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    MEFV基因的新發(fā)突變導(dǎo)致周期性發(fā)熱

    2023-12-22 00:45:32超,喻
    關(guān)鍵詞:雜合外顯子基因突變

    袁 超,喻 昕

    (肇慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 科研實(shí)驗(yàn)中心,廣東 肇慶 526020)

    周期性發(fā)熱-阿弗他口炎-咽炎-淋巴結(jié)炎(PFAPA)綜合征是兒童期最常見(jiàn)的自身炎癥性疾病之一,典型的臨床癥狀為高燒(>38 ℃),且無(wú)上呼吸道感染的情況,發(fā)熱時(shí)至少伴有口腔炎、咽炎、淋巴結(jié)炎3種癥狀中的一種。發(fā)熱通常持續(xù)2~8 d,每3~8周發(fā)作一次,周期性發(fā)熱至少持續(xù)6個(gè)月以上?;颊咴趦纱伟l(fā)病間期無(wú)癥狀,且生長(zhǎng)發(fā)育正常,其它可能出現(xiàn)的癥狀包括腹痛、關(guān)節(jié)痛等。該疾病常見(jiàn)于5歲以下的兒童,但也有成年人患病的報(bào)道。

    PFAPA綜合征以散發(fā)為主,主要呈常染色體顯性遺傳。雖然PFAPA綜合征具體的發(fā)病機(jī)制尚未明確,但其它以發(fā)熱為主要表型的自身炎癥性疾病,包括家族性地中海熱、甲羥戊酸激酶缺乏癥、腫瘤壞死因子受體相關(guān)周期性綜合征、Cryopyrin相關(guān)周期性綜合征,均表現(xiàn)出單基因突變致病。因此,遺傳因素也參與PFAPA綜合征的發(fā)病,與該疾病相關(guān)的致病基因可能包括MEFV、NLPR3、TNFRSF1A、NOD2、MVK。

    本研究收集了1例診斷為PFAPA綜合征的患者,遺傳分析發(fā)現(xiàn)了MEFV基因的一個(gè)新的突變(c.334G>A,p.E112Q);患者攜帶該位點(diǎn)的雜合突變,而患者父母均不攜帶該突變,該突變?yōu)橐粋€(gè)新發(fā)突變。本研究擴(kuò)展了PFAPA綜合征的突變譜。

    1 材料和方法

    1.1 血液基因組提取

    獲取知情同意書(shū)后,使用EDTA抗凝管采集患者及家屬外周血。提取基因組DNA時(shí),將血液轉(zhuǎn)移至離心管并加入紅細(xì)胞裂解液(Solarbio,中國(guó)),充分裂解紅細(xì)胞后離心收集白細(xì)胞,并加入白細(xì)胞裂解液(百奧萊博,中國(guó)),60 ℃水浴2 h,以3∶1體積比加入乙酸鉀溶液(Solarbio,中國(guó))并顛倒混勻。離心收集上清液,使用異丙醇(國(guó)藥集團(tuán),中國(guó))沉淀DNA,并使用75%乙醇清洗DNA 3次。室溫放置10 min,DNA充分干燥后,加入Buffer TE(Cwbio,中國(guó)),并于50 ℃干浴1 h,振蕩混勻后于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 全外顯子組測(cè)序

    患者的基因組DNA使用SureSelect試劑盒(Agilent Technologies,美國(guó))進(jìn)行文庫(kù)制備以及外顯子捕獲;使用HiSeq2000測(cè)序儀(Illumina,美國(guó))進(jìn)行全外顯子組測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)濾去除接頭讀長(zhǎng)、低質(zhì)量讀長(zhǎng)、同義突變以及SNP后,使用NCBI CCDS、RefSeq、Ensembl和Encode數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)剩余突變進(jìn)行注釋。

    1.3 Sanger測(cè)序

    使用Sanger測(cè)序?qū)θ怙@子組測(cè)序測(cè)得的突變進(jìn)行驗(yàn)證。PCR反應(yīng)在含有20 ng人類(lèi)基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液(50 μL)中進(jìn)行。使用正向引物(5'-CGCGCCCGGCCCGTTGTTTT-3')和反向引物(5'-CGCCCCCCGCCAGCCCCT-3')對(duì)MEFV基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物使用Cwbio凝膠提取試劑盒(Cwbio,中國(guó))進(jìn)行純化,使用BigDye Terminator Cycle Sequencing試劑盒(Applied Biosystems,美國(guó))進(jìn)行單鏈擴(kuò)增,使用ABI 3500遺傳分析儀(Applied Biosystems,美國(guó))進(jìn)行Sanger測(cè)序。

