安洛替尼等)[12]。順鉑等化療藥物可通過破壞細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)、影響核酸合成或轉(zhuǎn)錄等方式,抑制腫瘤細(xì)胞增殖。由于化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性選擇作用不強(qiáng),常常也會(huì)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞等其他組織細(xì)胞的增殖,從而抑制腫瘤血管新生[13]。這些抗血管生成藥物在腫瘤治療中雖取得一定療效,然而單純的抗血管新生作用可能導(dǎo)致腫瘤組織出現(xiàn)更明顯的乏氧和低pH值,影響放化療效果,且腫瘤血管的一味減少也將使化療藥物更難到達(dá)腫瘤細(xì)胞[2-3]。目前,血府逐瘀湯等活血化瘀方調(diào)控血管新生的研究主要在缺血性疾病模型中進(jìn)行,大量數(shù)據(jù)表明此類方劑在缺血性疾病中表現(xiàn)出顯著的促血管新生作用[14-15]。但也有證據(jù)表明,活血化瘀方在特定的環(huán)境中能夠抑制血管新生[16-18]。本研究結(jié)果顯示,血府逐瘀膠囊單獨(dú)用藥對(duì)小鼠腫瘤組織的微血管數(shù)無顯著影響,聯(lián)合用藥時(shí)與模型組相比微血管數(shù)有所減少,但聯(lián)合用藥與單獨(dú)使用順鉑相比,微血管數(shù)有所增加。上述結(jié)果表明血府逐瘀湯調(diào)控血管新生的效應(yīng)與周圍環(huán)境相關(guān),雖然其在缺血性疾病模型中可促進(jìn)血管新生,但在腫瘤環(huán)境中,血府逐瘀湯并不一定會(huì)促進(jìn)血管新生。本研究也表明,順鉑可抑制腫瘤血管新生,而血府逐瘀膠囊與順鉑聯(lián)合用藥則減弱了順鉑的抑制血管新生作用,可能正是通過這種對(duì)血管新生的適度抑制作用,使得血府逐瘀膠囊增強(qiáng)了化療的療效。

腫瘤血管新生過程受促血管生長(zhǎng)因子和抑血管生長(zhǎng)因子共同調(diào)控。目前已知的促血管生長(zhǎng)因子主要包括VEGF、bFGF等。VEGFA是VEGF家族中發(fā)現(xiàn)最早、作用最強(qiáng)的因子,VEGFA可選擇性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,形成新的血管;另外,VEGFA也可提高血管通透性,使纖維蛋白原等大分子蛋白外滲,并沉著于細(xì)胞外的基質(zhì),形成纖維凝膠,促進(jìn)毛細(xì)血管網(wǎng)的形成。VEGFA主要通過與其受體VEGFR2結(jié)合發(fā)揮作用,VEGFR2主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性,是影響血管新生過程的重要因素[19]。bFGF可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和趨化,刺激內(nèi)皮細(xì)胞膠原酶及纖維蛋白酶的活化,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管芽,促進(jìn)腫瘤血管生成。bFGF和VEGF在血管新生過程中具有協(xié)同作用,VEGF可刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌bFGF,VEGF也需要bFGF的存在才能發(fā)揮其促血管生成作用[20]。本研究結(jié)果顯示,僅順鉑組小鼠血漿VEGFA水平明顯低于模型組,在腫瘤組織中VEGFA蛋白的表達(dá)也有同樣的趨勢(shì),表明血府逐瘀膠囊在Lewis肺癌荷瘤小鼠模型中并不是通過影響VEGFA的表達(dá)量來發(fā)揮作用的。本研究結(jié)果還顯示,血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑組和順鉑組血漿bFGF水平和腫瘤組織中VEGFR2蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組,可能正是缺乏bFGF的協(xié)同作用以及VEGFR2的受體作用,使得VEGFA無法正常發(fā)揮其促血管新生功能,聯(lián)合用藥和順鉑單獨(dú)用藥才表現(xiàn)出顯著的抑制血管新生效應(yīng)。其中順鉑能同時(shí)下調(diào)VEGFA、bFGF和VEGFR2的表達(dá),因此能表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制血管新生效應(yīng);聯(lián)合用藥不能下調(diào)VEGFA表達(dá),故抑制血管新生效果不如順鉑。但可能正是由于這種適度的抑制血管新生作用,更有利于化療藥物輸送至腫瘤組織,從而增強(qiáng)化療的療效。

綜上所述,血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠具有顯著的抑瘤作用,但是聯(lián)合用藥的抑制腫瘤血管新生效果不如單獨(dú)使用順鉑顯著,單獨(dú)使用血府逐瘀膠囊的抑瘤和抑制腫瘤血管新生的效果均不顯著。在Lewis肺癌環(huán)境中,血府逐瘀膠囊聯(lián)合順鉑治療可能通過抑制腫瘤組織中VEGFR2的表達(dá),在一定程度上抑制腫瘤血管新生,但其對(duì)VEGFA的表達(dá)無顯著影響。血府逐瘀湯作為活血化瘀方劑,在Lewis肺癌移植瘤小鼠模型中表現(xiàn)出與缺血疾病模型不同的調(diào)控血管新生作用,且在不同的模型環(huán)境中,該方對(duì)VEGF信號(hào)通路的調(diào)控也不相同。這些環(huán)境如何影響血府逐瘀湯對(duì)VEGF信號(hào)通路和血管新生的調(diào)控?其中關(guān)鍵的靶點(diǎn)和開關(guān)是什么?這些問題都還需進(jìn)一步研究和探討。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。