    2 結(jié)果

    2.1 病例描述

    患者為23月齡的男孩,在11月齡后開(kāi)始出現(xiàn)周期性發(fā)熱,每次發(fā)熱持續(xù)4~5 d,每次間隔3~5周。每次發(fā)熱時(shí),紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)指標(biāo)升高,并伴有咽炎、扁桃體腫大化膿、淋巴結(jié)腫大,無(wú)其它臨床癥狀,發(fā)熱間期恢復(fù)正常?;颊吒改笩o(wú)異常,否認(rèn)有家族史?;颊弑辉\斷為周期性發(fā)熱-阿弗他口炎-咽炎-淋巴結(jié)炎(PFAPA)綜合征。

    2.2 遺傳分析

    患者遺傳家系圖譜如圖1所示。對(duì)患者的全外顯子組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)PFAPA綜合征可能的致病基因中僅MEFV基因發(fā)生了突變(c.334G>A, p.E112Q)。該突變位于MEFV基因的2號(hào)外顯子,且尚未見(jiàn)報(bào)道,是MEFV基因的一個(gè)新的突變。Sanger測(cè)序結(jié)果(如圖2所示)表明,患者攜帶該位點(diǎn)的雜合突變,而患者父母均不攜帶該突變,說(shuō)明c.334G>A是一個(gè)新發(fā)突變。使用HomoloGene數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/)對(duì)突變的保守性進(jìn)行分析,不同物種MEFV蛋白的氨基酸序列如圖3所示。由圖3可知,p.E112位點(diǎn)在不同物種中高度保守,提示該位點(diǎn)可能對(duì)MEFV編碼的蛋白功能具有重要影響。

    圖1 患者遺傳家系圖譜

    圖2 Sanger測(cè)序結(jié)果

    圖3 不同物種MEFV蛋白的氨基酸序列

    3 討論

    自身炎癥性疾病(Autoinflammatory Diseases,AIDs)是由于固有免疫系統(tǒng)缺陷或失調(diào)引起的炎癥反應(yīng)疾病。根據(jù)最新的免疫出生錯(cuò)誤分類(lèi),AIDs可分為I型干擾素病、炎癥小體病、非炎癥小體相關(guān)疾病3大類(lèi)。AIDs種類(lèi)多,臨床診斷需要參照對(duì)應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。然而,由于目前對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)尚不夠充分,導(dǎo)致了同一疾病在不同的標(biāo)準(zhǔn)中的診斷指標(biāo)不盡相同,因此,對(duì)于高度懷疑的病例,需要通過(guò)基因檢測(cè)進(jìn)一步進(jìn)行確診。家族性地中海熱(Familial Mediterranean Fever,FMF)和PFAPA綜合征均是以發(fā)熱為主要表型的炎癥小體病。MEFV基因突變既可能導(dǎo)致FMF,也可能導(dǎo)致PFAPA綜合征。然而,FMF的主要表型是反復(fù)發(fā)熱以及漿膜炎,發(fā)熱持續(xù)1~3 d,通常伴有腹痛。本研究發(fā)現(xiàn)的病例發(fā)熱持續(xù)時(shí)間為4~5 d,不伴有漿膜炎,但每次發(fā)熱伴有咽炎、扁桃體腫大化膿、淋巴結(jié)腫大,符合PFAPA綜合征的臨床特征,而不符合FMF的臨床特征,因此被診斷為PFAPA綜合征。

    MEFV基因編碼Pyrin蛋白。Pyrin蛋白是一種炎癥小體蛋白,是先天免疫的感受器,主要定位在粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞,感知各種細(xì)菌毒素對(duì)宿主細(xì)胞Rho GTPases的修飾和失活,在抗細(xì)菌天然免疫中發(fā)揮重要作用。病原體可以通過(guò)調(diào)節(jié)Rho GTPase的活性來(lái)抑制宿主的免疫反應(yīng)。Pyrin蛋白特異性地感知RhoA小G蛋白的活性變化。在正常的生理狀態(tài)下,RhoA與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PKN1和PKN2結(jié)合,激活的RhoA會(huì)通過(guò)PKN介導(dǎo)的磷酸化來(lái)抑制Pyrin蛋白的活性。病原體感染會(huì)下調(diào)RhoA活性,并導(dǎo)致Pyrin蛋白活性升高;而MEFV基因的致病突變?cè)跊](méi)有病原體感染的情況下,會(huì)導(dǎo)致Pyrin蛋白活性升高,介導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子釋放,并導(dǎo)致自身炎癥性疾病。

    MEFV基因突變多見(jiàn)于FMF患者,然而,越來(lái)越多的報(bào)道表明,PFAPA綜合征的患者也攜帶MEFV基因的突變。Cazeneuve等[1]對(duì)6名猶太血統(tǒng)的PFAPA綜合征患者進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)1名患者攜帶M694V突變;Padeh等[2]對(duì)28名阿拉伯和猶太血統(tǒng)的PFAPA綜合征患者進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)6名患者攜帶M694V雜合突變。然而,這些突變?cè)趯?duì)應(yīng)遺傳背景中的正常人中的突變頻率也較高。因此,這些報(bào)道的研究者認(rèn)為這些突變可能和PFAPA綜合征無(wú)關(guān)。但是,也有研究表明,PFAPA患者攜帶的這些MEFV基因突變的頻率遠(yuǎn)高于正常人群中的基因突變頻率。在健康的土耳其人中,M694V、E148Q、V726A、M680I、M694I的突變頻率分別為3%、12%、2%、5%、0%。Gül?in等[3]對(duì)157名土耳其PFAPA患者的MEFV基因的這5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序,在46名患者中發(fā)現(xiàn)了雜合突變,19名攜帶M694V突變,16名攜帶E148Q突變,7名攜帶V726A突變,3名攜帶M680I突變,1名攜帶K695R突變;沒(méi)有患者攜帶純合突變。Efrat等[4]對(duì)57名以色列PFAPA患者的MEFV基因的這5個(gè)位點(diǎn)也進(jìn)行了測(cè)序,發(fā)現(xiàn)16名患者攜帶雜合突變,包括9名攜帶M694V突變,5名攜帶V726A突變,2名攜帶E148Q突變。Seyed等[5]對(duì)44名伊朗PFAPA綜合征患者進(jìn)行遺傳分析,發(fā)現(xiàn)16名患者攜帶MEFV基因突變,包括13名患者攜帶E148Q的雜合突變,2名患者攜帶P369S/R480Q的復(fù)合雜合突變,1名患者攜帶R761H雜合突變。這些結(jié)果表明,MEFV基因的突變不僅僅和遺傳背景有關(guān),很可能也參與了PFAPA綜合征的發(fā)病。

    其他人種中的MEFV基因的突變也可以導(dǎo)致PFAPA綜合征。Taniuchi等[6]對(duì)20名日本PFAPA綜合征患者進(jìn)行分析,13名患者攜帶MEFV基因雜合突變,包括11名患者攜帶E148Q的雜合突變或包含該位點(diǎn)的復(fù)合雜合突變,1名患者攜帶R202Q的雜合突變,1名患者攜帶P115R的突變;E148Q的突變頻率(44%)顯著高于健康人(13%)。1例成年發(fā)作的PFAPA綜合征患者也攜帶MEFV基因的E148Q雜合突變[7]。余婷婷等[8]對(duì)9名中國(guó)的PFAPA綜合征患者進(jìn)行遺傳分析,發(fā)現(xiàn)4名患者均攜帶MEFV基因的E148Q雜合突變。和不攜帶MEFV基因突變的患者相比,攜帶MEFV基因突變的患者發(fā)熱持續(xù)時(shí)間更短,口腔潰瘍的頻率也更低[6]。本研究發(fā)現(xiàn)的PFAPA綜合征患者攜帶MEFV基因E112Q雜合突變。該突變?cè)诓煌巳褐械耐蛔冾l率均小于0.01,并且該位點(diǎn)在進(jìn)化中高度保守。因此,患者的表型可能是由于該位點(diǎn)發(fā)生了突變,影響了Pyrin蛋白功能所導(dǎo)致。

    總之,本研究發(fā)現(xiàn)了MEFV基因的一個(gè)新發(fā)突變(c.334G>A,p.E112Q),擴(kuò)展了PFAPA綜合征的突變譜,進(jìn)一步明確了MEFV基因的突變會(huì)導(dǎo)致PFAPA綜合征,增強(qiáng)了對(duì)PFAPA綜合征的認(rèn)識(shí),有助于該疾病在臨床上的確診。

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